CN104974994A

CN104974994A - 一种用于n-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用

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Publication number: CN104974994A
Application number: CN201410134277.3A
Authority: CN
Inventors: 陈力; 孙桂芹; 策力木格
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN104974994B

Abstract

本发明属于糖生物学研究领域，具体涉及一种新型N-糖苷酶，该新型N-糖苷酶命名为二型PNGase F，PNGaseF-II。本发明的N-糖苷酶能够将不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N-糖蛋白上的糖链完整切除，并且它能够切除α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的糖链，而已有的N-糖苷酶F（PNGase F）对α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白没有酶切活性。本发明的酶对N-糖蛋白有较为广泛的底物和有较高的实际应用价值。本发明的新型N-糖苷酶还可以用于N-糖链结构分析、糖链的功能分析，为糖生物学以及生物医药的研究提供一种新的工具酶。

Description

一种用于N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用

技术领域

本发明属于糖生物学领域，涉及病原生物学、分子生物学、生物化学，具体涉及新型糖苷酶、其应用和使用方法。

背景技术

1.糖基化

糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用(1)。50%以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病(2)。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化(3)。

根据蛋白质与糖链连接方式的不同，糖基化可以大致分为四种类型：N-连接糖基化、O-连接糖基化、C-甘露糖糖基化和糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidly inositol,GPI）锚定连接。O-连接糖基化是指寡糖链与Ser、Thr、羟基赖氨酸或羟脯氨酸的羟基相连(4)，例如如人血纤维蛋白溶酶原、人免疫球蛋白IgA等。C-甘露糖糖基化是指甘露糖基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环2号位C上(5)，例如胶原。糖基磷脂酰肌醇锚定连接，GPI锚的一般结构主要是由乙醇胺、糖核心和肌醇连接而成，肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，乙醇胺则与蛋白质的羧基端相连，糖没有直接和蛋白质连接而是通过乙醇胺磷酸盐桥接于核心聚糖(6)，例如细胞表面受体、膜蛋白。N-连接糖基化是寡糖链（GlcNAC的β-羟基）与Asn的酰胺基氨基形成N-连接糖蛋白(5)，例如人免疫球蛋白、转铁蛋白等。本章重点阐述N-连接糖基化。

N-连接糖基化是研究最多的一种蛋白质的糖基化形式，Asn-X-Ser/Thr结构的(X-脯氨酸外的任意一种氨基酸)Asn酰胺基氨基与寡糖链(GlcNAC的β-羟基)N-连接糖蛋白。在动物细胞中，与天冬酰胺连接的糖，几乎都是N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，而且连接方式总是β构型(7)。N-连接糖有共同的特点是有五糖核心(2个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖)。与DNA和蛋白质相比，糖蛋白糖链的结构更加多样，根据它们的外层链(outer chain)结构的不同，可分为：高甘露糖型(high mannose)、杂合型(hybrid type)与复合型(complex type)。三者的区别在于，高甘露糖型只含有多个α-连接的甘露糖残基，而复杂型含有以岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和唾液糖(SA)为组分的糖链残基，杂合型则兼有两种特点。在复杂型和杂合型糖链中，根据核心岩藻糖连接方式不同，还分为α-1,3连接核心岩藻糖和α-1,6连接核心岩藻糖，结构如图8所示。

2.去糖基化酶

近年来，糖生物学的研究日益受到生物学家的关注，蛋白质的糖基化修饰和糖蛋白的去糖基化是研究糖蛋白中糖链结构和功能的重要手段。目前阶段去糖基化的手段主要有酶法、化学法，其中酶法被认为是比较理想的方法，该法能保持蛋白质的完整性，并且适宜于许多糖蛋白。根据切除糖链位点，去糖基化酶分为三类：外切型糖苷酶、内切型糖苷酶和N-糖苷酶(N-糖酰胺酶)。

外切型糖苷酶（Exo-glycosidase）是研究最早的一类糖生物学研究的工具酶，能从糖链的外端切除糖链释放单个糖，如流感病毒表面的神经氨酸酶（NA）、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等。

内切型糖苷酶（Endo-glycosidase）都是从糖链内部专一性切开某个键，因此在糖链结构分析以及结构与功能关系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶，例如常用的Endo F、Endo H。

本申请的发明人拟提供提供一种新型的N-糖苷酶，尤其是具有将N-糖链从蛋白质上完整切除的酶活功能的酶。

与本发明相关的参考文献:

1.Varki,A.(1993)Biological roles of oligosaccharides:all of the theories are correct.Glycobiology.3,97-130

2.Krasnewich,D.(2014)Human glycosylation disorders.Cancer Biomark.14,3-16

3.Wacker,C.,Berger,C.N.,Girard,P.,and Meier,R.(2011)Glycosylation profiles of therapeutic antibody pharmaceuticals.Eur.J.Pharm.Biopharm.79,503-507

4.Carraway,K.L.,and Hull,S.R.(1989)O-glycosylation pathway for mucin-type glycoproteins.Bioessays.10,117-121

5.Ploegh,H.,and Neefjes,J.J.(1990)Protein glycosylation.Curr.Opin.Cell Biol.2,1125-1130

6.Ikezawa,H.(2002)Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchored proteins.Biol.Pharm.Bull.25,409-417

7.Marth,J.D.,and Grewal,P.K.(2008)Mammalian glycosylation in immunity.Nat.Rev.Immunol.8,874-887

8.Jana Filitcheva.(2010)PNGase:A diverse family of enzyme related by function rather than catalytic mechanism.p17-18.

