CN101464283A

CN101464283A - 异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法

Info

Publication number: CN101464283A
Application number: CNA2007101914363A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2009-06-24

Abstract

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。

Description

异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。

背景技术

异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC1.1.1.41；EC 1.1.1.42)的作用下变成α-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，EC 4.1.3.1)的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。

中华人民共和国国家标准，GB T16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料中D-异柠檬酸的测定方法—紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓缩汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁饮料的总D-异柠檬酸的测定。其测定原理：异柠檬酸脱氢酶isocitrate dehydrogenase有两种类型：以NAD为辅酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP为辅酶的酶(EC1.1.1.42)，两者催化同一反应。

在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nm处测定吸光度，确定样品中总D-异柠檬酸的含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下：

D-异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶二氧化碳+

酮戊二酸+还原型辅酶

二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)

丙酮酸+辅酶A+氧

丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+

乙酰辅酶A+还原型辅酶

这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase；EC 1.1.1.41；EC 1.1.1.42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)(pyruvate oxidase(CoAacetylating)；EC 1.2.3.6)、丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC1.2.1.51)酶促反应速率比色法。异柠檬酸脱氢酶，作为作用酶，酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，同时也是显色酶，将辅酶还原成为还原型辅酶；再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶的作用，丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)也作为作用酶，利用二氧化碳产生丙酮酸；丙酮酸脱氢酶又作为循环酶又是显色酶，一面将丙酮酸变回二氧化碳，使之不断循环利用；一面又将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算异柠檬酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

辅酶 3mmol/L

异柠檬酸脱氢酶 10000U/L

丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 12000U/L

丙酮酸脱氢酶 12000U/L

过氧化氢 10mmol/L

乙酰辅酶A 10mmol/L

辅酶A 10mmol/L

本发明的异柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A。

试剂2

缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶。

辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A。

试剂2

缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。

辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP⁺、NAD⁺或thio-NAD⁺中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

辅酶 3mmol/L

异柠檬酸脱氢酶 10000U/L

丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 12000U/L

丙酮酸脱氢酶 12000U/L

过氧化氢 10mmol/L

乙酰辅酶A 10mmol/L

辅酶A 10mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。

实施例二

本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

过氧化氢 10mmol/L

乙酰辅酶A 10mmol/L

辅酶A 10mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

异柠檬酸脱氢酶 10000U/L

丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 12000U/L

丙酮酸脱氢酶 12000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。

实施例三

本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

辅酶 3mmol/L

过氧化氢 10mmol/L

乙酰辅酶A 10mmol/L

辅酶A 10mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 12000U/L

丙酮酸脱氢酶 12000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

异柠檬酸脱氢酶 10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约2分钟左右，检测时间3分钟左右。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0009；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达10.2mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤1.2％；试剂的灵敏度可达0.0786±0.040ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。

Claims

1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法原理如下：

D-异柠檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶二氧化碳+

酮戊二酸+还原型辅酶

二氧化碳+过氧化氢+乙酰辅酶A 丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)

丙酮酸+辅酶A+氧

丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+

乙酰辅酶A+还原型辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。

2.一种异柠檬酸测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——4000mmol/L

辅酶 1——6mmol/L

异柠檬酸脱氢酶 1000——80000U/L

丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化) 1000——80000U/L

丙酮酸脱氢酶 1000——80000U/L

过氧化氢 1——50mmol/L

乙酰辅酶A 1——50mmol/L

辅酶A 1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶(CoA乙酰化)、丙酮酸脱氢酶、过氧化氢、乙酰辅酶A、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。