CN108220273B

CN108220273B - 一种抗菌肽混合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN108220273B
Application number: CN201810146214.8A
Authority: CN
Inventors: 姚云昕
Original assignee: Zhejiang Etam Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Zhejiang Etam Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-01-29
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108220273A

Abstract

本发明公开了一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。本发明利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解，其酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较鸡蛋溶菌酶的抑菌活性提高了40％，其抗菌活性显著提升，扩大了鸡蛋溶菌酶的应用范围；本发明提供的制备工艺具有简单、快速、高效的特点，适合工业化生产。

Description

一种抗菌肽混合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用。

背景技术

随着细菌对抗生素耐药性和抗生素的残留问题日益严重，研究和开发新型抗菌药物已经成为世界性的研究课题，大量研究表明，中草药提取物、微生物制剂、酶制剂、益生元、抗菌肽、酸化剂等具有抑菌作用。其中，溶菌酶来自动物体内，因为其同源性和高效性而备受人们亲睐。

溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

迄今为止，生产上应用最多的是鸡蛋清溶菌酶(hen egg white lsozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的3.4％-3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个氨基酸，分子量约为14,300Da，富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸，可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早已得到广泛地应用。

在大自然有许多种类的生物能制造具有抗菌能力的肽作为先天性免疫对抗外来病原菌的第一道防线。目前在昆虫、哺乳动物、植物中均有发现抗菌肽。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的碱性多肽物质，可以快速查杀靶标，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视。由于抗菌肽为天然产物，迅速成为潜在的治疗药物。抗菌肽的治疗范围为：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。

抗菌肽分子量比溶菌酶分子量小，更具开发成药物的潜力。溶菌酶本身作为蛋白质，可以进一步被酶解为小分子多肽，如何通过酶解获得具有抗菌活性的小分子多肽是本领域技术人员需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于从鸡蛋溶菌酶中获取具有抗菌活性的小分子多肽，进而提高溶菌酶的抗菌效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。

本发明研究表明，相较于中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶，通过碱性蛋白酶酶解获得的多肽的抗菌活性显著提高。

所述碱性蛋白酶购自江苏锐阳生物科技有限公司，酶活性20万U/g，分子量分布如图2所示。该酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。

作为优选，碱性蛋白酶相对鸡蛋溶菌酶的添加量为0.06-1g/g。先将鸡蛋溶菌酶以质量百分比为1-5％的浓度溶于水中，调节pH后，加入质量百分比0.3-5％的碱性蛋白酶。酶解体系以水为反应介质，避免其他物质的掺杂，提高食品安全性。

更为优选，碱性蛋白酶相对鸡蛋溶菌酶的添加量为0.5g/g。

作为优选，酶解体系的pH值为9.0-11.0。更为优选，酶解体系的pH值为9.0。

作为优选，所述酶解的温度为40-70℃。酶解时间为1-3h。更为优选，酶解温度为60℃，酶解时间为3h。

酶解结束后在80-100℃条件下灭酶5-20min，酶解液经超滤浓缩，得到粗提液。

作为优选，利用超滤膜截留分子量≥500Da的酶解产物，得到粗提物。所述超滤的压力为0.1-0.7MPa。

作为优选，采用离子交换层析进行分离纯化，包括以下步骤：

(1)取DEAE-sepharose F.F离子交换剂装入层析柱中，平衡；

(2)加入所述粗提物，再以0.1-0.5mol/L氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集得到若干管洗脱产物，分别进行抑菌活性检测，合并抑菌活性大于鸡蛋溶菌酶抑菌活性的洗脱产物。

步骤(1)中，利用pH9.0的水进行柱平衡，所述pH9.0的水由NaOH调节纯水的pH值至9.0制得。

步骤(2)中，依次以浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，每个浓度的洗脱体积为1-2倍柱体积，洗脱速度为1mL/min。

所述的抑菌活性大于鸡蛋溶菌酶抑菌活性是指洗脱产物与鸡蛋溶菌酶在质量浓度相同的前提下，进行金黄色葡萄球菌的抑菌效果评价。

所述制备方法还包括冷冻干燥等后处理步骤。

本发明还提供了由上述方法制备得到的抗菌肽混合物，包括：氨基酸序列如SEQID NO.1所示的多肽Ⅰ、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽Ⅱ、氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的多肽Ⅲ、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽Ⅳ、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的多肽Ⅴ、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的多肽Ⅵ。

本发明还提供了所述的抗菌肽混合物在制备抗金黄色葡萄球菌或大肠杆菌药物中的应用。研究证明，相较于鸡蛋溶菌酶，所述的抗菌肽混合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性提高了40％以上。

本发明的另一个目的是提供一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

该抗菌肽是上述抗菌肽混合物中含量较多的一个组分，研究证明，在相同作用浓度下，该抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较上述抗菌肽混合物提高了33％以上。

本发明还提供了所述的抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶的酶解，得到具有抗菌效果的抗菌肽产品，其抗菌效果较原溶菌酶的抗菌效果有增强，扩大了鸡蛋溶菌酶的应用范围。

