CN104297181A - 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 - Google Patents

Abstract

用于检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的试剂，所述检测试剂由试剂A和试剂B两个试剂组成，其特征在于，所述试剂A包括以下浓度的组分：PH=7.0~8.0的缓冲液50~200mmol/L；稳定剂0.5~10g/L；防腐剂0.5~2g/L；所述试剂B包括以下浓度的组分：PH=7.0~8.0的缓冲液50~200mmol/L；底物8~12g/L；稳定剂0.5~10g/L；防腐剂0.5~2g/L；本发明的检测试剂的稳定性好，各项检测指标符合标准，灵敏度高，使用方便。

Description

一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂

技术领域

本发明涉及一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体水解酶之一，分子量为140000。血液中的NAG不能通过肾小球滤膜，因此NAG在肾单位中含量较高，尤其是在近曲小管上皮细胞中。研究表明，NAG在糖尿病、高血压肾小管早期损伤、药物肾毒性以及感染、休克、肾移植排异反应等造成的急性肾小管损害中具有重要的检测价值，也是环境肾毒性物质对人群影响的排查手段之一。

目前，NAG测定是应用率最高的尿液酶学诊断项目，其对肾小管损伤的反应很灵敏，此外，用尿液作为标本，是一种无创伤检查，适合于日常检验和连续动态分析，也便于人群筛查的应用。NAG在临床应用中的测定方法主要包括放免分析法、荧光分析法和紫外-可见分光光度法等，其中，分光光度法以合成色原底物为方法学主流。在NAG的作用下，底物发生分解，通过测定底物的分解产物在特定波长下的吸光度来判断NAG的浓度。但目前的底物普遍存在着稳定性欠佳、灵敏度度等缺点。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了一种底物稳定、灵敏度高、方便检测的试剂。

本发明通过以下技术方案实现：

一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，所述检测试剂由试剂A和试剂B两个试剂组成，其特征在于，

所述试剂A包括以下浓度的组分：

PH＝7.0～8.0的缓冲液        50～200mmol/L

稳定剂                      0.5～10g/L

防腐剂                      0.5～2g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物具有以下的结构通式：

作为优选，所述试剂A与试剂B混合后，混合液中的组分具有以下浓度：

作为优选，所述缓冲液选自PBS缓冲液、TRIS缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD’S缓冲液、CAPS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种。

作为优选，所述稳定剂选自EDTA、EDTA-2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。

作为优选，所述防腐剂选自NaN₃、对羟基苯甲酸甲酯、4-氯-3,5-二甲基苯酚中的一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的检测试剂的稳定性好，各项检测指标符合标准，灵敏度高，使用方便。

附图说明

图1为本发明实施例1中底物分解前与分解后的试剂的吸收光谱图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明并不仅限于以下实施例。

本发明的检测试剂的检测原理如下：

本发明的试剂B中的底物，可以被N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)分解，分解产物是取代巯基吡啶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，通过分光光度计检测取代巯基吡啶的吸收峰强度，可以得到被分解的底物的浓度，进而得到NAG的活性，判断NAG是否偏高。

本发明的检测试剂分为试剂A和试剂B，其中试剂B中溶有底物，操作步骤如下：

1)配制试剂A和试剂B，准备尿液标本。

2)取尿液标本10μl、试剂A150μl，混匀，在37℃下孵育3～5分钟。

3)在步骤2)中的混合液中加入试剂B50μl，混匀，在37℃下孵育60秒，使用分光光度计在测定波长下，连续监测1～3分钟混合液吸光度A，计算样品的△A/min。

4)用校准品定标，NAG(U/L)＝样品的△A/min×校准品浓度。

实施例1

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝7.0的PBS缓冲液       50mmol/L

乙二醇                   2g/L

NaN₃                     1g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物具有以下的结构式(以下简称3-Cl-5-TFMPT-NAG)：

按照实施方式中的操作步骤，对实施例1中的检测试剂进行进行处理，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，实验结果如下：

1)空白吸光度：

重复测定4次取平均值

第1次	第2次	第3次	第4次	平均值
					0.0107	0.0111	0.0108	0.0105	0.0108

2)灵敏度：

定标时产生的吸光度变化(ABS)

灵敏度＝测定吸光度-空白吸光度。

浓度	第1次	第2次	第3次	第4次	均值
						0.29	0.0412	0.0406	0.0411	0.0409	0.0410

3)不准确度：

测定校准品的浓度，测定三次取平均值，测定平均值与真实值得差异。

不准确的＝(测定值-真实值)/真实值。

4)批内精密度：

方法：重复测定20次，分别计算测量值的平均值(x)和标准差(s)。按公式(1)计算变异系数(CV)，得出试剂批内精密度。

公式(1)： $\mathrm{CV}=\frac{s}{x}\×100\%;$

结果如下：(单位：U/L)

