CN108531467A

CN108531467A - 一种核心岩藻糖苷酶及其制备和应用

Info

Publication number: CN108531467A
Application number: CN201710125222.XA
Authority: CN
Inventors: 陈力; 李天胜; 李梦洁
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-03-03
Filing date: 2017-03-03
Publication date: 2018-09-14

Abstract

本发明属于糖生物学技术和工程领域，具体涉及一种核心岩藻糖苷酶(Core fucosidase(Cfus))的新型岩藻糖苷酶及其酶活性和应用。本发明实验证实所述的Cfus能切除N‑糖蛋白糖链上核心α1,3岩藻糖，明显不同于现有技术的对糖蛋白核心α1,3岩藻糖无酶切活性的岩藻糖苷酶；同时该Cfus还能水解其他岩藻糖缀合物类型的岩藻糖；本发明为糖生物学以及生物医药的研究提供了一种新的工具酶；将可能成为过敏治疗的潜在工具，所述的岩藻苷酶可用于N‑糖链糖蛋白结构分析、核心岩藻糖基化糖链的功能研究。

Description

一种核心岩藻糖苷酶及其制备和应用

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，涉及分子生物学、生物化学以及病原生物学，具体涉及岩藻糖苷酶及其制备方法和应用，尤其是一种核心岩藻糖苷酶及其制备方法和应用。

背景技术

现有技术公开了糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用，而岩藻糖基化修饰广泛存在各种蛋白和寡糖中，包括N-寡糖和O-寡糖。

研究显示，L-岩藻糖广泛存在哺乳动物，植物和昆虫细胞中，并且含L-岩藻糖的糖复合物在这些生物的许多生理和病理的过程中起着至关重要的过程，如炎症反应，细菌和病毒的感染，肿瘤的转移，遗传疾病的发生，受精过程，抗体的免疫激活效应以及过敏反应等等。岩藻糖基化的过程主要由岩藻糖基转移酶(FucTs)参与，根据岩藻糖苷酶催化岩藻糖连接方式，可将FucTs分为α1,2,α1,3/4,α1,6和O-FucTs，这些岩藻糖基转移酶能将岩藻糖供体二磷酸鸟苷-岩藻糖(GDP-Fuc)上的岩藻糖以相应的键连接至受体寡糖，糖蛋白或者糖脂上，完成岩藻糖基化过程。

研究还公开了核心岩藻糖基化是岩藻糖残基跟糖蛋白糖链最内侧的N-乙酰氨基葡萄糖相连的一种岩藻糖基化形式，根据岩藻糖残基跟N-乙酰氨基葡萄糖相连的糖苷键不同，又分为核心α1,3(coreα1,3)和核心α1,6(coreα1,6)岩藻糖基化，如图1所示，两种N糖链结构示意图，框中所示结构在不同物种中高度保守，被称为五糖核心，其中连接在核心五糖最内侧的N-乙酰氨基葡萄糖的岩藻糖即为核心岩藻糖，图1显示了：1位连接为coreα1,3岩藻糖；2位连接为coreα1,6岩藻糖，而3,4位连接则对应的为末端岩藻糖；其中coreα1,3的形式主要存在于植物，昆虫和寄生虫中，而在哺乳动物和细菌中缺乏，而coreα1,6岩藻糖基化主要存在哺乳动物细胞中，同时存在coreα1,3和coreα1,6岩藻糖基化主要是一些昆虫和两栖类动物；但在许多岩藻糖基化的糖蛋白中，岩藻糖基化对这些蛋白发挥功能起着至关重要的作用，当肝脏、肺脏、胃等组织发生恶变时，随着α1,6FucT活性的增高，核心岩藻糖基化N一糖链的含量会明显增加，例如，被核心岩藻糖基化的AFP称AFP-L3，由于具有非常好肝癌特异性，2005年被国FDA确定为肝癌诊断的新标志物，这也许能弥补在临床上被用来检测肝癌的AFP的非特异性情况；再如，80％人的血清IgG和90％常规CHO细胞生产的重组IgGs的Fc糖链中含有核心岩藻基化修饰，但是核心岩藻糖缺失可显著增强IgG的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC),因为核心岩藻糖缺失的抗体与FcγRIIIa的亲和力明显增强，从而增强免疫细胞的激活发挥由抗体介导的细胞毒性[8]。

虽coreα1,3修饰在植物或者昆虫发挥的生物学功能目前并不是很清楚，由于人类缺乏coreα1,3岩藻糖的修饰，当人类接触到具有coreα1,3岩藻糖修饰的糖蛋白却往往引起过敏反应；有研究报道在很多过敏患者体内，能检测到其体内的IgE对coreα1,3岩藻糖表位有十分强的识别和接合信号，coreα1,3岩藻糖是引起人类过敏的重要表位。

alpha-L-岩藻糖苷酶(α-L-Fucosidase)是一类能够催化水解糖链上岩藻糖基的水解酶，database of Carbohydrate-Active enZYmes(CAZY)数据库中(http://www.cazy.org)，将α-L-Fucosidase分为GH29和GH95家族，GH95家族表现出严格的底物特异性，常催化水解以α1,2连接在半乳糖上的岩藻糖残基，并通过转置机制水解糖苷键；而GH29家族的底物特异性相对广泛，并通过保留机制催化水解岩藻糖残基，其家族包含水解α1,2,α1,3/4,α1,6连接方式的岩藻糖苷酶。

