CN101464329A - 硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、谷胱甘肽二硫、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400－700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接测算出硒浓度的大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护细胞膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免疫功能，可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法：如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)鉴定硒化合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用硒依赖性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的硒诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下：
谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase；EC1.11.1.9)偶联过氧化物酶(peroxidase；EC1.11.1.7)酶促反应速率比色法。谷胱甘肽过氧化物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料—吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)—含量高低的光吸收大小；通过测量400—700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度/速度，得出硒浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
还原型色原体组合 0.1——20mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基—N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基—N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽过氧
化物酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、谷胱甘肽二硫。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、过氧化物酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷胱甘肽过氧化物酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测硒样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0030；吸光度时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达0.5mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤1.5％；试剂的灵敏度可达0.120±0.06ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
Claims (7)
1.一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒浓度测定方法，其方法原理如下：
谷胱甘肽二硫+2水 谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400—700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出硒浓度大小测定结果。
2.一种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——4000mmol/L
过氧化物酶 500——80000U/L
谷胱甘肽过氧化物酶 1000——80000U/L
谷胱甘肽二硫 1——50mmol/L
还原型色原体组合 0.1——20mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽二硫、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽二硫在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基—N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基—N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺。
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|---|---|---|---|---|
| CN111198185A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-05-26 | 迈科若(苏州)医疗科技有限公司 | 一种硒单糖的酶催化检出方法 |
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2007
- 2007-12-19 CN CNA2007101921225A patent/CN101464329A/zh active Pending
Cited By (2)
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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