CN102277410A - 一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/L pH6.8-7.0缓冲液、1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶、1.0-2.5U/L过氧化物酶和0.01-0.1％防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/L pH6.8-7.0缓冲液、100-115mmol/L生色剂、70-100mmol/L麦芽糖、0.2-1.0mmol/L 4-氨基安替比林和0.01-0.1％防腐剂。本发明还公开了该精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒在测定精浆α-糖苷酶活性中的应用。本发明仅采用2种液体试剂，试剂种类和用量都减少了许多；采用速率法检测，样本不需预稀释，缩短了反应时间；与全自动生化仪配套使用，简化了步骤，节省了试剂，降低了人为误差，自动化、规模化的检测，在提高检测结果准确性和可靠性的同时，大大提高了检测效率。

Description

一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学检验测定技术领域，涉及一种体外诊断用试剂盒及其应用，具体地说是一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒及其应用。

背景技术

附睾是精子输送、成熟、贮存的场所，附睾分泌功能的下降会对精子的活性和功能产生不良影响。目前，用以检测附睾分泌功能的指标有甘油磷酸胆碱、左旋肉碱以及α-糖苷酶(α-糖苷酶)。研究表明，与左旋肉碱和甘油磷酸胆碱相比，在输精管结扎和确诊为生殖道梗阻的患者中，α-糖苷酶对附睾分泌功能的检测更加特异和灵敏，被认为是附睾分泌功能的标志酶和特异性酶。在输精管结扎、梗阻、切除或先天性精囊缺如、发良不良的患者中，α-糖苷酶活性显著降低；另外，在不完全射精或射精过频以及附睾炎、附睾分泌功能紊乱的患者中，该酶活性也呈现下降现象。相反，α-糖苷酶活性越高，则精子与透明带结合能力越强，宫腔内人工授精成功的可能性越大。精浆α-糖苷酶结合其它指标如精浆果糖、精子染色等的检测，还可实现梗阻性无精子症患者的梗阻部位定位，分泌型或排泄型无精症的鉴别、附睾水平上局部梗阻的判断等，被认为是一种快速、敏感、无创伤性的检测方法。

目前，精浆α-糖苷酶(α-GLUC)活性定量检测的方法主要是化学比色法，该法多为手工或半自动操作，加样程序多，操作步骤复杂，试剂和样品混匀一定的时间后，通过分光光度计逐一比色测定，再根据公式计算出结果，不但耗时耗力，而且人为误差也比较大。

现在，临床生化检验基本上都实现了自动化分析。全自动生化仪就是将原始手工操作过程中的取样、混匀、温育、检测、结果计算、判断、显示和打印结果及清洗等步骤全部或者部分自动运行，由于其测量速度快、准确性高、消耗试剂量小，现已在各级医院、防疫站、计划生育服务站等得到了广泛应用，配合使用可大大提高常规生化检验的效率和收益。遗憾的是，截止到目前，无论是国外还是国内，对于精浆α-糖苷酶项目的检测，除了早期的科研成果外，尚没有一种可与全自动生化仪相配套的、商品化的检测试剂盒问世，因此，建立一种与全自动生化仪相配套使用的精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒及检测方法就显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，填补市场上的空缺，提供一种与全自动生化仪相配套使用的精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供所述精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒在检测精浆α-糖苷酶活性中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：

一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/L pH6.8-7.0缓冲液、1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶、1.0-2.5U/L过氧化物酶和0.01-0.1％防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/LpH6.8-7.0缓冲液、100-115mmol/L生色剂、70-100mmol/L麦芽糖、0.2-1.0mmol/L 4-氨基安替比林和0.01-0.1％防腐剂；

其中，所述生色剂为苯酚、2，4-二氯酚、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠或4-氨基-3-甲基苯甲酸；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液；所述防腐剂为硫柳汞、庆大霉素或ProClin系列防腐剂中任意一种。

所述的精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒在检测精浆α-糖苷酶活性中的应用。

其中，利用精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒监测检测精浆α-糖苷酶活性，包括如下步骤：

