CN101324514A - 乙酸测定试剂盒及乙酸的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定乙酸浓度的方法，属于食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
随着配制食醋标准的出台，食品添加剂乙酸(醋酸)的质量合格与否又直接关系着人民身体健康与否。在条文强制性标准配制食醋G B10337-2000中明确规定，配制食醋所用的乙酸应符合G B 1903-1996的规定，即应符合食品添加剂醋酸的要求。用工业醋酸假冒“食品添加剂醋酸”，例如，使用某些副产品或回收的工业醋酸进行脱色，浓度不够时加入盐酸、磷酸等以增加酸度。这类醋酸对人体的危害很大，因为这类醋酸不仅含有添加的有毒、有害无机物，还含些很难说清的有害有机物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定乙酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乙酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乙酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明乙酸浓度测定方法原理如下：
乙酸+二氧化碳+亚铁细胞色素b1丙酮酸氧化酶
丙酮酸+高铁细胞色素b1+水
丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+
乙酰辅酶A+还原型辅酶
这种方法应用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.2.2)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)酶促反应速率比色法/终点法。丙酮酸氧化酶酶解乙酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算乙酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明乙酸测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
二氧化碳 20mmol/L
亚铁细胞色素b1 5mmol/L
辅酶 3mmol/L
辅酶A 2mmol/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
丙酮酸脱氢酶 10000U/L
本发明的乙酸测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶。
二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶。
二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定乙酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的乙酸测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
二氧化碳 20mmol/L
亚铁细胞色素b1 5mmol/L
辅酶 3mmol/L
辅酶A 2mmol/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
丙酮酸脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的乙酸测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
二氧化碳 20mmol/L
亚铁细胞色素b1 5mmol/L
辅酶 3mmol/L
辅酶A 2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
丙酮酸脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的乙酸测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
二氧化碳 20mmol/L
亚铁细胞色素b1 5mmol/L
辅酶 3mmol/L
辅酶A 2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸脱氢酶 10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定乙酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测乙酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出乙酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种酶比色法及酶联法的乙酸的浓度测定方法，其方法原理如下：
乙酸+二氧化碳+亚铁细胞色素b1丙酮酸氧化酶
丙酮酸+高铁细胞色素b1+水
丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+
乙酰辅酶A+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出乙酸的浓度大小测定结果。
2.一种乙酸测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
二氧化碳 1-50mmol/L
亚铁细胞色素b1 1-50mmol/L
辅酶 1-6mmol/L
辅酶A 1-50mmol/L
丙酮酸氧化酶 1000-80000U/L
丙酮酸脱氢酶 1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。二氧化碳以碳酸氢盐取代，例如碳酸氢钠或碳酸氢钾。
3.根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成。二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶组成。二氧化碳、亚铁细胞色素、辅酶、辅酶A、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述乙酸测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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