CN110849870A - 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 - Google Patents
一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 Download PDFInfo
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Abstract
一种N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，是由试剂R1和试剂R2组成，所述试剂R1为：柠檬酸缓冲液10～100mmol/L、底物0.1～0.3g/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L～5KU/L、氯化镁0.01～0.03g/L、稳定剂1～10g/L、防腐剂2g/L‑5g/L；所述试剂R2为碳酸钠缓冲液10～100mmol/L、曲拉通X‑100是3mL/L～5mL/L、防腐剂2g/L～5g/L。所述柠檬酸缓冲液为25℃，pH为4～5的柠檬酸缓冲液。所述底物为5‑[4‑(3‑甲氧基‑苯甲烯‑绕丹宁)]‑3‑乙酸铵‑N‑乙酰氨基‑β‑D‑葡萄糖苷。所述稳定剂选自EDTA、EDTA‑2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。所述防腐剂选自NaN3、对羟基苯甲酸甲酯、4‑氯‑3,5‑二甲基苯酚中的一种。本发明以人工合成物5‑(4‑(3‑甲基‑苯乙烯)‑绕丹‑3‑乙酸氨基‑N‑乙酰氨基‑β‑D‑葡萄糖苷作为反应底物，这种底物成本相对低廉，反应生成物显色能力强，提高了试剂的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂。
背景技术
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(简称NAG)是一种溶酶体酶，又称尿酶。广泛分布于人体各组织中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。NAG分子量约为130～140KD，在正常情况下，血清中NAG不能通过肾小球滤过从尿中排泄。尿中NAG的升高是肾脏疾病的早期表现，是肾小管损害的敏感指标。肾移植患者，尿NAG测定可早期发现排斥反应，一般在临床指征前1-3天即有尿NAG增高。80年代后期在糖尿病肾病领域的应用研究不断增加，其中值得注意的是糖尿病肾病早期尿NAG的升高可早于mALb的增加，这提示糖尿病肾小管损伤可早于肾小球损害。目前已形成一个新观点，即主张把mALb和肾小管标记蛋白(NAG等)作为早期发现和监控糖尿病合并症的常规指征。另外，尿NAG的监测在多种肾实质疾患中有不同程度的升高，是肾脏损害的较敏感指征，增高见于急慢性肾炎，休克引起的肾功能衰竭、肾病综合症、中毒性肾病等。
目前，NAG测定是应用率最高的尿液酶学诊断项目，其对肾小管损伤的反应很灵敏，此外，用尿液作为标本，是一种无创伤检查，适合于日常检验和连续动态分析，也便于人群筛查的应用。NAG在临床应用中的测定方法主要包括放免分析法、荧光分析法和紫外-可见分光光度法等，其中，分光光度法以合成色原底物为方法学主流。在NAG的作用下，底物发生分解，通过测定底物的分解产物在特定波长下的吸光度来判断NAG的浓度。但目前的底物普遍存在着稳定性欠佳、灵敏度度等缺点。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种底物稳定、灵敏度高、方便检测的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂。
一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，是由试剂R1和试剂R2组成，其特征在于，
所述试剂R1包括以下浓度的组分：
所述试剂R2包括以下浓度的组分：
碳酸钠缓冲液 10～100mmol/L
曲拉通X-100 3mL/L～5mL/L
防腐剂 2g/L～5g/L
所述柠檬酸缓冲液为25℃，pH为4～5的柠檬酸缓冲液。
所述底物为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷。
所述稳定剂选自EDTA、EDTA-2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。
所述防腐剂选自NaN3、对羟基苯甲酸甲酯、4-氯-3,5-二甲基苯酚中的一种。
本发明基本原理如下：
在37℃，pH4～5的条件下，NAG酶水解VRA-NAG(5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷)糖苷链游离出VRA(5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵)，VRA在强碱性环境中呈红色，在505nm可测出相应的吸光度变化量为酶定量。
本发明试剂的使用方法为：
使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为505nm。检测时，R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
本发明的有益效果：