1)样品制备：新鲜精液液化后通过3000～5000rpm离心10～20min，所获得的上清液即是；

2)在全自动生化仪上输入基本参数如下：

检测项目：α-GLUC；

样品试剂比：1∶60；

试剂比例：R1∶R2＝1∶4；

检测方法：速率法；

定标方法：因子法；

主波长：500-520nm；

辅波长：600-700nm；

反应方向：上升；

反应时间：140-270秒；

检测时间：90-120秒；

3)定标操作：

采用因子法定标，直接输入理论因子F值即可；

F值的计算公式如下：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×10³；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积；

4)样本检测：

将制备好的精浆样本和R1试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，全自动生化仪根据理论因子得出样本中α-糖苷酶的活性：

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol麦芽糖分解所需的酶量为一个酶活性单位；

精浆中α-糖苷酶活性(U/L)＝ΔA/min×F

其中，ΔA/min即每分钟吸光度的变化率，F值为已知。

所述R1试剂为液体溶液，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，用于为反应提供适宜的反应条件；R1试剂中，1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶和1.0-2.5U/L过氧化物酶是发挥其作用的有效用量，分别用于氧化反应生成葡萄糖和过氧化氢。

所述R2试剂为液体溶液，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，用于为反应提供适宜的反应条件；R2试剂中，麦芽糖的含量为70-100mmol/L，用作α-糖苷酶反应的底物；低于底物的下限70mmol/L时，会导致试剂盒的线性范围降低，吸光度变化不明显，高于底物的上限100mmol/L时，会使试剂盒的成本增加，不符合试剂反应的经济效益，在70-100mmol/L范围内，底物的浓度越高，每分钟吸光度的变化速率越快；R2试剂中，所用生色剂为苯酚(Phenol，P)，浓度为100-115mmol/L，是在反应中起显色作用的有效用量，还可以是2，4-二氯酚(2，4-Dichlorophenol，2.4-DCP)、4-氨基-3-甲基苯甲酸(4-Amino-3-methylbenzoic acid)和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(3，5-Dichloro-2-hydroxybenzenesμlfonic acid sodium salt，DHBS)等；R2试剂中，0.2-1.0mmol/L的4-氨基安替比林是与生色剂一起发挥作用的有效用量，是生成红色产物醌亚胺的不可或缺的一种成分；

所述防腐剂为硫柳汞，含量为0.01-0.1％，该范围在有效杀菌的同时不会对反应起任何副作用，可延长试剂盒的有效期，还可以是其它具有防腐作用的庆大霉素或ProClin系列防腐剂中的任何一种等，但应避免使用叠氮钠，其对α-糖苷酶的活性有一定的抑制作用。

上述应用的方法中，所述步骤1)中，所制备的精浆样本可于分离当天检测，也可于-20℃以下冻存备用，至少可保存2周以上，但应避免反复冻融；所述步骤2)中，样本试剂比应根据全自动生化仪的参数而定，应考虑到全自动生化仪的最小加样量，比色皿的反应液体积范围等；所述步骤3)中，理论因子F值在不同的全自动生化仪上会有所不同，理论因子F值的计算公式为：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×103；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积；所述步骤4)中，当样本中α-糖苷酶的活性过高，超出试剂盒的线性范围时，应用生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数即可。

本发明的检测方法是酶法检测，所述的R1试剂、R2试剂为含葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、麦芽糖、防腐剂的磷酸盐缓冲溶液，检测原理是，

在α-糖苷酶的催化下，麦芽糖分解为α-D-葡萄糖，α-D-葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，生成过氧化氢，再利用Trinder反应系统，在过氧化物酶催化下，与4-氨基安替比林和苯酚，生成红色醌亚胺，醌亚胺在500-520nm波长处有最大吸收峰，通过监测500-520nm波长处的每分钟吸光度变化率，进而检测出样本中α-糖苷酶的活性。

与现有技术相比，突出的技术效果在于：

1、本试剂盒采用速率法检测精浆α-糖苷酶的活性，仅采用2种液体试剂，可于4℃保存备用，与传统的手工法相比，速率法更适于α-糖苷酶活性的检测，所用试剂的种类和用量都明显减少，检测时间也显著缩短；

2、采用本试剂盒及检测方法，样本制备好后不需要预稀释，检测过程也不需单独再做空白管、标准管，简化了操作步骤，降低了人为误差；双波长的检测方法扣除了试剂本身的吸光度变化率，使得检测结果更加准确；

