CN100999758A - α－L－岩藻糖苷酶活性测定方法及α－L－岩藻糖苷酶诊断试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清α－L－岩藻糖苷酶活力测定方法及试剂。所要解决的技术问题是该测定方法及试剂应具有测定时间短、抗干扰性好、操作简便、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。技术方案是：α－L－岩藻糖苷酶活性测定方法，采用6－甲基－2－硫代吡啶－α－L－岩藻糖苷为底物，在样本中α－L－岩藻糖苷酶的作用下，生成6－甲基－2－巯基吡啶；通过测定6－甲基－2－巯基吡啶在340nm处吸光度的增加速率求出样本中α－L－岩藻糖苷酶的活力。α－L－岩藻糖苷酶诊断试剂，其双试剂剂型中的试剂A或试剂B中还包括6－甲基－2－硫代吡啶－α－L－岩藻糖苷；其单试剂剂型中包括6－甲基－2－硫代吡啶－α－L－岩藻糖苷。
Description
技术领域
本发明涉及一种血清成分的测定方法及试剂，具体是血清α-L-岩藻糖苷酶(AFU)活力测定方法及试剂，属于生物制剂技术领域。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidaseα-FU)广泛分布于人体各组织，如肝、脑、肾、胰和胎盘等中，存在于细胞内，定位于溶酶体，是酸性水解酶，本质为糖蛋白，参与含岩藻糖基的糖蛋白、糖脂的分解代谢。近年来，大量的研究资料表明，血清AFU不但是原发性肝癌的标志物和诊断的可靠指标，而且还可用于临床监测肝硬化病人是否发生恶变和糖尿病病情控制的观察指标。
用来检测α-L-岩藻糖苷酶方法有荧光法、比色法和ELISA法。较为常用的是比色法，它是以对-硝基苯岩藻糖苷为底物，经α-FU催化水解，产物对-硝基酚(4-NP)在碱性溶液中显黄色，测定其吸光度，从4-NP作标准液绘制的标准曲线或用4-NP的摩尔吸光系数，推算出酶的活性。此类方法存在的缺点是因所用的测定条件颇不一致，其活性单位的表达也不一样，而且只能采用两点法，不能采用酶分析中最为合理的连续监测法。此类方法操作复杂，而且由于终止液的加入改变反应体系，可能引起新的误差，使结果的准确度受其影响。
中国专利申请文件(专利号：01139259.2)公开的一种方法，是以2-氯对硝基苯-α-L-岩藻糖苷(CNPF)为底物，样本中α-L-岩藻糖苷酶水解底物产生2氯-4硝基苯酚，通过在405nm处监测反应的速率而计算出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活力。该方法也存在以下不足：一、使用色源性底物2-氯对硝基苯-α-L-岩藻糖苷(CNPF)，该底物在液体状态下随时间的延长而分解变黄色，导致试剂空白偏高，试剂线性受其影响，二、该方法是在405nm监测，易受胆红素、脂浊和血红蛋白的干扰，特别是黄疸和溶血样本测定结果常出现负数，给临床诊断带来极大的不便，三是反应灵敏度不高，低值重复性不理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种α-L-岩藻糖苷酶活力测定的方法及试剂的改进，所提供的测定方法及试剂应具有测定时间短、抗干扰性好、操作简便、适用于各种类型的全自动生化分析仪的特点。
本发明提供的技术方案是：
α-L-岩藻糖苷酶活性测定方法，采用6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷为底物，在样本中α-L-岩藻糖苷酶的作用下，分解6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷生成6-甲基-2-巯基吡啶；通过测定6-甲基-2-巯基吡啶在340nm处吸光度的增加速率求出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活力。
采用的计算公式是：
α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂，其液体双试剂剂型中的试剂A和试剂B中分别包括50-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L的稳定剂、0.1-5mmol/L的防腐剂，试剂A或试剂B中还包括0.1-30mmol/L的6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷。
α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂，其液体单试剂剂型中包括50-200mmol/L的缓冲液、0.1-5mmol/L的稳定剂、0.1-5mmol/L的防腐剂，还包括0.1-45mmol/L的6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷。
所述的试剂中还包括0.1-10mmol/L的表面活性剂。
本发明提供的方法由于在340nm处(紫外光下)检测，因而灵敏度较高，准确率较高，反应时间较短(只有5-6分钟)，并且直接在自动生化分析仪上检测，抗干扰性好，操作方法简单方便。
本发明提供的试剂由于在紫外光下检测，因而反应时间短、灵敏度高；又由于采用的是无发色团的底物，在2-8℃时可保存一年不会发生自发水解而发黄的情况。提供的体外诊断试剂盒不仅对原发性肝癌的早期诊断和疗效观察有着重要的临床意义，对肝硬化的监护以及肺癌、乳腺癌、子宫癌、糖尿病的诊断也有着重要作用；并可直接在各种类型的生化分析仪上进行检测。
具体实施方式
本发明提供的方法是在试剂中采用6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷(MPT-AFU)为底物，使其与样本中的α-L-岩藻糖苷酶(AFU)发生反应生成6-甲基-2-巯基吡啶；然后在340nm处(紫外光下)检测，通过测定6-甲基-2-巯基吡啶在340nm处吸光度的增加速率，并利用前述的计算公式求出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活力。
本发明提供的试剂盒为液体双试剂时分为试剂A(R1)和试剂B(R2)两个组份，其中组合为：
1、底物在试剂B中：
试剂A(R1)
缓冲液 50-200mmol/L
防腐剂 0.1-5mmol/L
稳定剂 0.1-20mmol/L
试剂B(R2)
缓冲液 50-200mmol/L
底物 0.1-30mmol/L
稳定剂 0.1-20mmol/L
防腐剂 0.1-5mmol/L
2、底物在试剂A中：
试剂A(R1)
缓冲液 50-200mmol/L
防腐剂 0.1-5mmol/L
稳定剂 0.1-20mmol/L
底物 0.1-30mmol/L
试剂B(R2)
缓冲液 50-200mmol/L
稳定剂 0.1-20mmol/L
防腐剂 0.1-5mmol/L
本发明为液体单试剂时包括以下组份：
缓冲液 50-200mmol/L
防腐剂 0.1-5mmol/L
稳定剂 0.1-10mmol/L
底物 0.1-45mmol/L
