CN101082568A - 乙酸浓度的测定方法及乙酸诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶比色法测定乙酸浓度的方法及乙酸诊断试剂盒，运用醛脱氢酶酶促反应连续监测法/速率比色法。醛脱氢酶酶解乙酸反应产生乙醛，并将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，测算乙酸的浓度大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。

Description

乙酸浓度的测定方法及乙酸诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及医药、食品、环境等领域内对乙酸浓度的检测，尤其涉及利用酶比色法测定乙酸浓度的方法，以及由此制得的乙酸诊断试剂盒，属于乙酸浓度分析检测技术领域。

背景技术

随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋GB10337-2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合GB1903-1996的规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒“食品添加剂醋酸”，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不够时加入盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为这类醋酸不仅含有添加的有毒、有害无机物，还含有有害有机物。

发明内容

本发明的目的是：提供一种测定乙酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的乙酸诊断试剂盒。

为实现本发明的目的，一种酶比色法测定乙酸浓度的方法，利用醛脱氢酶为作用酶和显色酶，对待测样品中的乙酸进行检测，采用以下步骤进行：

首先，将测定的样品与含有还原型辅酶、醛脱氢酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

然后，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小。

上述酶比色法测定乙酸浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。

实现本发明乙酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液      20～500mmol/L，

稳定剂      1～4000mmol/L，

还原型辅酶  0.1～0.35mmol/L，

醛脱氢酶    1000～80000U/L。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如：

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分：还原型辅酶可以放在试剂II；试剂II中的醛脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在1～4000mmol/L或0.1％～100％体积比范围之内。

用作稳定剂的物质可以是：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。

研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：

缓冲液      100mmol/L，

稳定剂      500mmol/L，

还原型辅酶  0.25mmol/L，

醛脱氢酶    10000U/L。

利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙酸浓度的方法，同时，本发明还给出用以实现该方法的乙酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：

(1)本发明完全利用酶比色法测定乙酸浓度，测试结果准确；

(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；

(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；

(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中乙酸浓度的大小；

(6)本发明提供的液态乙酸诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。

具体实施方式

本发明一种乙酸浓度的测定方法及乙酸诊断试剂盒，运用醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.3；EC 1.2.1.4；EC 1.2.1.5)酶促反应连续监测法/速率比色法。醛脱氢酶酶解乙酸反应产生乙醛，并将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，测算乙酸的浓度大小。

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例一(单剂)

按以下成分和用量配制乙酸诊断试剂盒：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

硫酸铵                           500mmol/L，

NADPH                            0.25mmol/L，

醛脱氢酶                         10000U/L；

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。

实施例二(双剂)

按以下成分和用量配制乙酸诊断试剂盒：

试剂I——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

甘油                             50mmol/L，

NADH                             0.25mmol/L；

试剂II——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

丙二醇                           500mmol/L，

醛脱氢酶                         10000U/L；

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Claims (6)

1.乙酸浓度的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小。

2.乙酸诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：

缓冲液      20～500mmol/L，

稳定剂      1～4000mmol/L，

还原型辅酶  0.1～0.35mmol/L，

醛脱氢酶    1000～80000U/L。

3.根据权利要求2所述的乙酸诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的乙酸诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。

5.权利要求2～4中任意一种乙酸诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂或双剂。

6.权利要求2～4中任意一种乙酸诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。