根据目前已有的报道，在许多物种中均发现α-L-Fucosidase，其中古细菌，细菌，真核生物中均有研究发现；EC编号为3.2.1.51，该糖苷酶能切以α1,2/3/4/6,连接的一种或多种糖苷键，并对人工合成显色底物对硝基苯-岩藻糖苷pNP-α-L-Fuc有较高的水解活性，并在数据库CAZY的分类中属于GH29。EC号为3.2.1.111，该类糖苷酶具有水解α1,3/4连接的糖苷键，对人工合成显色底物pNP-Fuc没有或者很低的水解活性。对上述的功能差异，日本学者Haruko SAKURAMA等人将GH29家族又分为GH29-A和GH29-B两个亚家族。

研究报道了岩藻糖苷酶对寡糖链或者糖蛋白上糖链非核心末端的岩藻糖残基有水解作用，即只能酶切图1中的3,4位置的岩藻糖，但对糖蛋白核心岩藻糖残基酶切作用并未见有报道(即1和2位连接的岩藻糖)。

虽然核心岩藻糖的去除有着及其重要的意义：例如IgG上的coreα1,6岩藻糖的去除显著的提高50-100倍的抗体ADCC效应，同时过敏原上的coreα1,3的岩藻糖的去除对于治疗过敏具有巨大潜在的应用价值，但是，迄今尚未见有关能直接有效的水解糖蛋白核心岩藻糖(包括核心coreα1,3和coreα1,6岩藻糖)的糖苷酶报道和应用。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟开发能水解核心岩藻糖的岩藻糖苷酶，提供一种新的核心岩藻糖苷酶及其制备和应用。

于本发明相关的现有技术有如下参考文献:

1.Ma,Bing,Joanne L.Simala-Grant,and Diane E.Taylor."Fucosylation inprokaryotes and eukaryotes."Glycobiology 16.12(2006):158R-184R.

2.Becker D J,Lowe J B.Fucose:biosynthesis and biological function inmammals[J].Glycobiology,2003,13(7):41R-53R.

3.Miyoshi E,Moriwaki K,Nakagawa T.Biological function of fucosylationin cancer biology[J].Journal of biochemistry,2008,143(6):725-729.

4.Takahashi M,Kuroki Y,Ohtsubo K,et al.Core fucose and bisectingGlcNAc,the direct modifiers of the N-glycan core:their functions and targetproteins[J].Carbohydrate research,2009,344(12):1387-1390.

5.Wilson B,Harthill JE,Mullin NP,Ashford DA and Altmann F(1998)Corealpha1,3-fucose is a key part of the epitope recognized by antibodiesreacting against plant N-linked oligosaccharides and ispresent in awidevariety of plant extracts.Glycobiology 8:651–661.

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7.Li D,Mallory T,Satomura S.AFP-L3:a new generation of tumor markerfor hepatocellular carcinoma[J].Clinica chimica acta,2001,313(1):15-19.

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9.van Die I,Gomord V,Kooyman F N J,et al.Coreα1→3‐fucose is a commonmodification of N‐glycans in parasitic helminths and constitutes an importantepitope for IgE from Haemonchus contortus infected sheep[J].Febs Letters,1999,463(1-2):189-193.

10.Sakurama,Haruko,et al."Differences in the substrate specificitiesand active-site structures of twoα-L-fucosidases(glycoside hydrolase family29)from Bacteroides thetaiotaomicron."Bioscience,biotechnology,andbiochemistry 76.5(2012):1022-1024.

11.Ashida,Hisashi,et al."Two distinctα-l-fucosidases fromBifidobacterium bifidum are essential for the utilization of fucosylated milkoligosaccharides and glycoconjugates."Glycobiology 19.9(2009):1010-1017.。

发明内容

本发明的目的是为糖生物学的研究及应用提供岩藻糖苷酶及其制备方法和应用，尤其是一种核心岩藻糖苷酶及其制备方法和应用。

本发明提供了一种新的去核心岩藻糖基化但不限于去核心岩藻糖基化的糖苷酶，尤其是可从脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)获得的alpha-L-岩藻糖苷酶多肽，编码alpha-岩藻糖苷酶多肽的多核苷酸，以及其制备方法和应用。

本发明的岩藻糖苷酶包含alpha-L-岩藻糖苷酶水解糖缀合物，这些糖缀合物可以是寡糖链，糖肽，糖蛋白或者糖脂等。

本发明所述的岩藻糖苷酶的氨基酸序列为下列两种任选一种：

a)具有如SEQ ID NO1所示序列：

或者

b)与SEQ ID NO1所示序列具有70％以上的同源性并且具有岩藻糖苷酶活性。

本发明提供了一种重组载体，包含编码所述的岩藻糖苷酶核苷酸序列或者同SEQID NO 2。

作为实施例的优选方式，所述的岩藻糖苷酶基因连接在pET28a载体上。

本发明提供了一种包含重组载体的工程菌，

作为实施例的优选方式，所述的工程菌为生产岩藻糖苷酶的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供了一种编码所述岩藻糖苷酶基因的表达及克隆方法，作为实施例的优选方法，将目的基因克隆至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌中表达，通过亲和层析、超滤的方法获得纯化的岩藻糖苷酶。

本发明提供了上述岩藻糖苷酶的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)获得并扩增权利要求1所述的岩藻糖苷酶的基因序列；

2)构建含所述岩藻糖苷酶的重组载体；

3)表达权利要求1所述的岩藻糖苷酶；

4)分离纯化并鉴定。

所述的表达的系统可以是细菌、酵母或者昆虫表达系统。

所述的生产方法包括常规的微生物发酵生产，利用生物工程技术在细菌、酵母、昆虫表达系统中的表达和生产。

另一方面，本发明提供了所述的岩藻糖苷酶的用途和使用方法。

本发明进行了实验，实验表明，所述岩藻糖苷酶不仅对人工合成的显色底物pNP-fuc(除特别说明外，本发明中pNP-Fuc一词等同于pNP-α-L-Fuc)有水解酶活性，还能对寡糖链上的岩藻糖有水解活性，更可以催化水解糖蛋白上糖链的岩藻糖。

