CN100561187C - N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 - Google Patents
N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100561187C CN100561187C CNB2006101612299A CN200610161229A CN100561187C CN 100561187 C CN100561187 C CN 100561187C CN B2006101612299 A CNB2006101612299 A CN B2006101612299A CN 200610161229 A CN200610161229 A CN 200610161229A CN 100561187 C CN100561187 C CN 100561187C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- beta
- amino
- acetyl
- nitrobenzene
- acet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，运用N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶促反应连续监测法，N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶解3，4双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷反应产生3，4双硝基苯或2-氯-4-硝基苯，通过测量405nm处吸光度上升的速度，测算N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。试剂盒成分包括：缓冲液、合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷及稳定剂，将诊断试剂盒制成双剂可减少各成分的交叉影响。本发明完全可以通过可见光分析仪器得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域内对N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的检测，尤其涉及利用酶比色法测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，以及由此制得的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，属于N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性分析检测技术领域。
背景技术
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG))是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG可作为肾损伤一个极为灵敏的指标，由休克引起急性肾功能衰竭患者尿中极度增高，最高可达正常人的1200倍。急性肾小球肾炎、肾病综合征，毒物或药物引起的肾毒性反应均可使NAG增加。肾移植后，酶测定可用来判断有无排斥反应。病理性增高见于各种肾实质性病变，肾移植排异反应，肾毒性药物使用过多。某些肾小球肾炎、肾病综合征也有部分升高。
NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋，但有的操作烦琐费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。
发明内容
本发明的目的是：提供一种测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒。
为实现本发明的目的，一种利用酶比色法测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，采用以下步骤进行：
首先，将待测样品与含有合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将最终反应物置于可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
上述测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法中，所述合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。所述稳定剂为：硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
实现本发明N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：
缓冲液 20～500mmol/L，
稳定剂 5～100g/ml，
合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷0.2～10mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如：
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂II中的合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂还是双剂，本发明测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、当中通常加入稳定剂，浓度在0.1～3mol/L，或5～100g/ml，或5～50％v/v，范围之内。
用作稳定剂的物质可以是：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：
缓冲液 100mmol/L，
稳定剂 2mol/L，
合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷 2mmol/L。
本发明利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，连续监测在405nm波长处吸光度的变化，得以测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的方法。同时，本发明还给出用以实现该方法的N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：
(1)本发明利用酶比色法技术测定N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性，测试结果准确；
(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；
(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；
(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的大小；
(6)本发明提供的液态N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施方式
本发明一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒，运用N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶促反应连续监测法，N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶酶解3，4双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷反应产生3，4双硝基苯或2-氯-4-硝基苯(在405nm处有吸收峰，摩尔消光系数为18.45)，通过测量405nm处吸光度上升的速度，测算N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)
按以下成分和用量配制N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒：
咪唑/盐酸缓冲液 50mmol/L，
硫酸铵 80g/ml，
3，4双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷2mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长405nm，测试副波长505nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂的体积比为1∶25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值1409。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
实施例二(双剂)
按以下成分和用量配制N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒：
试剂I——
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L，
甘油 2mol/L；
试剂II——
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 50mmol/L，
丙二醇 50％v/v，
2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷2mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长405nm，测试副波长505nm，被测N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值732。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长405nm吸光度上升的速度，从而测算出N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