9.Takahashi,N.(1977)Demonstration of a new amidase acting on glycopeptides.Biochem Biophys Res Commun.76,1194-1201

10.Plummer,T.J.,Elder,J.H.,Alexander,S.,Phelan,A.W.,and Tarentino,A.L.(1984)Demonstration of peptide:N-glycosidase F activity in endo-beta-N-acetylglucosaminidase F preparations.J.Biol.Chem.259,10700-10704

11.Suzuki,T.,Park,H.,Kitajima,K.,and Lennarz,W.J.(1998)Peptides glycosylated in the endoplasmic reticulum of yeast are subsequently deglycosylated by a soluble peptide:N-glycanase activity.J.Biol.Chem.273,21526-21530

12.Lhernould,S.,Karamanos,Y.,Bourgerie,S.,Strecker,G.,Julien,R.,and Morvan,H.(1992)Peptide-N4-(N-acetylglucosaminyl)asparagine amidase(PNGase)activity could explain the occurrence of extracellular xylomannosides in a plant cell suspension.Glycoconj J.9,191-197

13.Ftouhi-Paquin,N.,Hauer,C.R.,Stack,R.F.,Tarentino,A.L.,and Plummer,T.J.(1997)Molecular cloning,primary structure,and properties of a new glycoamidase from the fungus Aspergillus tubigensis.J.Biol.Chem.272,22960-22965

14.Xin,F.,Wang,S.,Song,L.,Liang,Q.,and Qi,Q.(2008)Molecular identification and characterization of peptide:N-glycanase from Schizosaccharomyces pombe.Biochem Biophys Res Commun.368,907-912

15.Sugiyama,K.,Ishihara,H.,Tejima,S.,and Takahashi,N.(1983)Demonstration of a new glycopeptidase,from jack-bean meal,acting on aspartylglucosylamine linkages.Biochem Biophys Res Commun.112,155-160

16.Plummer,T.J.,Phelan,A.W.,and Tarentino,A.L.(1987)Detection and quantification of peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidases.Eur. J.Biochem.163,167-173

17.Berger,S.,Menudier,A.,Julien,R.,and Karamanos,Y.(1995)Endo-N-acetyl-beta-D-glucosaminidase and peptide-N4-(N-acetyl-glucosaminyl)asparagine amidase activities during germination of Raphanus sativus.Phytochemistry.39,481-487

18.Kimura,Y.,and Ohno,A.(1998)A new peptide-N4-(acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase from soybean(Glycine max)seeds:purification and substrate specificity.Biosci Biotechnol Biochem.62,412-418

19.Chang,T.,Kuo,M.C.,Khoo,K.H.,Inoue,S.,and Inoue,Y.(2000)Developmentally regulated expression of a peptide:N-glycanase during germination of rice seeds(Oryza sativa)and its purification and characterization.J.Biol.Chem.275,129-134

20.Diepold,A.,Li,G.,Lennarz,W.J.,Nurnberger,T.,and Brunner,F.(2007)The Arabidopsis AtPNG1gene encodes a peptide:N-glycanase.Plant J.52,94-104

21.Kato,T.,Kitamura,K.,Maeda,M.,Kimura,Y.,Katayama,T.,Ashida,H.,and Yamamoto,K.(2007)Free oligosaccharides in the cytosol of Caenorhabditis elegans are generated through endoplasmic reticulum-golgi trafficking.J.Biol.Chem.282,22080-22088

22.Funakoshi,Y.,Negishi,Y.,Gergen,J.P.,Seino,J.,Ishii,K.,Lennarz,W.J.,Matsuo,I.,Ito,Y.,Taniguchi,N.,and Suzuki,T.(2010)Evidence for an essential deglycosylation-independent activity of PNGase in Drosophila melanogaster.PLoS One.5,e10545

23.Seko,A.,Kitajima,K.,Inoue,Y.,and Inoue,S.(1991)Peptide:N-glycosidase activity found in the early embryos of Oryzias latipes(Medaka fish).The first demonstration of the occurrence of peptide:N-glycosidase in animal cells and its implication for the presence of a de-N-glycosylation system in living organisms.J.Biol.Chem.266,22110-22114

24.Suzuki,T.,Kitajima,K.,Emori,Y.,Inoue,Y.,and Inoue,S.(1997) Site-specific de-N-glycosylation of diglycosylated ovalbumin in hen oviduct by endogenous peptide:N-glycanase as a quality control system for newly synthesized proteins.Proc Natl Acad Sci U S A.94,6244-6249

25.Chantret,I.,Fasseu,M.,Zaoui,K.,Le Bizec,C.,Yaye,H.S.,Dupre,T.,and Moore,S.E.(2010)Identification of roles for peptide:N-glycanase and endo-beta-N-acetylglucosaminidase(Engase1p)during protein N-glycosylation in human HepG2cells.PLoS One.5,e11734。

发明内容

本发明的目的是为糖生物学的研究或其它研究领域提供一种新型的N-糖苷酶，该酶其主要的酶活功能是将N-糖链从蛋白质上完整切除。

N-糖苷酶（N-Glycanase或N-glycosidase，又名Peptide:N-Glycanase，简写为PNGase）在真核生物广泛存在，酵母菌、线虫、果蝇、鱼、小鼠、人、拟南芥、植物种子中均存在该酶，上述物种中的N-糖苷酶都可水解寡糖-G1cNAc-Asn-肽，释放出完整的寡糖链。N-糖苷酶对N-糖蛋白或N-糖肽的氨基酸序列有一定的专一性，序列为Ser/Thr-X-Asn，但是对糖链没有选择性，因此高甘露糖型、复合型、杂合型糖链均可切除释放。Filitcheva(8)把不同来源的PNGase进行了分类，分成3个类型，第一类是细菌来源的分泌型蛋白，例如PNGase F；第二类是细菌、真菌或者植物来源，分泌型或外膜蛋白，例如PNGase A和PNGase At，第三类是酵母、小鼠或人来源，胞内蛋白，如yPng1p、mPNGase和hPng1P等。最早发现N-糖苷酶是1977年从杏仁中发现，并命名为糖胺酶A(Almond)即PNGase A(9)。