所述岩藻糖苷酶能水解人工合成岩藻糖基底物，在一些实施例中，该人工合成岩藻糖基底物可以是对硝基苯-α-L岩藻糖苷(pNP-α-L-Fuc)。

所述岩藻糖苷酶水解含岩藻糖残基的寡糖链，在一些实施例中，该寡糖链可以是奶源寡糖链或者血液抗原寡糖。

所述奶源寡糖或者血液抗原寡糖可以是HMO或者Lewis寡糖，在一些实施例中HMO或者Lewis寡糖可以是3-F,或者Lewis X。

所述糖蛋白可以是N-糖蛋白，也可以是O-糖蛋白，在一些实施例中，该N-糖蛋白可以是N-糖蛋白，可以是含有核心α1,3岩藻糖糖链的糖蛋白，也可以是含核心α1,6岩藻糖糖链的糖蛋白。

在一些实施例中，所述N-糖蛋白可以是：辣根过氧化酶(HRP),蜂毒磷脂酶(PLA2),或者免疫球蛋白，所述O-糖蛋白可以是：牛胃黏蛋白(mucin)

本发明中，使用时可以是采用水解酶的反应，酶解去除糖蛋白核心岩藻糖，在一些实施例中，该使用方法可以使用本发明所述岩藻糖苷酶或者其他具有同功能的酶。

本发明中，所述的该酶作用的底物主要包括3种不岩藻糖修饰的底物:人工合成的显色底物，寡糖和糖蛋白；经使用结果显示，从所述的简单到复杂的底物，所述的该酶均能有效的酶切，表现水解岩藻糖底物的活性，同时还有操作简便、酶切效率高等特点，由于糖蛋白的岩藻糖基化在许多的生物进程中发挥着着重要作用，本发明中的酶可用于糖链结构和糖基化程度的分析、岩藻糖基化对蛋白质功能的影响、病原体与宿主表面识别过程中岩藻糖的功能等方面的研究，并具有过敏原和抗体的去核心岩藻糖基化的潜在工业和医疗应用价值。

附图说明

图1：不同岩藻糖基化修饰的N-糖链示意图。

图2：Cfus对底物pNP-Fuc的酶动力参数。

图3：Cfus对底物pNP-Fuc的反应PH范围。

图4：Cfus对底物pNP-Fuc的反应温度范围。

图5：变性剂或还原剂对Cfus的酶活影响。

图6：离子对Cfus的酶活影响。

图7：Cfus对寡糖的酶切结果(L-Fucose kit试剂盒检测)。

图8：Cfus对寡糖的酶切结果(质谱检测)。

图9：Cfus对HRP的酶切结果(考染，westen blot,lectin blot检测)。

图10：Cfus对HRP的酶切结果(质谱检测)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、生物化学等常规技术，这些技术均是本领域技术人员所熟知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《蛋白质纯化》((Richard R.Burgess)，或者可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

本发明中，酶切反应的具体步骤如下：

1.酶切反应的试剂准备

(1)试剂反应所需要的缓冲液

用于SDS-PAGE鉴定结果：10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)

用于显色底物pNP-Fuc，寡糖链和糖蛋白糖链酶切反应：25mM的磷酸二氢钠溶液(pH＝4.6)；除特别说明，以下简称的磷酸缓冲液即指本缓冲液。

反应底物的制备

本发明中使用三类底物进行该酶活性的证明，

1.显色底物pNP-α-L-Fuc，购置于英国carbosynth公司；

2.3-F,Lewis X寡糖购置于英国carbosynth公司；

3.糖蛋白辣根过氧化物酶(HRP)购买于sigma公司；

底物pNP-α-L-Fuc和各寡糖用超纯水复融，作为保存液，糖蛋白HRP则配置成10mg/ml的浓度保存；

显色底物pNP-α-L-Fuc和寡糖不需要进行加热处理，HRP则以25mM的磷酸二氢钠溶液(pH＝4.6)配置浓度约0.5mg/ml，并加DTT使得终浓度为10mM，93℃加热10min，热变性；

2.酶切反应条件

(1)反应温度：本实验除另有说明，即除在做酶最适温度外，其他反应温度均为37℃；

(2)反应时间：显色底物pNP-α-L-Fuc反应1h或者15min(仅在测酶动力参数的反应时间)，寡糖反应时间为1h。糖蛋白底物经热变性处理后，2-4d；

3.酶切结果的鉴定

a)显色底物酶切反应：

显色底物pNP-α-L-Fuc酶切反应：磷酸缓冲液49ul，显色底物pNP-α-L-Fuc母液(10mM)10ul,酶1ul，混匀，共计60ul，37℃反应1h，反应结束，加90ul 1M Na₂CO₃终止酶切反应，酶标仪测OD＝405nm值；

b)寡糖酶切反应：酶用磷酸缓冲液做5倍稀释，磷酸缓冲液12.5ul，寡糖(10mM)保存液1.5ul，稀释后的酶1ul，共计15ul，37℃，1h或者3h。其中反应1h的反应液用L-fucosekit检测试剂盒进行fucose的检测，