Claims (5)
1.一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒，其特征在于：盒中试剂由以下成分组成：
缓冲液 20～500mmol/L，
稳定剂 0.1～3mol/L，或
5～100g/ml，或
5～50％v/v，
合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷 0.2～10mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒，其特征在于：所述合成硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷底物是3，4-双硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷或者2-氯-4-硝基苯-β-乙酰氨基葡萄糖苷。
3.根据权利要求1所述的一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.权利要求1～3中任意一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂或者双剂。
5.权利要求1～3中任意一种N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006101612299A CN100561187C (zh) | 2006-12-15 | 2006-12-15 | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2006101612299A CN100561187C (zh) | 2006-12-15 | 2006-12-15 | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1995975A CN1995975A (zh) | 2007-07-11 |
| CN100561187C true CN100561187C (zh) | 2009-11-18 |
Family
ID=38251122
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2006101612299A Expired - Fee Related CN100561187C (zh) | 2006-12-15 | 2006-12-15 | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100561187C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102277410A (zh) * | 2011-08-16 | 2011-12-14 | 南京欣迪生物药业工程有限责任公司 | 一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒及应用 |
| CN103484525A (zh) * | 2012-06-14 | 2014-01-01 | 北京和信非凡生物技术有限公司 | 一种α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性检测方法、底物和试剂 |
| CN104297179A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-01-21 | 宁波医杰生物科技有限公司 | 用于检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的试剂 |
| CN104297181A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-01-21 | 宁波大学 | 一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测试剂 |
-
2006
- 2006-12-15 CN CNB2006101612299A patent/CN100561187C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| CX4全自动生化分析仪测定血清中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶. 宋光，夏坚明，宇英久.大连大学学报，第6卷第4期. 1996 |
| CX4全自动生化分析仪测定血清中的N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶. 宋光，夏坚明，宇英久.大连大学学报，第6卷第4期. 1996 * |
| 尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶自动化测定. 顾华庆，徐炜峰，戴强.江西医学检验，第22卷第3期. 2004 |
| 尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶自动化测定. 顾华庆，徐炜峰，戴强.江西医学检验，第22卷第3期. 2004 * |
| 改良的动力学光度法测定尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖酶. 高树森，王贤俊.中国冶金工业医学杂志，第21卷第3期. 2004 |
| 改良的动力学光度法测定尿液N-乙酰-β-D氨基葡萄糖酶. 高树森，王贤俊.中国冶金工业医学杂志，第21卷第3期. 2004 * |
| 速率法检测尿中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶. 段勇，张秋霞，王玉明，王成芬，刘爱萍，韩林.昆明医学院学报，第16卷第2期. 1995 |
| 速率法检测尿中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶. 段勇，张秋霞，王玉明，王成芬，刘爱萍，韩林.昆明医学院学报，第16卷第2期. 1995 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1995975A (zh) | 2007-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100561187C (zh) | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 | |
| CN101173901A (zh) | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定方法 | |
| CN101169366A (zh) | 岩藻糖苷酶诊断试剂盒及岩藻糖苷酶活性测定方法 | |
| CN101173902A (zh) | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性测定方法 | |
| CN101082575A (zh) | 柠檬酸浓度的测定方法及柠檬酸诊断试剂盒 | |
| CN101173903A (zh) | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶诊断试剂盒及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性浓度的测定方法 | |
| CN101082572A (zh) | 谷氨酸浓度的测定方法及谷氨酸诊断试剂盒 | |
| CN101082573A (zh) | 果糖浓度的测定方法及果糖诊断试剂盒 | |
| CN101082568A (zh) | 乙酸浓度的测定方法及乙酸诊断试剂盒 | |
| CN1987472A (zh) | 锰浓度的测定方法及锰诊断试剂盒 | |
| CN101082571A (zh) | 苹果酸浓度的测定方法及苹果酸诊断试剂盒 | |
| CN101082570A (zh) | 乙醇浓度的测定方法及乙醇诊断试剂盒 | |
| CN102297943A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
| CN102081082A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
| CN101173898A (zh) | 单胺氧化酶诊断试剂盒及单胺氧化酶活性浓度测定方法 | |
| CN101464329A (zh) | 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法 | |
| CN101169368A (zh) | 岩藻糖苷酶诊断试剂盒及岩藻糖苷酶活性浓度测定方法 | |
| CN1975431A (zh) | 离子钙浓度的测定方法及离子钙诊断试剂盒 | |
| CN101082569A (zh) | 氨基酸浓度的测定方法及氨基酸诊断试剂盒 | |
| CN101082574A (zh) | 半乳糖浓度的测定方法及半乳糖诊断试剂盒 | |
| CN102087287A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒--9047 | |
| CN102297972A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
| CN102297973A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
| CN102297974A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 | |
| CN102087276A (zh) | 半乳糖的测定方法与半乳糖诊断/测定试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20091118 Termination date: 20171215 |