CN101173931A - 锌诊断/测定试剂盒及锌的浓度测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的锌诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锌浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、磷酸单酯、甘油醛－3－磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛－3－磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出锌的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。

Description

锌诊断/测定试剂盒及锌的浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种锌诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锌浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
锌与生物的生长发育有关。锌具有重要的生理功能、营养作用和临床诊疗意义。测定血清锌及Cu/Zn比值，对评价机体锌的营养状况和对许多疾病的诊疗均具有重要的实用价值。
锌的测定方法包括络合滴定法、荧光光度法、比色法、极谱法、原子吸收分光光度法、阳极溶出伏安法和中子活化法等。
络合滴定法耗时费力，标本用量大，特异性低。
荧光光度法操作简单，但需荧光光度计。
比色法简单、快速、灵敏度高，可得到原子吸收法近似的结果，但是比色法操作复杂。常用的显色剂与锌络合后在最大吸收峰的摩尔吸光系数(L·mol-1·cm-1)如下：1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚56000；1-[(5-氯-2-吡啶)偶氮]-2-萘酚69000；4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚84000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙基氨基酚120000；2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-n丙基-N-3-磺化丙氨基)酚130000。比色法一般都要先加盐酸胍或三氯醋酸等使锌及其它金属离子从蛋白结合物中释放出来，再加氰化物作掩蔽剂，络合除锌以外的金属，加水合氯醛作暴露剂，又避免氰化物与锌的络合，使锌能特异地与吡啶偶氮酚类化合物反应显色。
单扫描示波极谱仪属小型仪器，操作简便，特异性较好，有些实验室对此方法较满意。
原子吸收分光光度法(AAS)具有特异性高(干扰小)、检出限低(样品量少)、精密度好(CV＜3.6％＝、回收率达到99％、准确度高等优点。该法操作较比色法和荧光法简单的多，但仪器价格昂贵，因它能最准确地分析锌含量而被推荐为测锌的方法。
阳极溶出伏安法是利用沉积在电极上锌溶出后，测其阳极电流强度与锌浓度成正比。
酶法操作最方便，易于自动化，价格低廉，特异性高，精密度好。是非常适合国情的一种检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锌浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锌诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锌浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明锌浓度测定方法原理如下：
磷酸单酯+水  碱性磷酸酶/Zn 2+   醇类+磷酸根
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶  甘油醛-3-磷酸脱氢酶 
                           甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶
这种方法应用需要锌离子激活的碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase；EC 3.1.3.1)酶(偶)联甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；EC 1.2.1.59)酶促反应速率比色法。碱性磷酸酶酶解磷酸单酯反应产生磷酸根，再通过(偶)联合甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算锌的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锌诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液                  100mmol/L
稳定剂                  50mmol/L
辅酶                    3mmol/L
磷酸单酯                20mmol/L
甘油醛-3-磷酸           3mmol/L
碱性磷酸酶              20000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶     12000U/L
本发明的锌诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、甘油醛-3-磷酸。
试剂2
缓冲液、磷酸单酯。
试剂3
缓冲液、稳定剂、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锌浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的锌诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
磷酸单酯                         20mmol/L
甘油醛-3-磷酸                    3mmol/L
碱性磷酸酶                       20000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶              12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锌样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锌的浓度大小。
实施例二
本实施例的锌诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
磷酸单酯                         10mmol/L
甘油醛-3-磷酸                    6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
碱性磷酸酶                       30000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶              18000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锌样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锌的浓度大小。
实施例三
本实施例的锌诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
辅酶                             3mmol/L
甘油醛-3-磷酸                    9mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
磷酸单酯                         20mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
碱性磷酸酶                       50000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶              32000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定锌浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锌样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出锌的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims (6)

1.一种酶比色法及酶联法的锌的浓度测定方法，其方法原理如下：
磷酸单酯+水 碱性磷酸酶/Zn2+ 醇类+磷酸根
磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 甘油醛-3-磷酸脱氧酶
                     甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出锌的浓度大小测定结果。
2.一种锌诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液                 20-500mmol/L
稳定剂                 1-50mmol/L
辅酶                   1-6mmol/L
磷酸单酯               1-50mmol/L
甘油醛-3-磷酸          1-6mmol/L
碱性磷酸酶             1000-80000U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶    1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述锌诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述锌诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述锌诊断/测定试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、磷酸单酯组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、磷酸单酯、甘油醛-3-磷酸、碱性磷酸酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述锌诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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