反应3h的反应液，进行ESI-MS；

c)糖蛋白酶切反应：HRP以磷酸缓冲液配置60ul体系，加HRP保存液3ul，浓度0.5mg/ml,并加DTT至浓度10mM，93℃加热10min变性后，室温冷却，加酶3ul，37℃酶切反应1-3天。进行SDS-PAGE,westen blot，lectin blot检测；另用于质谱检测的酶切反应体系如实施例所述；

d)SDS-PAGE：制备分离胶浓度为10％的胶，恒压100V 1.5h左右；

e)染色：电泳结束后，考马斯亮蓝染色，染色结束后脱色并拍照；

f)Westen blot：SDS-PAGE胶结束，将PAGE胶蛋白转至0.45umPVDF膜(merckMillipore)，220mA，65min。转膜结束后，以0.5％脱脂牛奶封闭1h，随后用兔抗HRP多克隆抗体孵育1h，孵育结束，PBST洗膜四次，每次五分钟，采用鼠抗兔二抗孵育1h，孵育结束，PBST洗膜四次，每次五分钟，显色：ECL化学发光液进行发光(Thermo Fisher)，并拍照；

g)Lectin blot：SDS-PAGE胶转膜方法同westen blot，转膜结束后，以carbo-free(购买于Vector Laboratories)封闭液封闭1h，封闭结束，以碱性磷酸酶标记的凝集素AAL进行孵育1h，孵育结束，PBST洗膜四次，每次五分钟。最后用CDP-star进行化学发光显色；

h)质谱检测：具体方式详见各实施例。

实施例1：岩藻糖苷酶活性鉴定以及酶学性质实验

1.岩藻糖苷酶活性鉴定

反应底物的制备：底物pNP-α-L-Fuc冻干粉(购买于carbosynth公司)用蒸馏水复融，浓度10mM，作为保存液保存。

酶切反应缓冲液：25mM磷酸二氢钠(PH4.5-5.0)

酶切体系：底物pNP-α-L-Fuc保存液10ul，酶1ul，加入磷酸缓冲液补齐至60ul体积。如下表，编号1作为实验组，编号2作为对照组。

表1.反应体系的配置

反应条件：37℃，1h，反应结束后，立即加1M Na₂CO₃ 90ul，终止反应，并用酶标仪进行OD＝405nm测定；

根据上述结果判断酶是否具有岩藻糖苷酶活性。

对于酶动力参数的测定：

标曲：配置浓度为10mM的pNP(对硝基苯酚)，作为保存液，以磷酸缓冲液稀释至1mM，随后以1mM做对倍稀释至0.007813mM，一共八个浓度梯度，在96孔板中每孔取59ul，并添加1ul磷酸缓冲液。每个样品去重复三次，作为标准曲线；

反应体系：以磷酸缓冲液对pNP-α-L-Fuc保存液进行稀释，做0.05,0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mM的浓度梯度，在96孔板中各孔加入梯度稀释的反应液59ul，每孔中加酶1ul，每个样做三次重复；

反应条件：37℃恒温，15min，反应结束，立即加1M Na₂CO₃ 90ul，终止反应，并用酶标仪进行OD＝405nm测定；

结果处理：酶动力参数Km，Kcat，Vmax等常数通过GraphPad Prism(La Jolla，CA)软件进行非线性回归统计得到；

结果如图2所示:对底物pNP-Fuc的酶切最大反应速率为0.18uM/s，Km＝709.4uM。

2.测定岩藻糖苷酶的最适PH值

岩藻糖苷酶的最适PH值的测定，根据中华药典的记录配置PH3.0-11.0的缓冲液，并根据上述的反应条件进行实验，每个PH值都进行三次重复，结果如图3：PH在4左右对底物pNP-Fuc有最大酶切活性；

3.测定最适反应温度

按照本实施例中上述的实验方法，验证酶在4,20,30,37,45,55,65,75℃共计八个温度梯度下的酶活性，为保证实验的可靠性，所有的加样操作均在4℃下进行，最后加入酶后，立即放入相应温度的水浴锅中，所有实验进行三次重复，结果如图4所示：温度在55℃左右有最大酶活，在37℃活性也较大；

4.测定还原剂和变性剂对酶活的影响

按照本实施例中上述方法，在反应体系中加入变性剂尿素，SDS和还原剂DTT，使得各自浓度最终为0.1M,0.1％,10mM，所有实验进行三次重复，结果如图5所示：三种物质中，SDS几乎完全是的酶活性丧失，而其他两种对酶活无明显影响；

5.测定金属离子对糖苷酶活性影响

配置浓度为1M的K⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Fe²⁺，Cu²⁺以及EDTA，作为保存液，按照上述实验方法，分别加入各相应离子或者EDTA，使得各最终浓度均为5mM，所有的实验均进行平行的三次重复，结果如图6所示：Cu2+对酶有极强的活性抑制作用，在5mM几乎丧失活性，而Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺对酶活性有部分增强作用。

实施例2：寡糖的酶切实验

底物的配置：将寡糖3-Fucosyllactose(3FL)，Lewis x trisaccharide(Lex)，用超纯水配置为10mM的浓度；

反应体系：磷酸缓冲液8ul，寡糖保存液1ul，酶1ul，共计10ul的反应体系，37℃反应1h；

酶切反应的检测：检测寡糖酶切后再产物在本实施例中使用两种方法：

方法1：根据L-岩藻糖检测试剂盒(megazyme，爱尔兰)进行检测，具体方法参见试剂盒手册，该试剂盒利用岩藻糖脱氢酶将岩藻糖氧化，并将NADP+生成NADPH，而NADPH可通过340nm的吸光值进行测量并根据标曲进行定量，从而对酶切寡糖下来的岩藻糖进行定量；

方法2：根据质谱进行检测，将10ul反应液加入超纯水400ul，进行ESI-MS(ThermoFisher),选用阳离子模式，电压3500V；

结果如图7，8所示：Cfus在所酶切寡糖之后，检测到对a1,3糖苷键连接的两种寡糖3-Fucosyllactose和Lewis x trisaccharide有明显的酶切活性，表明其具有α1,3岩藻糖苷酶活性。