3、本发明实现了从手工向全自动检测方法的转变，填补了市场上的空缺，采用全自动生化仪进行自动化、规模化的检测，释放了大量的人力，节约了大量的耗材，对反应时间、反应过程的准确控制和监测，显著提高了检测结果的准确性和可靠性；

4、采用本发明可以在检测同一份样本a-GLUC活性的同时，还可以与全自动生化仪相配套的精浆果糖、γ-L-谷氨酰基转肽酶、锌等试剂盒联合使用，并同时检测这些项目，检测结束后，可以以报告的形式打印出同一份样本所测项目的所有结果，可满足医院男性不育相关科室、人类精子库、计划生育研究所等机构对精液质量、精子筛选的需要，以及对于男性不育症的辅助诊断等，大大提高了精液常规生化分析的效率和收益，非常适于常规检测和推广。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例中的一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒为双试剂，包括R1试剂和R2试剂，分别按以下成分和用量配制：

1)R1试剂

pH7.0磷酸盐缓冲液        100mmol/L；

葡萄糖氧化酶             1.2U/L；

过氧化物酶               1.2U/L；

硫柳汞                   0.05％；

2)R2试剂：

pH7.0磷酸盐缓冲液        100mmol/L；

苯酚                     106mmol/L；

麦芽糖                   87mmol/L；

4-氨基安替比林           0.4mmol/L；

庆大霉素                 0.05％；

上述试剂全部溶解完全后，分装入瓶，制成液体双试剂，直接使用。

实施例2

本实施例中的一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒为双试剂，包括R1试剂和R2试剂，分别按以下成分和用量配制：

1)R1试剂

pH6.8磷酸盐缓冲液        110mmol/L；

葡萄糖氧化酶             2.0U/L；

过氧化物酶               2.0U/L；

庆大霉素                     0.1％；

2)R2试剂：

pH6.8磷酸盐缓冲液            110mmol/L；

3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠     100mmol/L；

麦芽糖                       70mmol/L；

4-氨基安替比林               1.0mmol/L；

ProClin150                   0.1％；

上述试剂全部溶解完全后，分装入瓶，制成液体双试剂，直接使用。

实施例3

本实施例中的一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒为双试剂，包括R1试剂和R2试剂，分别按以下成分和用量配制：

1)R1试剂

pH6.9Tris缓冲液            90mmol/L；

葡萄糖氧化酶               3.0U/L；

过氧化物酶                 2.5U/L；

ProClin300                 0.01％；

2)R2试剂：

pH6.9Tris缓冲液            90mmol/L；

4-氨基-3-甲基苯甲酸        115mmol/L；

麦芽糖                     100mmol/L；

4-氨基安替比林             0.2mmol/L；

ProClin950                 0.01％；

上述试剂全部溶解完全后，分装入瓶，制成液体双试剂，直接使用。

实施例4

利用实施例1中的试剂盒检测精浆中α-糖苷酶活性的方法，具体操作步骤如下：

1)样品制备：新鲜精液液化后通过3000rpm离心10min，所获得的上清液即是；

2)在Olympus AU400全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下：

检测项目：α-GLUC；

样品量：5μl；

R1试剂和R2试剂用量比为4∶1；R1试剂量：240μl；R2试剂量：60μl；

检测方法：速率法；

定标模式：MB(因子法)；

主波长：520nm；

辅波长：660nm；

反应方向：上升；

主读数点1：21；

主读数点2：26；

3)定标操作：采用因子法定标，直接输入理论因子F值4427即可；

F值的计算公式如下：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积即305μl；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×10³；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积即5μl；

4)样本检测：

将1)中制备好的精浆样本和R1试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，全自动生化仪根据理论因子自动计算出样本中α-糖苷酶的活性。

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol麦芽糖分解所需的酶量为一个酶活性单位；

精浆中α-糖苷酶活性(U/L)＝ΔA/min×F，其中，ΔA/min即每分钟吸光度的变化率，在全自动生化仪上自动测定给出，理论因子为已知。

例如，全自动生化仪测得某份精浆中的ΔA/min为0.0546，则该份精浆中α-糖苷酶活性＝0.0546×4427＝241.71U/L

实施例5

利用实施例2中的试剂盒检测精浆中α-糖苷酶活性的方法，具体操作步骤如下：

1)样品制备：新鲜精液液化后通过5000rpm离心10min，所获得的上清液即是；

2)在劳拉Faith-1000全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下：

检测项目：α-GLUC；

样品量：6μl；

R1试剂和R2试剂用量比为4∶1；R1试剂量：288μl；R2试剂量：72μl；

检测方法：速率法；

定标模式：因子法；

主波长：510nm；

辅波长：630nm；

反应方向：上升；

主读数点1：28；

主读数点2：32；

3)定标操作：

采用因子法定标，直接输入理论因子F值4427即可；

F值的计算公式如下：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积即366μl；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×10³；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积即6μl；