5)线性：

实验方法：测定值接近线性最高值450U/L。

测定2次取平均值与理论值的相关性。

图1为实施例1的中底物分解前与分解后的试剂的吸收光谱图，其中曲线A为分解后的3-氯-5-三氟甲基巯基吡啶(3-Cl-5-TFMPT)的吸收光谱图，曲线B为分解前的底物(3-Cl-5-TFMPT-NAG)的吸收光谱图，从图中可以看出，底物在390nm处无吸收，当底物被N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)分解后，分解产物在390nm处具有强烈的特征吸收峰，通过检测该处吸收峰的强度可得出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的浓度，干扰度小，准确度高。

实施例2

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝7.2的TRIS缓冲液         100mmol/L

EDTA                        0.5g/L

对羟基苯甲酸甲酯            2g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物为3-Cl-5-TFMPT-NAG。

按照实施方式中的操作步骤，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，测试方法参考实施例1，实验结果如下：

1)空白吸光度：0.0115。

2)灵敏度：0.0475。

3)不准确度：0.58％，符合标准。

4)批内精密度：符合标准。

5)线性：符合标准。

实施例3

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝7.5的PIPES缓冲液            200mmol/L

EDTA-2Na                        10g/L

4-氯-3,5-二甲基苯酚             1g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物为3-Cl-5-TFMPT-NAG。

按照实施方式中的操作步骤，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，测试方法参考实施例1，实验结果如下：

1)空白吸光度：0.0129。

2)灵敏度：0.0417。

3)不准确度：0.46％，符合标准。

4)批内精密度：符合标准。

5)线性：符合标准。

实施例4

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝7.7的GOOD’S缓冲液         150mmol/L

EDTA                           5g/L

NaN₃                           0.5g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物为3-Cl-5-TFMPT-NAG。

按照实施方式中的操作步骤，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，测试方法参考实施例1，实验结果如下：

1)空白吸光度：0.0113。

2)灵敏度：0.0467。

3)不准确度：0.64％，符合标准。

4)批内精密度：符合标准。

5)线性：符合标准。

实施例5

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝8.0的CAPS缓冲液             150mmol/L

亚氨基二乙酸                    1g/L

NaN₃                            2g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物为3-Cl-5-TFMPT-NAG。

按照实施方式中的操作步骤，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，测试方法参考实施例1，实验结果如下：

1)空白吸光度：0.0141。

2)灵敏度：0.0542。

3)不准确度：0.67％，符合标准。

4)批内精密度：符合标准。

5)线性：符合标准。

实施例6

配制检测试剂，其中试剂A具有以下浓度的组分：

PH＝7.4的HEPES缓冲液         200mmol/L

EDTA                         7g/L

NaN₃                         1g/L；

所述试剂B包括以下浓度的组分：

所述底物为3-Cl-5-TFMPT-NAG。

按照实施方式中的操作步骤，对处理后的试剂进行检测，检测波长390nm，测试方法参考实施例1，实验结果如下：

1)空白吸光度：0.0123。

2)灵敏度：0.0425。

3)不准确度：0.52％，符合标准。

4)批内精密度：符合标准。

5)线性：符合标准。

从以上实施例中可以看出，本发明的试剂的测试结果各项指标符合结果，灵敏度高，使用方便。

Claims (5)

1.一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，所述检测试剂由试剂A和试剂B两个试剂组成，其特征在于， 

所述试剂A包括以下浓度的组分： 

PH＝7.0～8.0的缓冲液        50～200mmol/L 

稳定剂                      0.5～10g/L 

防腐剂                      0.5～2g/L； 

所述试剂B包括以下浓度的组分： 

所述底物具有以下的结构通式： 

。

2.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于，所述试剂A与试剂B混合后，混合液中的组分具有以下浓度： 

3.根据权利要求2所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于，所述缓冲液选自PBS缓冲液、TRIS缓冲液、PIPES缓冲液、GOOD’S缓冲液、CAPS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种。 

4.根据权利要求3所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于，所述稳定剂选自EDTA、EDTA-2Na、乙二醇、亚氨基二乙酸中的一种。 

5.根据权利要求4所述的一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂，其特征在于，所述防腐剂选自NaN₃、对羟基苯甲酸甲酯、4-氯-3,5-二甲基苯酚中的一种。