实施例3：糖蛋白的酶切实验

SDS-PAGE反应体系配置：用超纯水溶解辣根过氧化物酶(HRP)冻干粉，浓度为10mg/ml并作为母液保存，以每管：2ulHRP，6ul 0.1M的DTT，加磷酸缓冲液补齐至58ul，共配置五个反应体系，编号1-5，93℃加热10min，热变性，离心10s，放置室温冷却，其中在2和4号加入Cfus酶2ul，1,3,5加入磷酸缓冲液2ul，体系配置如表2所示；

表2反应体系配置

质谱检测的反应体系配置：取磷酸缓冲液680ul，加入20ulHRP母液，0.1M的DTT80ul，93℃加热10min，待冷却后分装两管，每管390ul，实验组加入Cfus酶10ul，对照组加入磷酸缓冲液10ul；

反应条件：37℃，2-4天；

反应结束后在PAGE反应体系的3和4号加入2ulPNGaseF(NEB公司)，5号加入PNGaseF-II 2ul(由本实验鉴定，2mg/ml，)，PNGaseF-II能完整的切除HRP上具有核心α1,3岩藻糖的糖链，作为阳性对照，并在1和2号样本中加入磷酸缓冲液2ul，37℃反应过夜(12h左右)，反应结束后进行下列检测方法一；

质谱检测反应体系在反应结束后，在实验组和对照组中均加入10ulPNGaseF-II，37℃过夜(12h左右)，在0.5ml超滤管(Merck Millipore)加入500ul超纯水，12000g离心10min，洗净超滤管上的甘油，倒掉管中剩余的水，反应结束后，将反应液加入洗净超滤管，12000g离心10min，收集滤液，将滤液真空干燥。-20℃冻存。进行下列检测方法二；

酶切检测：本实施例中检测方法采用下述两种：一种是westen blot和lectinblot，另一种是质谱检测；具体方式如下：

检测方法一：

反应完成后，加入SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热10min，待冷却；

SDS-PAGE：制备分离胶浓度为10％的胶，上样20ul。恒压100V 1.5h左右；

染色：电泳结束后，考马斯亮蓝染色，染色结束后脱色并拍照；

Westen blot：本发明所使用的一抗是兔来源的抗HRP多抗(LifeSpanBioScience，Seattle,WA)，根据抗体说明：其中核心α1,3岩藻糖作为抗多克隆抗体识别的主要表位，故可利用该抗体进行核心α1,3岩藻糖糖基化修饰的检测；SDS-PAGE胶结束，将PAGE胶蛋白转至0.45umPVDF膜(merck Millipore)，220mA，65min，转膜结束后，以0.5％脱脂牛奶封闭1h，随后用兔抗HRP抗体孵育1h，孵育结束，PBST洗膜四次，每次五分钟；采用HRP标记的鼠抗兔二抗孵育1h，孵育结束，PBST洗膜四次，每次五分钟，显色：ECL化学发光液进行发光(Thermo Fisher)，并拍照；

Lectin blot：SDS-PAGE胶转膜方法同westen blot，转膜结束后，carbo-free(Vector Laboratories)封闭液封闭1h，封闭结束，以碱性磷酸酶标记的凝集素AAL(VectorLaboratories)进行孵育1h，因为AAL凝集素能特异的识别岩藻糖，故可利用该凝集素进行HRP上岩藻糖修饰的检测，最后用CDP-star进行化学发光显色；

检测方法二：将干粉复融，超纯水100ul，进行ESI-MS(TSQ Quantiva triplequadrupole Mass Spectrometer,Thermo Fisher,MA,USA),选用阳离子模式，电压3500V；

结果如图9，10所示：通过WB和lectin的实验结果证明，Cfus能将其核心α1,3岩藻糖切除，并通过质谱得到进一步确认。

实施例4：岩藻糖苷酶的生产过程

岩藻糖苷酶基因序列来自前期完成的脑膜炎败血伊丽莎白金菌FMS-007菌株的全基因组测序数据，本实施例中利用Glimmer 3.0软件进行基因预测，COG、KEGG、GO对基因进行功能注释，获得一段开放读码框(open reading frame，ORF)，该段序列长度为1443bp，编码480个氨基酸，分子量约为56kDa，经SignalP 4.1软件预测前面的25个氨基酸可能为信号肽，26-480个氨基酸为成熟肽段，通过NCBI的对其保守区域的预测，认定为岩藻糖苷酶；

采用基因工程的方法，将目的基因克隆至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌中表达，通过亲和层析、超滤的方法获得纯化的新型糖苷酶；

1.1生产的方法及过程

1.1.1岩藻糖苷酶基因重组质粒的构建策略

根据FMS-007基因组测序数据得到岩藻糖苷酶基因序列，以FMS-007的基因组DNA为模板，PCR扩增产物定向克隆到业界常用的原核表达载体，如PET系统的表达载体PET15、PET32、PET28等，选常用的多克隆酶切位点将目的基因插入到表达载体上，构建重组质粒，构建后与其蛋白的表达结果如图所示；

1.1.2岩藻糖苷酶基因的PCR扩增

岩藻糖苷酶基因的PCR扩增的反应体系按照表3配制，混匀，扩增参数为98℃10s，52℃5s，72℃20s，34个循环，72℃5min 1个循环，100V恒压电泳40min，用凝胶成像系统拍照；岩藻糖苷酶的引物序列如下：

上游引物2159-F：

5’-TCGCTAGCCATAATGTTTCAGCGGGGTATG-3’(SEQ ID NO 3)

下游引物2159-R：

5’-CGCTCGAGAAACAGACAGCAACTAATAAAGCC-3’(SEQ ID NO 4)

表3岩藻糖苷酶PCR扩增体系

1.1.3岩藻糖苷酶PCR产物的定向克隆

(1)岩藻糖苷酶的PCR产物及pET28a载体双酶切

用两个限制性内切酶Nhe I和Xho I双酶切PCR产物，根据纯化后的目的基因Cfus及载体的浓度按照表4配制酶切体系，混匀后37℃酶切1h。酶切结束后，使用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物，按操作步骤载体双酶切后，电泳后割胶回收，按照操作步骤胶回收试剂盒；