4)样本检测：

将1)中制备好的精浆样本和R1试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，全自动生化仪根据理论因子自动计算出样本中α-糖苷酶的活性。

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol麦芽糖分解所需的酶量为一个酶活性单位；

精浆中α-糖苷酶活性(U/L)＝ΔA/min×F，其中，ΔA/min即每分钟吸光度的变化率，在全自动生化仪上自动测定给出，理论因子为已知。

例如，全自动生化仪测得某份精浆中的ΔA/min为0.0366，则该份精浆中α-糖苷酶活性＝0.0366×4427＝162.03U/L

实施例6

利用实施例3中的试剂盒检测精浆中α-糖苷酶活性的方法，具体操作步骤如下：

1)样品制备：

新鲜精液液化后通过4500rpm离心15min，所获得的上清液即是；

2)在Olympus AU400全自动生化仪的操作软件上输入基本参数如下：

检测项目：α-GLUC；

样品量：4μl；

R1试剂和R2试剂用量比为4∶1；R1试剂量：192μl；R2试剂量：48μl；

检测方法：速率法；

定标模式：MB(因子法)；

主波长：520nm；

辅波长：700nm；

反应方向：上升；

主读数点1：15；

主读数点2：22；

3)定标操作：

采用因子法定标，直接输入理论因子F值4427即可；

F值的计算公式如下：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积即244μl；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×10³；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积即4μl；

4)样本检测：

将1)中制备好的精浆样本和R1试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，输入样本的检测信息后，开始检测。测试结束后，全自动生化仪根据理论因子自动计算出样本中α-糖苷酶的活性；

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol麦芽糖分解所需的酶量为一个酶活性单位；

精浆中α-糖苷酶活性(U/L)＝ΔA/min×F，其中，ΔA/min即每分钟吸光度的变化率，在全自动生化仪上自动测定给出，理论因子为已知；

例如，某份精浆用生理盐水稀释2倍后，全自动生化仪测得的ΔA/min为0.0304，则该份精浆中α-糖苷酶活性＝0.0304×4427×2＝269.16U/L；

实施例7

在实施例1和实施例4的基础上进行批内和批间精密度的检测(即本发明的试剂盒的检测结果的重现性)

选择α-糖苷酶活性低、高值的混合精浆样本各1份，准备5个批次的检测试剂盒，每个批次试剂盒测同一个浓度精浆样本8次，共有40个数据，从5个批次中每一样本重复测定8次的结果算出批内精密度，从所有40个结果计算出批间精密度，结果均以变异系数的百分数即CV％表示。其中，CV％＝标准差/平均值×100％，该系数越小，表明同一份样本重复检测结果的离散程度越小，即检测结果的重现性越好。表1是采用所述试剂盒及检测方法与手工或半自动的精密度比较结果，表明采用本发明检测精浆α-糖苷酶的活性，结果重现性好。

表1手工、半自动和全自动的精密度结果比较

	手工检测	半自动检测	本发明的全自动检测
				批内精密度	CV％≤15％	CV％≤10％	CV％≤8％
批间精密度	CV％≤15％	CV％≤13％	CV％≤8％

实施例8

在实施例1和实施例4的基础上进行线性范围的检测(即本发明的试剂盒可准确测量的活性范围)。

选取α-糖苷酶活性低、高值的混合精浆样本各1份，低值样本为1号样本，高值样本为5号，二者3∶1混合为2号，等分混合为3号，1∶3混合为4号，1∶4混合为5号，制备成5个等浓度梯度的样本，每个浓度样本重复检测4次取平均吸光度，根据实验结果，以样本号为X轴，以平均吸光度为Y轴，进行直线回归，发现相关系数R≥0.990，根据吸光度乘以定标因子4427，得出α-糖苷酶活性的线性范围为70-624U/L，表示在该范围内，α-糖苷酶的活性与吸光度之间的相关性好，是本发明试剂盒可准确测量的活性范围。

