CN101082569A - 氨基酸浓度的测定方法及氨基酸诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶比色法及偶联法测定氨基酸浓度的方法及诊断试剂盒，运用氨基酸氧化酶偶联NADH过氧化物酶酶促反应连续监测法/速率比色法，氨基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合NADH过氧化物酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，测算氨基酸的浓度大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果，便于推广应用。

Description

氨基酸浓度的测定方法及氨基酸诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及医药、食品、环境等领域内对氨基酸浓度的检测，尤其涉及酶比色法及偶联法测定氨基酸浓度的方法，以及由此制得的氨基酸诊断试剂盒，属于氨基酸浓度分析检测技术领域。

背景技术

氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，操作较为繁杂、特异性差、仪器设备成本较高。

氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。

大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。

酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定氨基酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的氨基酸诊断试剂盒。

为实现本发明的目的，一种酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)测定氨基酸浓度的方法，利用氨基酸氧化酶为作用酶、NADH过氧化物酶为显色酶，对待测样品中的氨基酸进行检测，采用以下步骤进行：

将测定的样品与含有氨基酸氧化酶、氧、还原型辅酶、NADH过氧化物酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出氨基酸浓度的大小。

上述酶比色法及偶联法测定氨基酸浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。

实现本发明氨基酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液          20～500mmol/L，

稳定剂          1～4000mmol/L，

还原型辅酶      0.1～0.35mmol/L，

氨基酸氧化酶    1000～80000U/L，

NADH过氧化物酶  1000～80000U/L。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如：

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分：还原型辅酶，可以放在试剂II；试剂II中的氨基酸氧化酶、NADH过氧化物酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

此外，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II当中通常加入稳定剂，浓度在1～4000 mmol/L、或0.1％～100％体积比范围之内。

还可以将试剂配成如下三试剂：

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的NADH过氧化物酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的氨基酸氧化酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，活性浓度在1～4000 mmol/L、或0.1％～100％体积比范围之内。

用作稳定剂的物质可以是：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。

研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断/检测试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：

缓冲液            100mmol/L，

稳定剂            500mmol/L，

还原型辅酶        0.25mmol/L，

氨基酸氧化酶      10000U/L，

NADH过氧化物酶    16000U/L。

利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(CoupleReaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：

(1)本发明利用酶比色法及偶联法测定氨基酸浓度，测试结果准确；

(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；

(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；

(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中氨基酸浓度的大小；

(6)本发明提供的液态氨基酸诊断/检测试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。

具体实施方式

本发明一种氨基酸浓度的测定方法及氨基酸诊断试剂盒，运用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC 1.4.3.3)偶联NADH过氧化物酶(NADH peroxidase；EC 1.11.1.1；EC 1.11.1.2)酶促反应连续监测法/速率比色法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合NADH过氧化物酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算氨基酸的浓度大小。

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例一(单剂)

按以下成分和用量配制氨基酸诊断试剂盒：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

硫酸铵                           500mmol/L，

NADH                             0.25mmol/L，

氨基酸氧化酶                     10000U/L，

NADH过氧化物酶                   16000U/L；

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

实施例二(双剂)

按以下成分和用量配制氨基酸诊断试剂盒：

试剂I——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

硫酸铵                           50mmol/L，

NADPH                            0.25mmol/L；

试剂II——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

甘油                             500mmol/L，

氨基酸氧化酶      10000U/L，

NADH过氧化物酶    16000U/L。

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

实施例三(三剂)

按以下成分和用量配制氨基酸诊断试剂盒：

试剂I——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

丙二醇                           50mmol/L，

thio-NADH                        0.25mmol/L；

试剂II——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

乙二醇                           500mmol/L，

NADH过氧化物酶                   16000U/L；

试剂III——

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L，

甘油                             500mmol/L，

氨基酸氧化酶                     10000U/L；

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定氨基酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比例为4∶40∶5∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Claims (6)

1.氨基酸浓度的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

3)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出氨基酸浓度的大小。

2.氨基酸诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：

缓冲液            20～500mmol/L，

稳定剂            1～4000mmol/L，

还原型辅酶        0.1～0.35mmol/L，

氨基酸氧化酶      1000～80000U/L，

NADH过氧化物酶    1000～80000U/L。

3.根据权利要求2所述的氨基酸诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的氨基酸诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。

5.权利要求2～4中任意一种氨基酸诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂或者双剂或三剂。

6.权利要求2～4中任意一种氨基酸诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。