不同物种来源的N-糖苷酶其相关信息统计在表1中。

表1不同物种N-糖苷酶的信息统计表

原核生物中分离到PNGase是1984年Plummer等(10)在细菌Flavobacterium meningosepticum（2005年更名为Elizabethkingia meningoseptica，以下简写为EM）中发现该酶，命名为N-糖苷酶F(PNGase F)，到目前为止唯一发现产N-糖苷酶的细菌，PNGase F的酶切示意图如图7所示。PNGase F因其广泛的底物特异性和完整切除糖链的特点，成为糖生物学研究过程中常用的工具酶，PNGase F在糖生物学研究的主要作用：一种研究目标是分析糖蛋白上的糖链类型，直接用PNGase F对N-糖蛋白进行酶解，通过超滤的方式得到糖链，再用质谱分析糖链的结构；另外一种既要分析糖链类型还需要明确糖链的连接位点，需要先将糖蛋白用胰酶处理切成多个肽段，再富集糖肽，再用PNGase F对这些糖肽进行酶切，超滤得到糖链，酶切后的肽段同时需要再做分析。针对糖链结构的分析，目前可以使用的技术包括毛细管电泳(CE)、高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)等。

脑膜炎败血伊丽莎白金菌FMS-007菌株的全基因组测序完成后，我们利用Glimmer3.0软件进行基因预测，COG、KEGG、GO对基因进行功能注释，找到了一段开放读码框（open reading frame，ORF），这段序列长度为1704bp，编码567个氨基酸，分子量约为63kDa，经SignalP4.1软件预测前面的30个氨基酸可能为信号肽，537个氨基酸为成熟肽段，它编码的蛋白与N-糖苷酶PNGase F具有相似结构域。

通过试验证明，该蛋白具备N-末端去糖基化功能，并且具备PNGase F的功能，并且能够对PNGase F不能切的糖蛋白也有酶切活性，进一步解析了这个蛋白的晶体结构，确认为它是一个新型的N-糖苷酶，我们将这个酶命名为PNGase F-Ⅱ。

本发明在此基础上完成。

本发明提供了一种新型的N-糖苷酶，主要用于N-糖蛋白的去糖基化，为糖生物学的研究提供一种新的工具酶。

所述的N-糖苷酶的氨基酸序列为下列两种任选一个：

a）具有如SEQ ID NO1所示的序列；

或者

b)与SEQ ID NO1所示的序列具有70%以上的同源性并且具有N-糖苷酶的活性。

所述的N-糖苷酶能够切除糖蛋白底物上的N-连接糖链。

新型糖苷酶基因序列来自前期完成的脑膜炎败血伊丽莎白金菌FMS-007菌株的全基因组测序数据，本发明中利用Glimmer3.0软件进行基因预测，COG、KEGG、GO对基因进行功能注释，获得一段开放读码框（open reading frame，ORF），该段序列长度为1704bp，编码567个氨基酸，分子量约为63kDa，经SignalP4.1软件预测前面的30个氨基酸可能为信号肽，537个氨基酸为成熟肽段，它编码的蛋白与N-糖苷酶PNGase F具有相似结构域。

本发明采用基因工程的方法，将目的基因克隆至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌中表达，通过亲和层析、分子筛层析及超滤的方法获得纯化的新型糖苷酶。

本发明提供了上述N-糖苷酶的制备方法，该方法包括以下步骤：

1）获得并扩增权利要求1所述的N-糖苷酶的基因序列；

2）构建PNGF2重组质粒；

3）表达权利要求1所述的N-糖苷酶；

4）分离纯化并鉴定。

所述的表达的系统是细菌、酵母或者昆虫表达系统。

本发明提供了编码上述N-糖苷酶的核酸，其重组载体，表达载体。

所述的生产方法包括常规的微生物发酵生产，利用生物工程技术在细菌、酵母、昆虫表达系统中的表达和生产。

另一方面，本发明提供了PNGase F-Ⅱ的应用。

试验表明，PNGase F-Ⅱ对不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N-糖蛋白及α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白均有酶切活性。

所述的N-糖苷酶用于切除糖蛋白底物上的N-连接糖链。

所述的糖蛋白底物可以是高甘露糖型糖链N-糖蛋白。

所述的N-连接糖链的接点可以是带有由α-1-3糖苷键连接的岩藻糖。

所述的糖蛋白底物可以是杂合型糖链N-糖蛋白。

所述的糖蛋白底物可以是HRP糖蛋白。

如本发明具体实施方式中所示，本发明的该酶作用的底物主要包括3种不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N-糖蛋白及α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白，。该酶具有广泛的底物特异性、操作简便、酶切效率高等特点。可用于糖链结构分析、糖链对蛋白质功能的影响、病原体与宿主表面识别过程中糖链的功能等方面的研究。

本发明是从原核生物脑膜炎败血伊莉莎白金菌中分离到的一种新型N-糖苷酶，能够将不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N-糖蛋白上的糖链完整切除，并且它能够切除α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的糖链，而已有的N-糖苷酶F（PNGaseF）对α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白没有酶切活性。该新型N-糖苷酶命名为二型PNGase F，PNGaseF-II。在糖生物学研究领域中，糖苷酶的种类比较缺乏，常用N-糖苷酶对α-1,3连接的核心岩藻糖化的N-糖蛋白不起作用。本发明发现的酶对N-糖蛋白有更为广泛的底物特异性，有较高的实际应用价值。