实施例9

在实施例1和实施例4的基础上通过回收试验验证准确度。

选取α-糖苷酶活性的高值和低值混合样本各1份，用低值混合样本对高值混合样本进行不同比例稀释，低值样本分别占75％、50％、25％，每份样本重复测定4次，分别计算平均回收率，其平均回收率分别表示为回收率1、回收率2和回收率3。其中，回收率＝实测结果/理论结果×100％，回收率越接近100％，表示检测结果的准确度越高。表2是采用所述试剂盒及检测方法与手工或半自动的回收率比较结果，表明采用本发明检测精浆α-糖苷酶的活性，结果准确度好。

表2手工、全自动、半自动的回收结果比较

	手工检测	半自动检测	本发明的全自动检测
				回收率1	84％	86％	94.2％
回收率2	80％	83％	93.3％
				回收率3	77％	87％	101.2％
平均回收率	80％	85％	96.2％

实施例10

在实施例1和实施例4的基础上进行试剂空白吸光度变化率的检测。

将α-糖苷酶反应体系中的样本换成蒸馏水进行检测，其它检测条件不变，所测结果即为试剂空白吸光度变化率(ΔA/min)，是该试剂盒的质量指标之一。多次检测结果表明，ΔA/min≤0.01，当超出该范围时，提示可能操作不当或试剂已过期。

实施例11

在实施例1和实施例4的基础上进行正常参考值范围的确定

收集193例精液常规分析参数均正常的健康体检者精浆样本，年龄19～45岁，在全自动生化仪上进行检测，检测结果经正态性检验若确定为正态分布，根据根据(平均值)±1.96S(标准差)计算参考范围，否则按百分位数法计算参考区间。用SPSS17.0统计分析软件分析发现，其结果呈正态分布，参考范围为：118.92-530.95U/L。

本发明所述实施例2和实施例5、实施例3和实施例6以及所述其它浓度范围内的试剂盒及检测方法，其精密度、准确度、线性范围和试剂空白吸光度变化率的检测方法和步骤与实施例1和实施例4的类似，在此不再赘述。

Claims (3)

1.一种精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/L pH6.8-7.0缓冲液、1.0-3.0U/L葡萄糖氧化酶、1.0-2.5U/L过氧化物酶和0.01-0.1％防腐剂；R2试剂包括以下含量的组份：90-110mmol/L pH6.8-7.0缓冲液、100-115mmol/L生色剂、70-100mmol/L麦芽糖、0.2-1.0mmol/L 4-氨基安替比林和0.01-0.1％防腐剂；

其中，所述生色剂为苯酚、2，4-二氯酚、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠或4-氨基-3-甲基苯甲酸；

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液；

所述防腐剂为硫柳汞、庆大霉素或ProClin系列防腐剂中任意一种。

2.权利要求1所述的精浆α-糖苷酶活性定量检测试剂盒在检测精浆α-糖苷酶活性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

1)样品制备：新鲜精液液化后通过3000～5000rpm离心10～20min，所获得的上清液即是；

2)在全自动生化仪上输入基本参数如下：

检测项目：α-GLUC；

样品试剂比：1∶60；

试剂比例：R1∶R2＝1∶4；

检测方法：速率法；

定标方法：因子法；

主波长：500-520nm；

辅波长：600-700nm；

反应方向：上升；

反应时间：140-270秒；

检测时间：90-120秒；

3)定标操作：

采用因子法定标，直接输入理论因子F值即可；

F值的计算公式如下：

其中，10³为mmol至μmol的转化系数；Vt为反应液总体积；ε为醌亚胺的理论摩尔消光系数即13.78×10³；L为比色皿光径(1cm)；Vs为样品体积；

4)样本检测：

将制备好的精浆样本和R1试剂、R2试剂放在全自动生化仪的相应位置上，全自动生化仪根据理论因子得出样本中α-糖苷酶的活性：

酶活性单位U定义：在上述反应条件下，每分钟催化1μmol麦芽糖分解所需的酶量为一个酶活性单位；

精浆中α-糖苷酶活性(U/L)＝ΔA/min×F

其中，ΔA/min即每分钟吸光度的变化率，F值为已知。