CN103134759A - 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法 - Google Patents

一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103134759A
CN103134759A CN 201110381309 CN201110381309A CN103134759A CN 103134759 A CN103134759 A CN 103134759A CN 201110381309 CN201110381309 CN 201110381309 CN 201110381309 A CN201110381309 A CN 201110381309A CN 103134759 A CN103134759 A CN 103134759A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mpt
nag
acetyl
sample
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201110381309
Other languages
English (en)
Inventor
步怀宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XI'AN REJE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
XI'AN REJE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XI'AN REJE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical XI'AN REJE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN 201110381309 priority Critical patent/CN103134759A/zh
Publication of CN103134759A publication Critical patent/CN103134759A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法。本发明所述检测方法的测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶（MPT）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，反应中生成的MPT在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。本方法所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求，检测灵敏度高,线性、精密度好,结果准确,且操作简便快速,可用于各种类型的分析仪，满足大规模测定样本的要求。

Description

一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法
技术领域
本发明属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法。
背景技术
6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)是近年来合成的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶( NAG)的新底物。以MPT-NAG为主要原材料开发的液体型NAG测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。MPT-NAG含量的高低显著影响NAG测定试剂的灵敏度，是控制NAG测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。
目前实验室测定MPT-NAG含量时均采用高效液相色谱（HPLC）法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时且成本高，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。
因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对MPT-NAG进行定量检测就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶对MPT-NAG的催化分解，通过测定反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测定样品中MPT-NAG浓度。依据该法构建的测定试剂绿色、环保，实现一步法直接测定，测定试剂置于2-8℃环境中可稳定保存12个月，用普通的紫外分光光度计就可以实现检测。
本发明测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶（MPT）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖。反应中生成的MPT 205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。
本发明通过以下技术方案实现:
一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1）配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
2）加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶（MPT）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；
3）通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。
步骤（1）中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000 浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
步骤（2）中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min。
步骤（2）中反应生成的6-甲基-2巯基吡啶（MPT）分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，尤其是340nm。
样品中MPT-NAG的计算公式为：样品液MPT-NAG含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (ε×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
利用本发明所述定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的酶法检测方法，可以精确检测待测样品中含有的6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的范围为0.015-50 mmol/L。
本发明所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相（HPLC）法相比较结果见表1。
表1  
检测方法 HPLC 本法
检测时间 60min 5~10min
检测成本 200 很低
标准品 需要 不需要
检测步骤 多步 一步直接法
手工法/自动法 手工法 手工法或自动法均可
含有的有毒物质 甲醇 不含有毒物质
本发明所述方法灵敏度高,线性、精密度好,结果准确,且操作简便快速,并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明的原理和其应用，但本发明并不限于此。
样品液：精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为0.005-16.5g/L的样品液。
样品液中MPT-NAG的计算公式：样品液MPT含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (ε×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
实施例1：
配制含MgCl2 20mmol/L、EDTA·2Na 10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 20KU/L、聚乙二醇6000  10g/L、乙二醇100ml/L、蔗糖50g/L的500mmol/L pH5.0 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为3μl，V试剂为300μl，测定主/副波长为340/800nm，试剂加入样本后在测定温度反应5分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (10063×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，10063为340nm下MPT-NAG摩尔吸光值。用本法和HPLC法同时测定了25例样品液中MPT-NAG含量。
表2为本实施例所述方法测定的含MPT-NAG的样品液中MPT-NAG含量的测定值与HPLC法测定MPT-NAG含量的值对照表。
表2
样品号 HPLC法测定值（mmol/L) 本法测定值(mmol/L)
1 0.023 0.025
2 0.117 0.114
3 0.507 0.503
4 0.752 0.748
5 1.132 1.119
6 2.254 2.261
7 4.985 4.971
8 7.588 7.541
9 10.023 9.991
10 12.250 12.188
11 15.381 15.298
12 17.571 17.520
13 20.652 20.587
14 22.235 22.145
15 25.034 25.039
16 27.560 27.833
17 30.001 29.692
18 32.612 32.454
19 35.420 35.503
20 37.451 37.338
21 40.012 40.223
22 42.527 42.588
23 45.321 45.228
24 47.255 47.553
25 49.703 49.111
从表2可知，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9999，两者显示了极好的相关性。
实施例2：
配制含MgCl2 10mmol/L、EDTA·2Na 5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 12.5KU/L、聚乙二醇6000  6g/L、乙二醇60ml/L、蔗糖25g/L的250mmol/L PH4.5 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2550紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样品为30μl，V试剂为3000μl，测定波长为270nm，试剂加入样本后在测定温度反应7.5分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (9919×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，9919为270nm下MPT-NAG摩尔吸光值。
实施例3：
配制含MgCl2 2mmol/L、EDTA·2Na 0.5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 5KU/L、聚乙二醇6000 2g/L、乙二醇20ml/L、蔗糖5g/L的30mmol/L pH4.0 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2201紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样品为25μl，V试剂为2500μl，测定波长为205nm，试剂加入样本后在测定温度反应10分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (8329×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，8329为205nm下MPT-NAG摩尔吸光值。
本技术领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明的实质精神和范围的前提下，对发明的各种变化、变型和改进，都应落入权利要求书要求保护的范围内。