本发明的新型N-糖苷酶可以用于N-糖链结构分析、糖链的功能分析，为糖生物学以及生物医药的研究提供新一种新的工具酶。

附图说明

图1：PNGase F-Ⅱ对高甘露糖型N-糖蛋白的酶切结果图。

图2：PNGase F-Ⅱ对复杂型糖链N-糖蛋白的酶切结果图。

图3：PNGase F-Ⅱ对杂合型糖链N-糖蛋白的酶切结果图。

图4：PNGase F-Ⅱ对α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的酶切结果图。

图5:PNGase F-ⅡN-糖苷酶切活性的质谱分析。

其中，PNGase F-Ⅱ即新型糖苷酶，PNGase F即N-糖苷酶F为已知的能够将卵清蛋白的N-糖链完整切除；PNGase F-Ⅱ具备完整切除N-糖链的功能。

图6：新型N-糖苷酶PNGase F-Ⅱ蛋白的晶体结构。

图7：N-糖蛋白连接示意图。

图8：N-糖链结构类型。

图9：PNGase F-Ⅱ对不同糖链结构N-糖蛋白的酶切结果。

其中，0：表示只有底物，F：底物加PNGase F，F-Ⅱ：底物加PNGase F-Ⅱ；RNase B核糖核酸酶B，Ovalbumin卵清蛋白，IgG人免疫球蛋白，HRP辣根过氧化物酶；native指底物糖蛋白不变性，heated是指底物糖蛋白经过100℃热变性处理；蓝色框表示被PNGase F-Ⅱ酶切后的底物变化。

图10：新型糖苷酶PNGF2重组质粒构建蛋白表达示意图。

图11：PNGF2重组质粒构建图。

图12：IPTG诱导PNGF2表达的SDS-PAGE图。

其中，黑色箭头指示为目的蛋白PNGF2。

图13：重组蛋白PNGF2镍柱纯化的SDS-PAGE图。

其中，1:细胞裂解液，2：上柱后流出液，3：洗柱流出液，4：洗脱蛋白，M：蛋白分子量标准。

图14：重组蛋白PNGF2分子筛纯化的SDS-PAGE图。

其中，M：蛋白分子量标准，13-23：为蛋白洗脱收集管的编号。

图15：重组蛋白PNGF2经分子筛纯化蛋白紫外吸收峰检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、生物化学等常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《蛋白质纯化》（(Richard R.Burgess)，或者可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

本发明中，酶切反应的具体步骤如下：

1.酶切反应的试剂准备

(1)试剂反应所需要的缓冲液

①用于SDS-PAGE鉴定结果：10mM磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）

②用于糖链结构分析：50mM的碳酸氢氨缓冲液（pH8.0）

(2)反应底物的制备

N-糖白粉末溶解于双蒸水中，取适量需要酶切的底物于1.5ml反应管中，用反应缓冲液稀释至反应所需要的浓度0.5mg/ml～5mg/ml。

①对于常见的单聚体的N-糖蛋白，需要经过热变性处理，将上述蛋白溶液，用封口膜将管口封闭，放置100处理10min，冷却至室温，用离心机将管壁上的溶液离心至管底。

②对人免疫球蛋白（IgG），则不要热处理。

2.酶切反应条件

(1)反应温度：该酶最佳反应温度为37℃。

(2)反应时间：底物经热处理后，反应2h即可；底物未经热处理的IgG需要反应6h以上，如果需要反应更彻底，则可过夜处理约12小时～16小时。

3.酶切结果的鉴定

(1)糖原染色的鉴定方法：

PAS糖原染色又称为过碘酸雪夫染色，其原理是过碘酸能使多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schiff氏液的无色品红结合，形成红色。该方法可以鉴定PNGase F酶切处理后底物N-糖蛋白上的糖链存留情况，以转铁蛋白（TF，复杂型糖链）为酶切底物，操作步骤如下：

a)TF贮存液制备：TF溶解于灭菌双蒸水中，配制浓度为10mg/ml；

b)酶切反应：对照管1ul TF(10ug)和19ul PBS(pH7.4)，样品管：1ul TF(10ug)和0.5ul PNGase F加入到18.5ul PBS，反应体系共计20ul，37℃反应12h-16h，酶切后的样品加入5ul5×蛋白上样缓冲液，置于95℃10min终止酶解，冷却至室温；

c)SDS-PAGE：制备分离胶浓度为10％的胶，反应后的对照管和样品管分两份，分别上样至同一块胶的不同胶孔内，恒压100V1.5h左右；

d)染色：电泳结束后，把胶切开，一半胶做考马斯亮蓝染色，一半胶做PAS糖原染色步骤参照（5）进行，染色结束后拍照。

e)糖原染色的详细步骤：

A.试剂制备：

3%冰醋酸：30ml冰醋酸，加970ml水，室温保存。

50%甲醇：250ml甲醇，加入250ml水，室温保存。

Oxidizing solution：加250ml3%乙酸溶解oxidizing reagent，4℃保存。

Reducing solution：加250ml水溶解reducing reagent，4℃保存。

HRP辣根过氧化物酶：为阳性对照，1mg/ml浓度，上样5ul-10ul。

大豆胰蛋白酶抑制剂：为阴性对照，1mg/ml浓度，上样5ul-10ul。

B.操作步骤：

a)SDS-PAGE后，把胶浸没在100ml50%甲醇中，30min。

b)用100ml3%乙酸清洗胶，放在脱色摇床轻摇，10min，重复洗一次。注意：胶也可放在水中4℃过夜。

c)把胶转移至25ml氧化溶液（oxidizing solution），摇床15min。

d)用100ml3%乙酸洗胶，放在脱色摇床轻摇5min，重复该步骤，清洗时间延长至10min。

e)把胶转移至25ml染色液中（glycoprotein staining reagent），放置摇床，染色15min。

f)胶再转移至25ml还原溶液（reducing solution），轻摇5min。

g)用100ml3%乙酸充分洗胶，再用纯水清洗，糖蛋白出现品红色条带，胶放于100ml3%乙酸中保存。

(2)质谱分析PNGase F-Ⅱ酶切后的糖链

标准N-糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）为底物（高甘露糖型），用纯化的PNGase F-Ⅱ酶切处理后收集糖链，利用质谱仪对糖链进行分析，同时商品化的的PNGase F（NEB公司）为对照，确定PNGASE F-Ⅱ对N-糖蛋白的酶切位点。具体步骤如下：

