CN101169366A - 岩藻糖苷酶诊断试剂盒及岩藻糖苷酶活性测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定岩藻糖苷酶活性的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、合成色原－岩藻糖苷底物及稳定剂，这些成分可以配成单剂试剂盒及双剂试剂盒；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于可见光分析仪下，检测主波长410nm或366nm处吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。采用本发明完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。

Description

岩藻糖苷酶诊断试剂盒及岩藻糖苷酶活性测定方法

技术领域

本发明涉及一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定岩藻糖苷酶活性的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

1980年法国学者Deugnier等研究发现，原发性肝癌患者血清岩藻糖苷酶升高，并被众多的研究所证实。故有人提出岩藻糖苷酶可作为原发性肝癌的肿瘤标志物，与甲胎蛋白联合或参照应用大大提高了诊疗价值。近年来研究发现，岩藻糖苷酶对某些疾病的发生、发展均具有重要意义。

血清岩藻糖苷酶测定主要有荧光法和比色法。比色法以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷或4-硝基苯α-L-岩藻糖苷为底物显色，本法简便，设备要求不高，国内外广泛采用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，连续监测色原在410或366nm波长处吸光度的变化，得以测定岩藻糖苷酶活性的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的岩藻糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行岩藻糖苷酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明岩藻糖苷酶活性测定方法原理如下：

合成色原岩藻糖苷底物岩藻糖苷酶色原+相应岩藻糖苷

这种方法应用岩藻糖苷酶酶促反应连续监测法，岩藻糖苷酶酶解合成色原岩藻糖苷底物释放出色原(在410或366nm处有吸收峰)，从而得以测定410或366nm处吸光度上升的速度，可以测算岩藻糖苷酶的活性大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂或双剂，如下成分关系的本发明岩藻糖苷酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液                    500mmol/L

稳定剂                    10mmol/L

合成色原岩藻糖苷底物      3mmol/L

本发明的岩藻糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、合成色原岩藻糖苷底物。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液。

试剂2

缓冲液、稳定剂、合成色原岩藻糖苷底物。

合成色原岩藻糖苷底物在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂或双剂，本发明测定岩藻糖苷酶活性的方法，其合成色原岩藻糖苷底物可以是对硝基苯基-2-o-(α-L-吡喃岩藻糖苷)-β-D-吡喃半乳糖、对硝基苯基-岩藻糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃岩藻糖苷或4-甲基伞形酮-α-L-岩藻糖苷中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的岩藻糖苷酶诊断试剂为单试剂，包括：

柠檬酸钠缓冲液 pH6.0                        500mmol/L

稳定剂                                      10mmol/L

对硝基苯基-2-o-(α-L-吡喃岩藻糖苷)-β-D-吡喃半乳糖

                                            3mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长410nm，测试副波长505nm，被测岩藻糖苷酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长410nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。

实施例二

本实施例的岩藻糖苷酶诊断试剂为双试剂，包括：

试剂1

柠檬酸钠缓冲液  pH6.0                    500mmol/L

试剂2

柠檬酸钠缓冲液  pH6.0                    500mmol/L

稳定剂                                   10mmol/L

4-甲基伞形酮-α-L-岩藻糖苷               3mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长366nm，测试副波长505nm，被测岩藻糖苷酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长366nm吸光度上升的速度，从而测算出岩藻糖苷酶的活性大小。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Claims (4)

1.一种岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)活性测定方法，其方法原理如下：

将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，

检测主波长410或366nm吸光度上升的速度，测算出岩藻糖苷酶的活性大小测定结果。

合成色原-岩藻糖苷底物可以是下列底物中之任何一种：

对硝基苯基-2-o-(α-L-吡喃岩藻糖苷)-β-D-吡喃半乳糖

(p-Nitrophenyl-2-o-(α-L-fucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside)对硝基苯基-岩藻糖苷(p-Nitrophenyl-α-L-fucoside)

对硝基苯基-α-L-吡喃岩藻糖苷(p-Nitrophenyl-a-L-fucopyranoside)

以上三种底物其吸收波长皆为410nm

4-甲基伞形酮-α-L-岩藻糖苷(4-Methylumbelliferyl-α-L-fucoside)吸收波长366nm。

2.一种岩藻糖苷酶诊断试剂盒，主要成分包括：

缓冲液                   20——500mmol/L

稳定剂                   1——50mmol/L

合成色原-岩藻糖苷底物    0.3——12mmol/L

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；

也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、合成色原-岩藻糖苷底物组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述岩藻糖苷酶诊断试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、合成色原-岩藻糖苷底物组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、合成色原-岩藻糖苷底物组成。