CN101173896A - 山梨醇脱氢酶诊断试剂盒及山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法技术的山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、山梨醇及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。

Description

山梨醇脱氢酶诊断试剂盒及山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

山梨醇脱氢酶能可逆地催化D-山梨醇氧化为D-果糖。人体内此酶主要分布肝脏，肾、脑、心、脾等组织中含量极少，血清中此酶活力很低，如酶活力升高，强烈提示肝损害。检测血清SDH在反映肝损伤方面较ALT可能更具特异性。

山梨醇脱氢酶测定方法国内多采用终点法，此法无需特殊试剂和仪器，适合基层实验室应用，但操作繁琐，需除蛋白，敏感性低，干扰因素多，且不能用于自动生化分析仪。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行山梨醇脱氢酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法原理如下：

山梨醇+辅酶山梨醇脱氢酶山梨糖+还原型辅酶

这种方法应用山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase；EC 1.1.99.21)酶促反应连续监测法。山梨醇脱氢酶酶解山梨醇反应，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明山梨醇脱氢酶诊断试剂较为理想：

缓冲液                    100mmol/L

稳定剂                    50mmol/L

辅酶                      3mmol/L

山梨醇                    30mmol/L

本发明的山梨醇脱氢酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶。

试剂2

缓冲液、稳定剂、山梨醇。

辅酶、山梨醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂还是双剂，本发明测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液          100mmol/L

稳定剂                                 50mmol/L

辅酶                                   3mmol/L

山梨醇                                 30mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测山梨醇脱氢酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。

实施例二

本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液      100mmol/L

稳定剂                             50mmol/L

辅酶                               5mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液      100mmol/L

稳定剂                             50mmol/L

山梨醇                             20mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测山梨醇脱氢酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。

实施例三

本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液         100mmol/L

稳定剂                                50mmol/L

山梨醇                                20mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液         100mmol/L

稳定剂                                50mmol/L

辅酶                                  2mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

测定山梨醇脱氢酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测山梨醇脱氢酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为4/40/10，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims (5)

1.一种利用酶比色法技术的山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法，其方法原理如下：

山梨醇+辅酶 山梨醇脱氢酶 山梨糖+还原型辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小测定结果。

2.一种山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，主要成分包括：

缓冲液    20-500mmol/L

稳定剂    1-50mmol/L

辅酶      1-6mmol/L

山梨醇    1-50mmol/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于：由缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、山梨醇组成。辅酶、山梨醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。