表4 PCR产物/质粒DNA的双酶切体系

(2)Cfus基因和载体的连接

根据双酶切纯化后的Cfus浓度以及原核表达载体的浓度，使两者的摩尔比约为1:5，按照表5配制连接体系，混匀后22℃连接20min；

表5 Cfus基因和pET-28a(+)载体连接体系

(3)连接产物的转化

质粒转化至感受态细胞的主要原理是，细菌在0～4℃的CaCl₂低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态，42℃热激促进吸收外源DNA；将(2)转化连接产物20ul全部转化至E.coli Top10感受态细胞，按如下步骤：

1)从-80℃冰箱中取50μl感受态细胞，于冰浴上融化，加入20μl连接产物，轻弹混匀，冰浴放置30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程不要摇动管；

3)向管中加300μl灭菌LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃下200rpm振荡培养1h，使细菌复苏；

4)将菌液5000rpm离心2min，吸头弃去一半上清液(约150μL)，用枪头将沉淀轻轻吹起混匀，然后全部菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上。倒置平板，37℃过夜培养(约12h)；

5)待平板长出菌落后，分散选取8个单菌落在平板底部标记，将每个菌落挑入5mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃200rpm振荡培养10～14h；

(4)重组质粒的抽提

使用质粒小提试剂盒(Axygen生物公司)提取质粒，按如下步骤：

1)将收集3ml菌液，室温12000rpm离心1min，尽量吸去上清，留取沉淀；

2)向上一步的沉淀中加入250μl Buffer A1(确保加入了RNase A)，用移液器或涡流振荡充分悬浮细菌细胞；

3)再向离心管中加入250μLBuffer B1(预先加入RNase A)，温和地上下翻转10次使菌体混合均匀，然后静置5min至溶液粘稠而澄清；

4)再向离心管中加入350μL Buffer N1，立即温和地上下翻转多次混匀，此时出现白色絮状沉淀；

5)室温12000rpm离心10min，如果上清中还有白色沉淀，可再次离心；

6)小心吸取离心后的上清液，转入带有收集管的DNA柱中，注意避免吸到沉淀，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

7)再向DNA柱中加入500mL Buffer KB，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

8)向离心柱中加500μL DNA wash buffer(确保加入乙醇)，室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

9)重复上一步操作；

10)将离心柱放回离心机中，室温12000rpm开盖离心5min，除去残余的乙醇；

11)将离心柱转至新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中央悬空滴加70μLElutionBuffer，室温放置5min，12000rpm离心1min，将洗脱液重新滴加到吸附膜中央，12000rpm离心1min，收集含有质粒的洗脱液；

12)质粒提取后，用NANODROP 2000检测产物的浓度及纯度；

(5)重组质粒的双酶切鉴定

对上一步提取的质粒DNA用构建克隆所用的两个限制性内切酶进行双酶切鉴定，依据测定的质粒浓度，按照表6配制酶切体系，37℃酶切1h。剩余的质粒保存备用；

表6双酶切鉴定的反应体系

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，DNA Marker使用DL2000和λ-Hind III(使用前60℃加热5min)；

(6)重组质粒的测序

根据琼脂糖凝胶电泳结果，选择双酶切阳性的质粒，送检至华大基因公司测序。

1.2.1 Cfus的原核表达

1.2.1.1重组质粒转化

本试验选择的表达宿主菌为E.coli BL21(DE3)，该菌以T7RNA聚合酶介导的高效表达外源基因的蛋白表达宿主；经测序验证正确的Cfus重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，按如下步骤：

1)从-80℃冰箱中取50μl感受态细胞，于冰浴上融化，再加入1μl重组质粒，轻弹混匀，冰浴放置30min；

2)42℃水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程注意不要摇动管；

4)用移液器将200ul菌液涂布到含50μg/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基上，倒置平板，37℃过夜培养(约12h)；

1.2.1.2 Cfus蛋白表达

先在没有诱导物的条件下，细菌进入最佳生长状态时，向培养基中加入诱导物IPTG，与阻遏蛋白结合解除抑制，使外源基因大量表达；

诱导步骤如下：

1)选取含Cfus重组质粒的BL21和空载体为对照，挑单菌落，并分别接种至5ml LB培养基(含10-200μg/ml卡那霉素)中，37℃，200rpm振荡培养10-12h，取样100ul至1.5ml离心管，-20℃保存，用于SDS-PAGE；

2)分别向菌液中加入IPTG(终浓度在0.1-10mM)，16-37℃，200rpm振荡培养12h，诱导目的基因Cfus表达；

3)诱导前和诱导后的菌液分别取100μL，12000rpm离心1min，弃上清。

4)向沉淀中加100μL 1×PBS重悬菌体，吹吸混匀。每管中再取出30μL 于新的离心管中，分别加入7.5μL 5×SDS上样缓冲液，95℃煮10min；

5)使用Unstained Protein MW Marker用作对照，使用前95℃煮10min；

6)再将样品于12000rpm离心10min；

7)取15μL上清样品点样，先用15mA进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑至分离胶时，将电流调成30mA电泳使溴酚蓝跑到凝胶边缘；

8)考马斯亮蓝染色1h，脱色液脱色2h，脱色两次。拍照保存结果；

1.2.2 重组蛋白Cfus的纯化

重组蛋白Cfus的纯化经过两个步骤，第一步为镍柱亲和层析，第二步超滤。纯化的所有操作均在4℃下进行；

A.镍柱纯化

1)含重组质粒的单克隆挑至5ml的LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，10～14h后吸取5ml转入装有500ml LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)三角瓶中，37℃，200rpm振荡培养6-8h。待温度降至18℃，加入1M IPTG,终浓度为0.5mM,18℃，150rpm振荡培养12h；