1)RNase B溶解于灭菌双蒸水中，配制浓度为10mg/ml；

2)底物变性：10ul RNase B(100ug)加入到89ul50mM NH₄HCO₃中，100沸水浴10min，使糖蛋白变性；

3)酶切反应：热变性的RNase B冷却至室温后，分别加入1ul纯化的PNGASE F-Ⅱ和PNGaseF，反应体系共计100ul，37℃反应12h-16h，酶切后的样品置于95℃10min终止酶解，冷却至室温；

4)将酶切反应液体转移至3KD滤膜孔径的超滤管中，5000rpm离心30min，收集滤液；

5)质谱仪鉴定糖链：用基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法鉴定上一步收集的糖链，1ul滤液和1ul基质（2，5-二羟基对苯甲酸，50%ACN乙腈和0.5%TFA三氟乙酸）烘干后，上质谱仪鉴定，采用阳离子反射模式，20Kv，氮气脉冲激光（337纳米），进行质谱鉴定，结果如图6所示。

实施例1：高甘露糖型糖链N-糖蛋白的酶切处理

操作步骤：

1)反应底物的制备：将需要酶切处理的糖蛋白底物核糖核酸酶B（RNase B）10ug，稀释至所需要的反应体系中，用100℃处理10min，后冷却至室温备用。

2)酶切反应缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）

3)酶切体系：将上述制备的底物加入0.5ul的PNGase F-Ⅱ，同时商品化的的PNGase F（NEB公司）为阳性对照，以只加底物做阴性对照，反应体系总体积20ul。

表2高甘露糖型糖链N-糖蛋白的酶切体系

4)酶切反应条件：37℃水浴反应6h后，样品取出后放置于65℃水浴中处理30min，终止酶活，酶切结果可经SDS－PAGE电泳鉴定，结果如图1所示。

实施例2:复杂型糖链N-糖蛋白的酶切处理

操作步骤：

1)反应底物的制备：将需要酶切处理的复杂型糖链N-糖蛋白卵清蛋白（Ovalbumin）底物10ug，稀释至所需要的反应体系中，用100℃处理10min，后冷却至室温备用。

2)酶切反应缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）

表3复杂型糖链N-糖蛋白的酶切体系

4)酶切条件：37℃水浴反应6h后，样品取出后放置于65℃水浴中处理30min，终止酶活，酶切结果经SDS－PAGE电泳鉴定，结果如图2所示。

实施例3：杂合型糖链N-糖蛋白的酶切处理

操作步骤：

1)反应底物的制备：将需要酶切处理的杂合型糖链N-糖蛋白人免疫球蛋白（Ovalbumin）底物10ug，稀释至所需要的反应体系中，不要需要热变性处理。

2)酶切反应缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）

表4杂合型糖链N-糖蛋白的酶切体系

4)酶切条件：37℃水浴反应6h后，样品取出后放置于65℃水浴中处理30min，终止酶活，酶切结果经SDS－PAGE电泳鉴定，结果如图3所示。

实施例4：α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白

操作步骤：

1)反应底物的制备：将需要酶切处理的α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）底物10ug，稀释至所需要的反应体系中，用100℃处理10min，后冷却至室温备用。

2)酶切反应缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）

表5α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的酶切体系

4)酶切条件：37℃水浴反应6h后，样品取出后放置于65℃水浴中处理30min，终止酶活，酶切结果经SDS－PAGE电泳鉴定，结果如图4所示。

实施例5：N-糖苷酶切活性的质谱分析

标准N-糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）为底物（高甘露糖型），用纯化的PNGase F-Ⅱ酶切处理后收集糖链，利用质谱仪对糖链进行分析，同时商品化的的PNGase F（NEB公司）为对照，确定PNGASE F-Ⅱ对N-糖蛋白的酶切位点。

具体步骤如下：

RNase B溶解于灭菌双蒸水中，配制浓度为10mg/ml；

底物变性：10ul RNase B(100ug)加入到89ul50mM NH₄HCO₃中，100沸水浴10min，使糖蛋白变性；

酶切反应：热变性的RNase B冷却至室温后，分别加入1ul纯化的PNGASE F-Ⅱ和PNGaseF，反应体系共计100ul，37℃反应12h-16h，酶切后的样品置于95℃10min终止酶解，冷却至室温；

将酶切反应液体转移至3KD滤膜孔径的超滤管中，5000rpm离心30min，收集滤液；

质谱仪鉴定糖链：用基质辅助激光解析离子化-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）方法鉴定上一步收集的糖链，1ul滤液和1ul基质（2，5-二羟基对苯甲酸，50%ACN乙腈和0.5%TFA三氟乙酸）烘干后，上质谱仪鉴定，采用阳离子反射模式，20Kv，氮气脉冲激光（337纳米），进行质谱鉴定，结果如图6所示。