1)本发明优先选择了人工合成物5-(4-(3-甲基-苯乙烯)-绕丹-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷作为反应底物，这种底物成本相对低廉，反应生成物显色能力强，提高了试剂的灵敏度。
2)在试剂R1和R2中分别使用了柠檬酸缓冲液和碳酸钠缓冲液，这两种缓冲液都是生物缓冲液，在保证缓冲能力的同时，R1缓冲液能够促进NAG酶的催化作用，R2缓冲液能够有效提高强碱性环境，保证了显色的效率。
3)在试剂的R1中加稳定剂，能够有效的螯合重金属离子，提高NAG酶的活性，能够较好的提高试剂的准确性。
4)在试剂R1中加入了氯化镁，提高NAG酶的活性，抑制其他的副反应。
5)在试剂R1中加入了抗坏血酸氧化酶，提高NAG酶的活性。
6)在R2试剂中添加了曲拉通X-100作为表面活性剂，对最后的显色反应能有很强的增效作用。
附图说明
图1为实施例1与酶联免疫吸附试验检测结果的相关性曲线。
图2为实施例2与酶联免疫吸附试验检测结果的相关性曲线。
具体实施方式
实施例1：
一种传统的PNP-NAG法检测试剂，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
R1试剂：
甘氨酸缓冲液 30mmol/L
对硝基苯-β-D-氨基葡萄糖苷 16mmmol/L
叠氮钠 1g/L
R2试剂：
pH10.2的硼砂缓冲液 100mmol/L
叠氮钠 1g/L
实施例2：
本发明的NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
R1试剂组成：
R2试剂组成：
碳酸钠缓冲液 10～100mmol/L
曲拉通X-100 3mL/L～5mL/L
防腐剂 2g/L～5g/L。
所述柠檬酸缓冲液为25℃，pH为4～5的柠檬酸缓冲液。
所述稳定剂选自EDTA、EDTA-2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。
所述防腐剂选自NaN3、对羟基苯甲酸甲酯、4-氯-3,5-二甲基苯酚中的一种。
分别将实施例1、实施例2所得试剂在具有双试剂功能的全自动生化分析仪检测使用，利用速率法进行测定。
检测使用方法：将试剂R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：
表1：实施例1、2试剂检测方法
2)干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成6等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1和实施例2所得试剂，同时对比测定血清中NAG的含量，加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－无干扰物质的样本的测定均值)/无干扰物质的测定均值×100％。
表2：实施例试剂抗干扰性能比较
由表2可以看出，实施例1和2的试剂在抗坏血酸≤60mg/dL、胆红素≤12mg/dL、丙酮酸≤20mg/L、尿酸≤800μmol/L、葡萄糖≤50mmol/L对测试结果没有明显干扰，因而本试剂的抗干扰性能较好。
3)相关性实验：利用实施例1、实施例2中的配方配制试剂，与酶联免疫吸附试验检测血清NAG进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了2种试剂分别与酶联免疫吸附试验检测结果的相关性曲线，如图1、图2所示。
表3：实施例1、2试剂与酶联免疫吸附试验检测血清对比检测结果
通过检测结果显示，实施例1试剂和实施例2酶联免疫吸附试验检测血清的NAG相关系数r分别为0.9848、0.9967，说明了实施例2中的试剂与酶联免疫吸附试验的相关性要比实施例1与酶联免疫吸附试验的相关性要好很多。
4)灵敏度实验：分别将实施例1、实施例2与酶联免疫吸附试验对9个不同浓度的样本进行检测，样本浓度由低到高，分别记录对比检测结果，如表4所示。
表4：实施例1、2与酶联免疫吸附试验检测不同浓度血清对比检测结果
通过表4中的内容可以看出，实施例1中的对于低值的样本检测结果非常的不准确，甚至出现0值，而实施例2和酶联免疫吸附试验检测结果较好，这说明实施例2检测试剂有非常高的灵敏度和准确度。
Claims (5)
1.一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，是由试剂R1和试剂R2组成，其特征在于：
所述试剂R1包括以下浓度的组分：
所述试剂R2包括以下浓度的组分：
碳酸钠缓冲液 10～100mmol/L
曲拉通X-100 3mL/L～5mL/L
防腐剂 2g/L～5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液为25℃，pH为4～5的柠檬酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于：所述底物为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷。
4.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于：所述稳定剂选自EDTA、EDTA-2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于：所述防腐剂选自NaN3、对羟基苯甲酸甲酯、4-氯-3,5-二甲基苯酚中的一种。
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