2)将上述诱导的菌液分别加入两个大离心管中，用1×PBS配平后，4℃，5000rpm离心10min，尽量吸去上清；

3)向上一步的沉淀中加入200mL 1×PBS洗涤细菌细胞，4℃，5000rpm离心10min；

4)去上清，两管中分别加入7.5mL Lysis Buffer(10mM咪唑，pH 8.0)充分重悬菌体；

5)利用超高压均质机(型号：FB-110X,上海励途机械设备工程有限公司，上海)进行菌体破碎；

6)将细菌裂解物液于4℃，12000rpm离心30min，小心轻轻取上清，避免吸起沉淀，缓慢沿壁转入新的离心管中；

7)使用Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，先加3倍柱体积的0.5M NaOH洗柱(柱再生)；再用3～5倍柱体积的Lysis Buffer洗柱(平衡柱)；平衡后将上一步的上清液加入柱中，待液体快流完时，分别用Wash Buffer(25mM咪唑，pH 8.0)和Elution Buffer(300mM咪唑，pH 8.0)淋洗，依次收集不同的洗脱液，收集到的目的蛋白保存在4℃；

8)将所有收集到的样品进行SDS-PAGE鉴定，均取10μl点样；

9)使用10kD的超滤管对目的蛋白进行超滤纯化；

10)利用BCA法检测目的蛋白的浓度，根据已知浓度的各种蛋白标准品，使用TECAN酶标仪，通过制作标准曲线检测目的蛋白的浓度；

2结果显示：

2.1 Cfus/pET28a重组质粒构建

将目的基因PNGF2片段克隆至pET28a载体上，通过测序，验证成功构建重组质粒；

2.2 IPTG诱导表达

重组的阳性克隆经测序鉴定正确后，转化至E.coli BL21，随机挑选两个单克隆分别接种至LB培养基中，加入0.5mMIPTG诱导表达，18℃，150rpm，诱导12h后取样。进行SDS-PAGE，考染观察表达情况；

重组蛋白PNGF2的纯化

重组蛋白PNGF2经过镍柱亲和层析纯化后，可得到较纯的蛋白，纯度大于90％。满足普通的生化酶切实验。

本发明提供了一种岩藻糖苷酶糖苷酶，尤其是具有去核心岩藻糖基化功能的糖苷酶。本酶主要用于糖蛋白的去核心岩藻糖基化但不限于去核心岩藻糖基化，为糖生物学研究提供了一种新的工具酶，并为开发糖缀合物相关产品提供有力工具，同时也为治疗由核心岩藻糖基化诱导的过敏性疾病提供了潜在的治疗工具。

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

<120>一种核心岩藻糖苷酶及其制备和应用

<130>

<210> 1

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Leu Ile Lys Gln Lys Thr Lys Thr Leu Phe Leu Ser Ala

Ile Phe Ile Ser Thr Asn Phe Phe Ser Gln Ala His Asn Val

Ser Ala Gly Tyr Glu Lys Pro Lys Asp Pro Leu Val Val Asn

Asn Leu Glu Glu Trp Gln Asp Leu Lys Phe Gly Leu Phe Met

His Trp Gly Thr Tyr Ser Gln Trp Gly Ile Val Glu Ser Trp

Ser Leu Cys Pro Glu Asp Glu Ser Trp Thr Gln Arg Lys Pro

Glu His Gly Lys Ser Tyr Tyr Glu Tyr Val Lys Asn Tyr Glu

Asn Leu Gln Thr Thr Phe Asn Pro Val Gln Phe Asn Pro Gln

Lys Trp Ala Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Met Lys Tyr Val

Val Phe Thr Ala Lys His His Asp Gly Phe Ala Met Phe Asp

Thr Lys Glu Ser Asp Tyr Lys Ile Thr Ser Ser Lys Thr Pro

Phe Ser Lys Asn Pro Lys Ala Asp Val Thr Lys Glu Ile Phe

Asn Ser Phe Arg Lys Asp Gly Phe Lys Ile Gly Ala Tyr Phe

Ser Lys Pro Asp Trp His Asn Asp Asn Tyr Trp Trp Ser Tyr

Phe Pro Pro Lys Asp Arg Asn Val Asn Tyr Asp Pro Lys Lys

Tyr Pro Glu Lys Trp Ala Ser Phe Lys Lys Tyr Thr Phe Asn

Gln Leu Asn Glu Ile Thr Ser Asn Tyr Gly Lys Ile Asp Ile

Leu Trp Leu Asp Gly Gly Trp Val Arg Pro Phe Lys Thr Ile

Asp Pro Thr Val Glu Trp Gln Lys Thr Ile Lys Val Glu Gln

Asp Ile Asp Met Asp Arg Ile Gly Glu Met Ala Arg Arg Asn

Gln Pro Gly Ile Ile Ile Val Asp Arg Thr Val Pro Gly Lys

Trp Glu Asn Tyr Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile Pro Glu His