实施例6：新型糖苷酶的生产过程

新型糖苷酶基因序列来自前期完成的脑膜炎败血伊丽莎白金菌FMS-007菌株的全基因组测序数据，我们利用Glimmer3.0软件进行基因预测，COG、KEGG、GO对基因进行功能注释，找到了一段开放读码框（open reading frame，ORF），这段序列长度为1704bp，编码567个氨基酸，分子量约为63kDa，经SignalP4.1软件预测前面的30个氨基酸可能为信号肽，537个氨基酸为成熟肽段，它编码的蛋白与N-糖苷酶PNGase F具有相似结构域。

我们采用基因工程的方法，将目的基因克隆至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌中表达，通过亲和层析、分子筛层析及超滤的方法获得纯化的新型糖苷酶。

1.1生产的方法及过程

1.1.1PNGF2重组质粒的构建策略

根据FMS-007基因组测序数据得到PNGF2基因序列，以FMS-007的基因组DNA为模板，PCR扩增产物定向克隆到业界常用的原核表达载体，如PET系统的表达载体PET15、PET32、PET28等，选常用的多克隆酶切位点将目的基因插入到表达载体上，构建重组质粒，构建后与其蛋白的表达结果如图10。

1.1.2PNGF2基因的PCR扩增

PNGF2基因的PCR扩增的反应体系按照表6配制，混匀，扩增参数为98℃10s，52℃15s，72℃20s，33个循环，72℃5min1个循环。100V恒压电泳40min，用凝胶成像系统拍照。PNGF2的引物序列如下：

上游引物F2F：5’-ATCCATGGCCCAGACTTATGAAATTACTTATC-3’（SEQ ID NO2）

下游引物F2R：5’-ACCTCGAGTTCTTGCCCTAAGAGAACG-3’（SEQ ID NO3）

表6PNGF2PCR扩增体系

1.1.3PNGF2PCR产物的定向克隆

（1）PNGF2的PCR产物及pET28a载体双酶切

用两个限制性内切酶NcoI和XhoI或者Pst I和BamH I等双酶切PCR产物。根据纯化后的目的基因PNGF2及载体的浓度按照表7配制酶切体系，混匀后37℃酶切1h。酶切结束后，使用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物，操作步骤。载体双酶切后，电泳后割胶回收，操作步骤按照胶回收试剂盒。

表7PCR产物/质粒DNA的双酶切体系

（2）PNGF2基因和载体的连接

根据双酶切纯化后的PNGF2浓度以及原核表达载体的浓度，使两者的摩尔比约为1:5，按照表8配制连接体系，混匀后22℃连接20min。

表8PNGF2基因和pET-28a(+)载体连接体系

（3）连接产物的转化

质粒转化至感受态细胞的主要原理是，细菌在0～4℃的CaCl₂低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态，42℃热激促进吸收外源DNA。将（2）转化连接产物20ul全部转化至E.coli Top10感受态细胞，详细步骤如下：

1)从-80℃冰箱中取50μl感受态细胞，于冰浴上融化，加入20μl连接产物，轻弹混匀，冰浴放置30min。

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程不要摇动管。

3)向管中加300μl灭菌LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃下200rpm振荡培养1h，使细菌复苏。

4)将菌液5000rpm离心2min，吸头弃去一半上清液(约150μL)，用枪头将沉淀轻轻吹起混匀，然后全部菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上。倒置平板，37℃过夜培养(约12h)。

5)待平板长出菌落后，分散选取8个单菌落在平板底部标记，将每个菌落挑入5mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃200rpm振荡培养10～14h。

（4）重组质粒的抽提

使用质粒小提试剂盒（Axygen生物公司）提取质粒，步骤如下：

1)将收集3ml菌液，室温12000rpm离心1min，尽量吸去上清，留取沉淀。

2)向上一步的沉淀中加入250μl Buffer A1(确保加入了RNase A)，用移液器或涡流振荡充分悬浮细菌细胞。

3)再向离心管中加入250μLBuffer B1(预先加入RNase A），温和地上下翻转10次使菌体混合均匀，然后静置5min至溶液粘稠而澄清。

4)再向离心管中加入350μL Buffer N1，立即温和地上下翻转多次混匀，此时出现白色絮状沉淀。

5)室温12000rpm离心10min，如果上清中还有白色沉淀，可再次离心。

6)小心吸取离心后的上清液，转入带有收集管的DNA柱中，注意避免吸到沉淀，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

7)再向DNA柱中加入500mL Buffer KB，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

8)向离心柱中加500μL DNA wash buffer(确保加入乙醇)，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

9)重复上一步操作。

10)将离心柱放回离心机中，室温12000rpm开盖离心5min，除去残余的乙醇。

11)将离心柱转至新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中央悬空滴加70μL ElutionBuffer，室温放置5min，12000rpm离心1min，将洗脱液重新滴加到吸附膜中央，12000rpm离心1min，收集含有质粒的洗脱液。

12)质粒提取后，用NANODROP2000检测产物的浓度及纯度。

（5）重组质粒的双酶切鉴定

对上一步提取的质粒DNA用构建克隆所用的两个限制性内切酶进行双酶切鉴定，依据测定的质粒浓度，按照表9配制酶切体系，37℃酶切1h。剩余的质粒保存备用。

表9双酶切鉴定的反应体系

用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，DNA Marker使用DL2000和λ-Hind III（使用前60℃加热5min）。

（6）重组质粒的测序

根据琼脂糖凝胶电泳结果，选择双酶切阳性的质粒，送检至华大基因公司测序。

1.2.1PNGF2的原核表达

1.2.1.1重组质粒转化

本试验选择的表达宿主菌为E.coli BL21(DE3)，该菌以T7RNA聚合酶介导的高效表达外源基因的蛋白表达宿主。经测序验证正确的PNGF2重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，步骤如下：