所述的试剂中还可加入表面活性剂0.1-10mmol/L。
试剂中的成份并不仅限于以上所述，只要能检测样品中AFU活性即可。
本发明中所述的缓冲液可以是GOOd’S缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、硼酸盐缓冲液，其PH值可在3.0-7.0，缓冲液的浓度在50-200mmol/L范围内，优选100mmol/L。
所述的稳定剂有：乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠、亚氨基二乙酸、HEDTA或盐类。
所述的防腐剂有：叠氮钠(NaN3)、抗生素、对羟基苯甲酸甲酯、山梨醇等。
所述的底物是6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷(MPT-AFU)。
所述的表面活性剂是可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，这里优选非离子表面活性剂，作为实例有：Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用，这里不作限制。
以上各种生化材料及试剂均可外购获得。
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
一、双试剂实施例
实施例1
试剂1(R1)
柠檬酸缓冲液 100mmol/L(PH：5)
防腐剂NaN3 0.5mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
试剂2(R2)
柠檬酸缓冲液 100mmol/L(PH：4.9)
底物MPT-AFU 25mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
防腐剂NaN3 0.3mmol/L
实施例2
试剂1(R1)
乙酸盐缓冲液 50mmol/L(PH：6.0)
防腐剂NaN3 0.1mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 5mmol/L
稳定剂NaCL 15mmol/L
表面活性剂聚氧乙烯苯基醚 0.1mmol/L
试剂2(R2)
乙酸盐缓冲液 200mmol/L(PH：4.2)
底物MPT-AFU 0.1mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 5mmol/L
防腐剂NaN3 0.1mmol/L
表面活性剂聚氧乙烯苯基醚 0.1mmol/L
实施例3
试剂1(R1)
GOOd’S缓冲液 200mmol/L(PH：5)
防腐剂NaN3 5mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 0.1mmol/L
表面活性剂Theist 5mmol/L
试剂2(R2)
GOOd’S缓冲液 50mmol/L(PH：4.9)
底物MPT-AFU 30mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 0.1mmol/L
防腐剂NaN3 5mmol/L
表面活性剂Theist 5mmol/L
二、单试剂实施例
实施例1
磷酸盐缓冲液 100mmol/L(PH：5.0)
稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L
底物MPT-AFU 45mmol/L
防腐剂山梨醇 12mmol/L
实施例2
柠檬酸缓冲液 50mmol/L(PH：5.0)
稳定剂亚氨基二乙酸 5mmol/L
底物MPT-AFU 25mmol/L
表面活性剂Theist 10mmol/L
实施例3
乙酸盐缓冲液 200mmol/L(PH：4.2)
稳定剂EDTA.2Na 0.1mmol/L
底物MPT-AFU 0.1mmol/L
表面活性剂聚氧乙烯苯基醚 0.1mmol/L
具体测定方法分为双试剂或单试剂操作，以下是两种试剂的基本操作方式：
双试剂基本操作：
| 加入物 | 空白管 | 样本管 | 标准管 |
| 试剂1(μl) | 200 | 200 | 200 |
| 蒸馏水(μl) | 25 | —— | —— |
| 样品(μl) | —— | 25 | —— |
| 标准酶(μl) | —— | —— | 25 |
| 混匀，37℃孵育5分钟 | |||
| 试剂2(μl) | 50 | 50 | 50 |
| 混匀，37℃延迟60秒，在波长340nm处测定吸光度3分钟，并计算平均每分钟的吸光度变化率ΔA/min. | |||
单试剂基本操作：
| 加入物 | 空白管 | 样本管 | 标准管 |
| 工作试剂(μl) | 250 | 250 | 250 |
| 蒸馏水(μl) | 25 | —— | —— |
| 样品(μl) | —— | 25 | —— |
| 标准酶(μl) | 25 | ||
| 混匀，37℃延迟90秒，在波长340nm处测定吸光度3分钟，并计算平均每分钟的吸光度变化率ΔA/min. | |||
结果计算：
储存及稳定性：本发明试剂在2～8℃避光保存可稳定一年。
Claims (5)
1、α-L-岩藻糖苷酶活性测定方法，采用6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷为底物，在样本中α-L-岩藻糖苷酶的作用下，将6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷底物分解生成6-甲基-2-巯基吡啶；通过测定6-甲基-2-巯基吡啶在340nm处吸光度的增加速率求出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活力。
2、根据权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶活性测定方法，其特征在于采用的计算公式是：
3、根据权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂，其双试剂剂型中的试剂A和试剂B中分别包括50-200mmol/L缓冲液、0.1-5mmol/L的稳定剂、0.1-5mmol/L的防腐剂，试剂A或试剂B中还包括0.1-30mmol/L的6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷。
4、根据权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂，其单试剂剂型中包括50-200mmol/L的缓冲液、0.1-5mmol/L的稳定剂、0.1-5mmol/L的防腐剂，还包括0.1-45mmol/L的6-甲基-2-硫代吡啶-α-L-岩藻糖苷。
5、根据权利要求3或4所述的α-L-岩藻糖苷酶诊断试剂，其特征在于所述的试剂A和试剂B中还包括0.1-10mmol/L的表面活性剂。
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