Claims (5)

1.一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1）配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
2）加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶（MPT）和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；
3）通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000 浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于：步骤（2）中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于：步骤（2）反应中生成的6-甲基-2巯基吡啶（MPT）分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收。
5.据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法，其特征在于：样品中MPT-NAG的计算公式为：样品液MPT-NAG含量（mmol/L）= （Au-A0）×V1×103 / (ε×V2) ，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
CN 201110381309 2011-11-26 2011-11-26 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法 Pending CN103134759A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110381309 CN103134759A (zh) 2011-11-26 2011-11-26 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110381309 CN103134759A (zh) 2011-11-26 2011-11-26 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103134759A true CN103134759A (zh) 2013-06-05

Family

ID=48494873

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110381309 Pending CN103134759A (zh) 2011-11-26 2011-11-26 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103134759A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397508A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN106397507A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(5‑溴‑2‑吡啶基)巯基‑α‑L‑岩藻吡喃糖苷
CN106397509A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(5‑三氟甲基‑2‑吡啶基)巯基‑α‑L‑岩藻吡喃糖苷
CN106478749A (zh) * 2016-08-31 2017-03-08 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(硝基‑2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN106496291A (zh) * 2016-08-31 2017-03-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(6‑甲基‑5‑硝基‑2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN111826417A (zh) * 2020-08-04 2020-10-27 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种稳定性好的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒、制备方法及用途

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106397508A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN106397507A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(5‑溴‑2‑吡啶基)巯基‑α‑L‑岩藻吡喃糖苷
CN106397509A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(5‑三氟甲基‑2‑吡啶基)巯基‑α‑L‑岩藻吡喃糖苷
CN106478749A (zh) * 2016-08-31 2017-03-08 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(硝基‑2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN106496291A (zh) * 2016-08-31 2017-03-15 宁波大学 2,3,4‑三乙酰基‑1‑(6‑甲基‑5‑硝基‑2‑吡啶基)巯基‑alpha‑L‑岩藻吡喃糖苷及水解产物的合成
CN106397507B (zh) * 2016-08-31 2019-03-08 宁波大学 2,3,4-三乙酰基-1-(5-溴-2-吡啶基)巯基-α-L-岩藻吡喃糖苷
CN106397508B (zh) * 2016-08-31 2019-03-08 宁波大学 2,3,4-三乙酰基-1-(2-吡啶基)巯基-α-L-岩藻吡喃糖苷
CN106397509B (zh) * 2016-08-31 2019-03-08 宁波大学 2,3,4-三乙酰基-1-(5-三氟甲基-2-吡啶基)巯基-α-L-岩藻吡喃糖苷
CN106496291B (zh) * 2016-08-31 2019-04-16 宁波大学 2,3,4-三乙酰基-1-(6甲基-5硝基-2吡啶基)巯基-α-L-岩藻吡喃糖苷
CN106478749B (zh) * 2016-08-31 2019-04-16 宁波大学 2,3,4-三乙酰基-1-(硝基-2-吡啶基)巯基-α-L-岩藻吡喃糖苷
CN111826417A (zh) * 2020-08-04 2020-10-27 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种稳定性好的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒、制备方法及用途
CN111826417B (zh) * 2020-08-04 2023-01-17 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种稳定性好的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂盒、制备方法及用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103134759A (zh) 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测方法
CN102507482B (zh) 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法及试剂
CN107417671A (zh) 一种含喹啉取代的香豆素衍生物及其制备方法和在比率型pH荧光探针上的应用
CN103134919A (zh) 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的检测试剂
CN103472041A (zh) 一种肌酸酐含量检测试剂盒的使用方法
CN105203533B (zh) 一种分析灵敏度高的N‑乙酰‑β‑D‑氨基葡萄糖苷酶检测试剂
CN102288568B (zh) 快速测定水中uo22+的纳米金催化-硝酸银还原光度法
CN105842437A (zh) 一种测定d-3-羟丁酸的试剂盒及其制备方法
CN103713061B (zh) 一种通过测定氧气浓度来确定过氧化氢含量的方法
CN101173931A (zh) 锌诊断/测定试剂盒及锌的浓度测定方法
CN104730017A (zh) 一种测定待测样品中次黄苷与腺苷相对含量的方法
CN104764703A (zh) 一种测定次黄苷与次黄苷-5′-单磷酸钠相对含量的方法
CN102507463A (zh) 一种定量检测硫代氧化型辅酶（Thio-NAD）的循环酶检测方法和试剂盒
CN101793777A (zh) 甲醛测定试剂(盒)及甲醛浓度测定方法
CN101329336A (zh) 甘油诊断/测定试剂盒及甘油的浓度测定方法
CN101324630A (zh) 乙醇诊断/测定试剂盒及乙醇的浓度测定方法
CN103592238A (zh) 血清乙醇含量测定试剂盒
CN104280352A (zh) 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂
CN101691601A (zh) 一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法
CN101762538A (zh) 乙醇诊断/测定试剂(盒)及乙醇浓度测定方法
CN101464363A (zh) 镁(离子)诊断/测定试剂盒及镁(离子)的浓度测定方法
CN101464346A (zh) 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
CN101464331A (zh) 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
CN101464334A (zh) 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
CN101464327A (zh) 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130605