1)从-80℃冰箱中取50μl感受态细胞，于冰浴上融化，再加入1μl重组质粒，轻弹混匀，冰浴放置30min。

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程注意不要摇动管。

3)向管中加300μl灭菌LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃下200rpm振荡培养1h，使细菌复苏。

4)用移液器将200ul菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上，倒置平板，37℃过夜培养(约12h)。

1.2.1.2PNGF2蛋白表达

先在没有诱导物的条件下，细菌进入最佳生长状态时，向培养基中加入诱导物IPTG，与阻遏蛋白结合解除抑制，使外源基因大量表达。

诱导步骤如下：

1)选取含PNGF2重组质粒的BL21和空载体为对照，挑单菌落，并分别接种至5ml LB培养基(含10-200μg/ml卡那霉素)中，37℃，200rpm振荡培养10-12h，取样100ul至1.5ml离心管，-20℃保存，用于SDS-PAGE。

2)分别向菌液中加入IPTG(终浓度在0.1-10mM)，20-37℃，200rpm振荡培养12h，诱导目的基因PNGF2表达。

3)诱导前和诱导后的菌液分别取100μL，12000rpm离心1min，弃上清。

4)向沉淀中加100μL1×PBS重悬菌体，吹吸混匀。每管中再取出30μL于新的离心管中，分别加入7.5μL5×SDS上样缓冲液，95℃煮10min。

5)使用Unstained Protein MW Marker用作对照，使用前95℃煮10min。

6)再将样品于12000rpm离心10min。

7)取15μL上清样品点样，先用15mA进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电流调成30mA电泳使溴酚蓝跑到凝胶边缘。

8)考马斯亮蓝染色1h，脱色液脱色2h，脱色两次。拍照保存结果。

1.2.2重组蛋白PNGF2的纯化

重组蛋白PNGF2的纯化经过三个步骤，第一步为镍柱亲和层析，第二步为分子筛层析，第三步超滤。纯化的所有操作均在4℃下进行。

A.镍柱纯化

1)含重组质粒的单克隆挑至5ml的LB液体培养基(含50μg/mL抗生素)中，10～14h后吸取2ml转入两个装有200ml LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养10h，共培养1L菌液。

2)将2.3.2中诱导的两瓶菌液分别加入两个大离心管中，用1×PBS配平后，4℃，5000rpm离心10min，尽量吸去上清。

3)向上一步的沉淀中加入200mL1×PBS洗涤细菌细胞，4℃，5000rpm离心10min。

4)去上清，两管中分别加入7.5mL Lysis Buffer(10mM咪唑，pH8.0)重悬菌体，然后再加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，充分混匀后，在冰上孵育30min，期间摇晃2～3次。

5)在冰浴条件下，35%功率超声破碎菌体30min，工作3s停顿7s，避免温度过高。

6)将细菌裂解物液于4℃，12000rpm离心30min，小心轻轻取上清，避免吸起沉淀，缓慢沿壁转入新的离心管中。

7)使用Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，先加3倍柱体积的0.5M NaOH洗柱(柱再生)；再用3～5倍柱体积的Lysis Buffer洗柱(平衡柱)；平衡后将上一步的上清液加入柱中，待液体快流完时，分别用Wash Buffer(25mM咪唑，pH8.0)和Elution Buffer(300mM咪唑，pH8.0)淋洗，依次收集不同的洗脱液，收集到的目的蛋白保存在4℃。

8)将所有收集到的样品进行SDS-PAGE鉴定，均取10μl点样。

9)使用30kD的超滤管对目的蛋白进行超滤纯化。

10)利用BCA法检测目的蛋白的浓度，根据已知浓度的各种蛋白标准品，使用TECAN酶标仪，通过制作标准曲线来检测目的蛋白的浓度。

B.分子筛层析

分子筛柱选用GE公司Superdex20016/60，上分子筛所用的缓冲液为(10mMTris-HCl,100mM NaCl,pH8.0)，具体操作方法见操作手册。

C.超滤

经过分子筛过柱得到PNGF2蛋白，一部分蛋白用孔径为30KD的超滤管（Millipore，美国）的方法，将蛋白浓缩至60mg/ml，用于后续的蛋白结晶实验；另一部分蛋白则用30KD的超滤管去除盐离子，用PBS洗涤3次，最后PBS buffer（pH7.4）溶解蛋白，分装后，－20℃保存备用，用于后续的PNGF2功能分析。

2结果

2.1PNGF2/pET28a重组质粒构建

将目的基因PNGF2片段克隆至pET28a载体上，结果如图11所示。

2.2IPTG诱导表达

重组的阳性克隆经测序鉴定正确后，转化至E.coli BL21，随机挑选两个单克隆分别接种至LB培养基中，加入IPTG诱导表达，分别在诱导后6h和12h取样，结果如图12所示，结果表明加入IPTG诱导12h左右，PNGF2有较高的表达量。

2.3重组蛋白PNGF2的纯化

重组蛋白PNGF2经过镍柱亲和层析纯化后，可得到较纯的蛋白，见图13，但是不能满足蛋白结晶的条件，继续用分子筛层析纯化（图14），并对纯化的蛋白检测其280nm吸收峰（图15）在主峰位置收集蛋白目标蛋白，经过纯化得到了纯的均一的PNGF2蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种用于N-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其应用

<130> 20140307

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu Phe Phe Leu Pro Leu Leu Lys Thr Asn Leu Met Gln Lys Ile

1 5 10 15

Leu Leu Cys Ser Leu Ile Thr Gly Ala Gln Met Ile Phe Ala Gln Thr

20 25 30

Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln Asn Ser Phe Glu Gly Lys Ile Asn Pro Asn