(2)本发明提供的制备工艺具有简单、快速、高效的特点，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明鸡蛋溶菌酶的激光基质解析质谱图。

图2为本发明采用的碱性蛋白酶的激光基质解析质谱图。

图3为本发明抗菌肽混合物的制备流程图。

图4为实施例2中抗菌肽混合物抑制金黄色葡萄球菌的效果图，其中1为对照，2为抗菌肽混合物，3为稀释10倍抗菌肽抑菌效果图。

图5为实施例2中制备的抗菌肽混合物的激光基质解析质谱图。

图6为实施例3中化工合成的多肽Ⅴ抑制抑制金黄色葡萄球菌的效果图，其中(a)为合成的多肽Ⅴ，(b)为溶菌酶。

图7为实施例4中抗菌肽混合物抑制大肠杆菌的效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中采用的鸡蛋溶菌酶购自浙江艾格生物科技股份有限公司，其激光基质解析质谱图如图1所示。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶购自江苏锐阳生物科技有限公司。其中碱性蛋白酶的激光基质解析质谱图如图2所示。

实施例1

1.将鸡蛋溶菌酶1g溶于99g水中，浓度配为1％(质量比)，调节pH值后，加入0.5g不同的蛋白酶，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶，于40℃酶解1h，之后100℃煮沸灭酶5min，对不同的酶解溶液进行浓缩，得到20mL酶解多肽溶液，分别用牛津杯法进行金黄色葡萄球菌的抑菌效果评价，结果如表1所示。其中对照组为原溶菌酶的抑菌效果，以100％计。

其中，碱性蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值9.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

中性蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值7.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

酸性蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值3.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

木瓜蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值7.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

菠萝蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值6.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

风味蛋白酶酶解条件：0.5g加入1％溶菌酶溶液，pH值7.0，充分搅拌溶解后，于40℃酶解1h。

表1鸡蛋溶菌酶酶解后的抗菌效果

酶种类	抑菌圈直径比例
		对照	100
碱性蛋白酶	140
		中性蛋白酶	100
酸性蛋白酶	110
		木瓜蛋白酶	100
菠萝蛋白酶	110
		风味蛋白酶	105

由表1可知，碱性蛋白酶酶解后抗菌肽的抗菌效果最佳。

实施例2

1、取鸡蛋溶菌酶用蒸馏水溶解，配成浓度5％的溶液100mL，调节pH值至9.0，加入0.3g碱性蛋白酶，充分搅拌溶解后，于60℃酶解3h，酶解后于100℃加热5min。

2、灭酶后将酶解液进行超滤浓缩，具体步骤为：酶解液加入截留分子量500Da的超滤装置中，启动超滤过程，超滤浓缩的操作压力为0.1-0.7MPa，得到30mL浓缩液。

3、离子交换树脂进行洗脱，具体步骤为：

(1)取DEAE-sepharose F.F离子交换剂介质约20mL，装入柱子中，连接入蛋白层析纯化仪后，以pH 9.0纯净水平衡30min后；

(2)吸取1mL浓缩液加入到加入蛋白纯化仪进样口，待洗脱；洗脱液为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/L的氯化钠溶液，洗脱速度为1mL/min。

(3)依次以0.1-0.5mol/L氯化钠溶液各20mL进行洗脱，每2毫升进行收集，共收集50管洗脱产物。

(4)以第6、11、16、21、26、31、36、41、46、50管分别用牛津杯法进行金黄色葡萄球菌的抑菌效果评价，对照组为浓度1.0mg/mL的鸡蛋溶菌酶溶液。结果如表2所示。

(5)收集第16-46管的洗脱产物，合并后进行冷冻干燥，得到抗菌肽混合物，产率为57％。

表2

管数	抑菌圈直径比例
		对照	100
6	N
		11	N
16	110
		21	120
26	125
		31	130
36	130
		41	125
46	115
		50	N

注：N为无效

取上述的酶解产物用牛津杯法进行金黄色葡萄球菌的抑菌效果评价，将抗菌肽混合物溶于0.05mol/L pH9.0的Tris-HCl缓冲液中，浓度为1.0mg/mL，取100μL加入牛津杯中，37℃、培养48h。以浓度为1.0mg/mL的原溶菌酶作为对照，结果如图4所示，对照组抑菌圈直径为8mm，抗菌肽混合物的抑菌圈直径为11.5mm，将抗菌肽混合物浓度稀释至0.1mg/mL，抑菌圈直径为8.5mm。