Asn Leu Ser Ile Pro Trp Glu Ser Cys Ile Thr Met Gly Asn

Ser Phe Ser Tyr Val Pro Asn Asp Asn Tyr Lys Ser Ser Gln

Lys Ile Val Glu Thr Leu Ile Lys Ile Ile Ser Arg Gly Gly

Asn Tyr Leu Met Asn Ile Ala Pro Gly Pro Asn Gly Asp Tyr

Asp Ala Val Val Tyr Glu Arg Leu Lys Glu Ile Ser Gly Trp

Ile Asp Ile Asn Lys Thr Ala Val Tyr Gly Thr Arg Ser Ile

Ala Pro Tyr His Glu Asn Asp Phe Tyr Tyr Thr Arg Ser Lys

Asp Gly Lys Thr Ile Asn Val Phe His Ile Asn Glu Ala Ser

Asn Tyr Gln Ala Pro Asn Asp Leu Thr Phe Thr Leu Pro Glu

Asn Phe Gln Pro Lys Lys Leu Gln Ile Leu Gly Ile Glu Ser

Lys Val Ser Trp Lys Lys Gln Gly Asn Lys Ile Lys Val Gln

Leu Pro Lys Glu Cys Asn Lys Leu Lys Tyr Ser Thr Val Ile

Gln Ile Thr Gln

<210> 2

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列

ATGTTAATTAAACAAAAAACTAAAACCTTATTCTTATCAGCAATTTTTAT

TTCGACTAATTTTTTTTCACAGGCTCATAATGTTTCAGCGGGGTATGAAA

AACCAAAAGATCCCTTAGTTGTCAATAATCTTGAAGAATGGCAAGATTTG

AAATTTGGACTTTTTATGCATTGGGGTACATACAGCCAGTGGGGGATTGT

AGAAAGCTGGAGCTTATGTCCGGAAGATGAATCCTGGACGCAAAGAAAGC

CCGAGCATGGCAAATCTTACTATGAGTATGTGAAAAATTATGAAAATCTT

CAGACAACATTTAATCCTGTACAGTTTAATCCACAGAAATGGGCAGATGC

AGCAAAAAAAGCAGGTATGAAATATGTTGTCTTTACAGCAAAACATCACG

ATGGTTTTGCAATGTTTGATACCAAAGAATCTGATTATAAAATTACCTCT

TCTAAAACACCTTTTTCAAAGAATCCAAAGGCTGATGTAACGAAAGAGAT

TTTTAATTCATTCAGAAAAGACGGATTTAAAATAGGGGCATATTTTTCAA

AACCAGATTGGCATAACGATAATTATTGGTGGTCATATTTTCCGCCAAAA

GACAGAAACGTAAATTATGATCCGAAGAAATATCCGGAAAAGTGGGCAAG

CTTTAAAAAATATACATTCAATCAGCTTAATGAGATAACATCAAATTATG

GCAAAATAGATATCCTCTGGCTGGATGGAGGATGGGTGAGACCTTTCAAA

ACAATTGATCCTACTGTAGAGTGGCAAAAAACAATTAAAGTAGAGCAGGA

CATTGATATGGATAGAATTGGAGAGATGGCACGCAGGAACCAGCCAGGTA

TTATTATCGTAGATAGGACAGTTCCCGGTAAGTGGGAAAATTATGTAACC

CCCGAACAGGCTATTCCTGAACACAATCTTTCAATTCCATGGGAAAGCTG

TATTACAATGGGAAATTCTTTTTCATATGTGCCAAACGATAATTATAAAT

CTTCTCAAAAAATTGTGGAAACCTTAATTAAAATTATTTCCAGAGGCGGG

AACTACCTAATGAATATTGCACCGGGACCGAATGGAGATTATGATGCTGT

CGTTTATGAACGTTTGAAAGAAATTTCCGGCTGGATTGATATCAATAAAA

CTGCCGTTTATGGCACAAGAAGTATAGCGCCATATCATGAGAATGATTTT

TATTACACCCGGAGTAAAGATGGAAAAACAATTAATGTATTTCATATAAA

TGAGGCCTCAAATTATCAGGCACCTAACGATCTTACCTTTACACTACCAG

AGAACTTTCAGCCGAAGAAACTACAGATTCTTGGTATAGAATCTAAGGTC

TCATGGAAGAAACAGGGGAATAAAATTAAGGTTCAACTTCCTAAAGAATG

CAATAAGCTAAAGTATTCAACAGTAATCCAAATAACACAGTAA

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcgctagccataatgtttcagcggggtatg

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgctcgagaaacagacagcaactaataaagcc

Claims

1.一种岩藻糖苷酶，其特征在于，所述的岩藻糖苷酶的氨基酸序列为下列两种任选一个：

a)具有如SEQ ID NO 1所示的序列；

或者

b)与SEQ ID NO 1所示的序列具有70％以上的同源性并且具有岩藻糖苷酶的活性。

2.一种编码岩藻糖苷酶的核酸，其特征在于，所述的核酸具有如SEQ ID NO 2所述的序列。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的核酸。

4.按权利要求1所述的岩藻糖苷酶，其特征在于，所述的岩藻糖苷酶能水解pNP-α-L-Fuc。

5.按权利要求1所述的岩藻糖苷酶，其特征在于，所述的岩藻糖苷酶能水解含有岩藻糖残基的寡糖。

6.按权利要求1所述的岩藻糖苷酶，其特征在于，所述的岩藻糖苷酶能水解糖蛋白糖链上的岩藻糖。

7.权利要求1所述的岩藻糖苷酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：将目的基因克隆至原核表达载体中，再转化至大肠杆菌中表达，通过亲和层析、超滤的方法获得纯化的岩藻糖苷酶，按下述步骤：

1)获得并扩增权利要求1所述的岩藻糖苷酶的基因序列；

2)构建含有权利要求1所述的岩藻糖苷酶的基因序列的重组载体；

3)表达权利要求1所述的岩藻糖苷酶；

4)分离纯化并鉴定。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达的系统是细菌、酵母或者昆虫表达系统。

9.权利要求1所述的岩藻糖苷酶在制备用于切除糖蛋白糖链上岩藻糖的酶切制剂中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的糖蛋白底物是HRP糖蛋白，所述的糖蛋白糖链的接点是带有由核心α1,3糖苷键连接的岩藻糖。