35 40 45

Gln Asn His Ile Ile Ser Ile Thr Asn Ser Asp Lys Thr Leu Leu Phe

50 55 60

Asn Glu Lys Ile Lys Asn Lys Lys Ala Asp Phe Pro Phe Glu Val Asn

65 70 75 80

Glu Ile Asn Arg Lys Asn Asn Glu Val Ser Gln Phe Ala Phe Leu Asn

85 90 95

Asn Asn Glu Ile Val Lys Thr Ser Asp Asn Thr Ile Leu Ala Lys Gln

100 105 110

Glu Phe Lys Pro Thr Ser Glu Thr Gly Lys Ile Leu Gly Tyr Asn Val

115 120 125

Lys Lys Ala Val Thr Ser Val Asn Ser Asn Thr Ile Glu Val Trp Tyr

130 135 140

Thr Asn Asp Leu Lys Val Lys Gly Gly Pro Ser Ile Leu Gly Gln Asp

145 150 155 160

Leu Gly Leu Val Leu Lys Thr Val Arg Asn Gly Ser Ser Val Val Glu

165 170 175

Ala Thr Ser Val Lys Lys Ile Lys Ala Leu Asp Asp Gln Ser Leu Phe

180 185 190

Asn Gly Lys Asn Ile Thr Glu Lys Asp Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Met

195 200 205

Ile Trp Lys Ser Arg Phe Ile Thr Ile Pro Val Phe Glu Asn Glu Thr

210 215 220

Ile Asn Phe Ser Asp Ala Ser Lys Ser Asp Gln Val Ile Gln Arg Phe

225 230 235 240

Gly Asn Gly Thr Ile Ile Leu Lys Lys Val Lys Ile Pro Glu Ile Lys

245 250 255

Gln Gly Asn Thr Ile Phe Val Glu Leu Lys Gln Lys Ser Asn Gly Asp

260 265 270

Ala Tyr Asp Arg Thr Gly Asp Val Phe Ile Ile Pro Gln Glu Arg Ala

275 280 285

Ile Ser Tyr Tyr Thr Gly Leu Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Pro Val

290 295 300

Tyr Gln Asn Gly Asn Gly Lys Ser Tyr Gln Gly Val Ala Leu Thr Pro

305 310 315 320

Asp Tyr Leu Pro Phe Ile Glu Leu Met Arg Phe Phe Thr Pro Phe Gly

325 330 335

Ile Gly His Phe Asn Glu Lys Ile Gln Leu Lys Gly Lys Asn Trp His

340 345 350

Asn Asn Thr Pro Tyr Arg Gln Asp Ile Thr Glu Leu Arg Pro Gln Leu

355 360 365

Ser Gly Lys Glu Ile Leu Ile Gly Ala Phe Ile Gly Asn Tyr Asp Lys

370 375 380

Gly Gly His Gln Ile Ser Leu Glu Leu Ser Ile His Pro Asp Gln Gln

385 390 395 400

Lys Ile Val Asn Asn Asn Phe Val Leu Pro Val Phe Asn Thr Thr Asn

405 410 415

Val Met Glu Met Ala Gly Gln Asp Tyr Pro Thr Met Phe Asn Ser Asp

420 425 430

Lys Gly Val Glu Val Glu Phe Ile Leu Thr Lys Asp Leu Lys Asn Ala

435 440 445

Gln Leu Arg Tyr Ile Thr Thr Gly His Gly Gly Trp Gly Ala Gly Asp

450 455 460

Glu Phe Val Pro Lys Glu Asn Ser Ile Tyr Leu Asp Gly Lys Leu Ala

465 470 475 480

His Ala Phe Thr Pro Trp Arg Thr Asp Cys Gly Ser Tyr Arg Leu Phe

485 490 495

Asn Pro Ala Ser Gly Asn Phe Glu Asp Gly Leu Ser Ser Ser Asp Leu

500 505 510

Ser Arg Ser Asn Trp Cys Pro Gly Thr Ile Thr Asn Pro Val Tyr Ile

515 520 525

Asn Leu Gly Asn Leu Asn Ala Gly Lys His Thr Ile Gln Val Lys Ile

530 535 540

Pro Gln Gly Ala Pro Glu Gly Ser Ser Gln Ser Phe Trp Asn Val Ser

545 550 555 560

Gly Val Leu Leu Gly Gln Glu

565

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atccatggcc cagacttatg aaattactta tc 32

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acctcgagtt cttgccctaa gagaacg 27

Claims

1.一种N-糖苷酶，其特征在于，所述的N-糖苷酶的氨基酸序列为下列两种任选一个：

a）具有如SEQ ID NO1所示的序列；

或者

2.一种编码N-糖苷酶的核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的N-糖苷酶。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的核酸。

4.一种N-糖苷酶，其特征在于，所述的N-糖苷酶能够切除糖蛋白底物上的N-连接糖链。

5.权利要求1所述的N-糖苷酶在用于切除糖蛋白底物上的N-连接糖链中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是HRP糖蛋白。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是高甘露糖型糖链N-糖蛋白。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的N-连接糖链的接点是带有由α-1-3糖苷键连接的岩藻糖。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是杂合型糖链N-糖蛋白。

10.权利要求1所述的N-糖苷酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）获得并扩增权利要求1所述的N-糖苷酶的基因序列；

2）构建含有权利要求1所述的N-糖苷酶的基因序列的重组载体；

3）表达权利要求1所述的N-糖苷酶；

4）分离纯化并鉴定。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的表达的系统是细菌、酵母或者昆虫表达系统。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的方法包括常规的微生物发酵生产，利用生物工程技术在细菌、酵母、昆虫表达系统中的表达和生产。