实施例3

1、采用LC-MS对上述肽段混合物进行鉴定。酶解后的抗菌肽图谱如图5所示，可以看出溶菌酶被酶解为小分子多肽。酶解产物中包含多个小分子多肽，包括：

多肽Ⅰ：Asp-Ser-Leu-Leu-Ala-Gly，分子量664.6Da；

多肽Ⅱ：Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Ala-Lys，分子量840.8Da；

多肽Ⅲ：Thr-Lys-Cys-Arg-Asp-Arg-Tyr-Ala，分子量960.0Da；

多肽Ⅳ：Glu-Ala-Tyr-Leu-Arg-Gly-Cys-Arg-Leu，分子量1254.3Da；

多肽Ⅴ：Lys-Gly-Arg-Leu-Met-Lys-Arg-His-Gly-Leu-Arg，分子量1382.7Da；

多肽Ⅵ：Arg-Tyr-Ala-Val-Tyr-Ala-Asp-Met-Gly-Asp-Gly-Lys，分子量1514.9Da。

2、采用化工合成上述多肽Ⅴ，配制成浓度为1.0mg/mL溶液，用牛津杯法进行金黄色葡萄球菌的抑菌效果评价，以浓度为1.0mg/mL的上述的抗菌肽混合物作为对照。

结果如图6所示，其中图6(a)中三个抑菌圈为多肽Ⅴ抑菌效果图，抑菌圈直径均为16mm。图6(b)中三个抑菌圈为抗菌肽混合物，抑菌圈直径12mm。

实施例4

取鸡蛋溶菌酶用蒸馏水溶解，配成浓度1％的溶液100mL，调节pH值至9.0。加入0.5g碱性蛋白酶，充分搅拌溶解后，于70℃酶解1h，酶解后于80℃加热20min。

灭酶后将酶解液进行超滤浓缩，具体步骤为：酶解液加入截留分子量500Da的超滤装置中，启动超滤过程，超滤浓缩的操作压力为0.1-0.7MPa，得到30mL浓缩液。

离子交换树脂进行洗脱，具体步骤为：吸取1mL浓缩液加入到DEAE-Sepharose F.F离子交换介质中，分别以0.1-0.5mol/L氯化钠溶液各20mL洗脱，每2毫升进行收集，收集第20-45管的洗脱产物，合并后进行冷冻干燥，得到抗菌肽混合物，产率为56％。

测试抗菌肽对大肠杆菌进行抗菌效果分析，结果如图7所示，图中三个抑菌圈均为抗菌肽混合物的抑菌效果图，抑菌直径平均为11mm。所得抗菌肽具有良好的抗菌效果。

实施例5

针对以上实验结果，开展规模化鸡蛋溶菌酶的抗菌肽生产，在酶解工艺优化的基础上，采用多步骤的膜分离技术和大型离子交换柱层析的方法，可以实现该类抗菌肽的工业化生产。具体步骤如下：

(1)称量工业化制备溶菌酶产品，以5％的浓度溶解于去离子水中，调节pH值至9.0，加入0.3％-5％的碱性蛋白酶，于40-70℃。酶解时间为1-3h后，通入蒸汽至沸腾灭酶。

(2)采用500Da的超滤膜进行超滤浓缩，截留分子量≥500Da的酶解产物，并以1000Da、1500Da、2000Da的超滤膜分别进行膜法分离，得到不同分子量分布的多肽混合溶液。

(3)采用工业化离子层析装置对上步骤中不同分子量的多肽进行分离纯化，以0.2-0.5mol/L的氯化钠缓冲溶液进行洗脱，收集具有抗菌活性的多肽后，合并，并进行进一步超滤浓缩，检测抗菌活性。

(4)将上步骤得到的浓缩多肽溶液进行冷冻干燥，可以得到目标抗菌肽产品。

序列表

<110> 浙江艾格生物科技股份有限公司

<120> 一种抗菌肽混合物及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 1

Asp Ser Leu Ala Gly

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 2

Ala Ser Val Asp Phe Ala Lys

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 3

Thr Lys Cys Arg Asp Arg Tyr Ala

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 4

Glu Ala Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Leu

1 5

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 5

Lys Gly Arg Leu Met Lys Arg His Gly Leu Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 溶菌酶(lysozyme)

<400> 6

Arg Tyr Ala Val Tyr Ala Asp Met Gly Asp Gly Lys

1 5 10

Claims

1.一种抗菌肽混合物的制备方法，其特征在于，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物；

所述碱性蛋白酶为由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，碱性蛋白酶相对鸡蛋溶菌酶的添加量为0.06-1g/g；

酶解体系的pH值为9.0-11.0，酶解的温度为40-70℃，酶解结束后，利用超滤膜截留分子量≥500Da的酶解产物，得到粗提物；

采用离子交换层析进行分离纯化，包括以下步骤：

(1)取DEAE-sepharose F.F离子交换剂装入层析柱中，平衡；

2.由权利要求1所述制备方法制备得到的抗菌肽混合物，其特征在于，包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽Ⅰ、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽Ⅱ、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽Ⅲ、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的多肽Ⅳ、氨基酸序列如SEQID NO.5所示的多肽Ⅴ、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的多肽Ⅵ。

3.如权利要求2所述的抗菌肽混合物在制备抗金黄色葡萄球菌或大肠杆菌药物中的应用。

4.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.如权利要求4所述的抗菌肽在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。