CN106290346A - 超氧化物歧化酶的测定试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超氧化物歧化酶测定试剂及制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。由R1试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1试剂是由乙二醇二乙醚二胺四乙酸溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由邻苯三酚溶解于添加有乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的超氧化物歧化酶标准样是由牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将发明应用于超氧化物歧化酶的测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

Description

超氧化物歧化酶的测定试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种超氧化物歧化酶的测定试剂及其制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。

背景技术

超氧化物歧化酶Orgotein(Superoxide Dismutase，SOD)，别名肝蛋白。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。

超氧化物歧化酶(SOD)为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基O₂(超氧阴离子自由基)，而O₂具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。

O₂-称为超氧阴离子自由基，而是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。

临床证明：SOD常用于对缺血、出血性心、脑等重要脏器病伤(或手术治疗后)引发的继发性(自由基)过氧化损伤及其自由基清除药物治疗效果的监测，以指导临床制定相应的自由基清除干预对策及最佳治疗时间窗的确立，它对自由基继发损伤病情的诊断、自由基清除治疗疗效跟踪和预后判断与评估等具有重要参考价值，具体如下：

(1)SOD水平降低

1)生理性降低：①机体抗氧化营养素摄入不足，如VitE、VitA、VitC、β-胡萝卜素、硒、铜、锌、锰等缺乏，硒是GSHPx的组成部分，铜锌是Cu/Zn-SOD的成分，锰是Mn-SOD的成分；②一般老年人清除酶活力降低，老年人新陈代谢功能下降，酶诱导生成减少，不能维持自由基的低浓度动态平衡。

2)病理性降低：①脑部神经疾病脑血管病，如急性脑梗死、脑出血、蛛网膜下腔出血、HIE(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy，缺氧缺血性脑病)、外伤：颅脑损伤；②缺血性心脏病心肌缺血(冠状动脉粥样硬化性心脏病)、急性心肌梗塞；③医学手术救治治疗后继发损伤，缺血-再灌注损伤(IRI)，高压氧(HBO)治疗后过度氧化损伤，放射治疗后过氧化损伤：放射性脑病，SOD水平增高。

3)生理性增高：长时间外源性增加过多的SOD，机体将不能维持一定量的自由基水平，免疫细胞使用自由基作为一个方法执行其免疫功能，过低的自由基会引起生理生化过程失常，破坏正常的生理功能，如:机体解毒、吞噬功能下降、凝血过程受阻及胶原蛋白、前列腺素、环核苷酸合成受损等，并引起严重的毒副作用。

4)病理性增高：国内外研究表明，在急性病患发生初期，当机体自由基产生大幅过多激增时，机体会很快引起氧化应激，并影响到蛋白质表达等调节、应答机制。在自由基的诱导及机体代偿应激下，细胞或机体会诱导性地增强抗氧化能力，一般会出现一过性SOD水平增高现象。但随着高浓度自由基对SOD的大量消耗，以及机体的失代偿，SOD的生物合成能力会很快回落到低水平，并与较高浓度的自由基保持新的动态平衡。

目前国内测定超氧化物歧化酶的方法主要有：

(1)细胞色素C还原法，该方法灵敏度较低。

(2)化学发光法，该方法虽然灵敏度高，但不稳定，重复性较差。

(3)酶联免疫法，该方法只能测定抗体相应的抗原，对于检测不同种类的SOD，则须制备相应的特异性抗体，手续繁琐。

基于此，做出本申请。

发明内容

针对现有超氧化物歧化酶在测试过程中存在的上述缺陷，本发明首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便，采用国内外先进的比色法，适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的超氧化物歧化酶测定试剂。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

一种超氧化物歧化酶的测定试剂，由R1试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1试剂是由乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由邻苯三酚溶解于添加有乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的超氧化物歧化酶标准样是由牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。

进一步的，作为优选：

所述的R1试剂中，缓冲液为Tris缓冲液，更优选的，所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为1mmol/L，Tris缓冲液的浓度为100mmol/L。

所述的R2试剂中，邻苯三酚的浓度为20mmol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度20mmol/L，叠氮钠的浓度为1g/L。

所述的标准样中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，更优选的，所述的牛血清蛋白的浓度为0.1％，磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，叠氮钠浓度为0.1％。

同时，本申请还提供了一种具有上述特征超氧化物歧化酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)R1试剂配制：向Tris缓冲液中加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸，搅拌至完全溶解后定容；

(2)R2试剂配制：向纯化水中加入邻苯三酚，搅拌至完全溶解；加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌至溶解；添加叠氮钠搅拌至溶解，继续搅拌后定容；

(3)标准样配制：向磷酸盐缓冲液中加入超氧化物歧化酶，搅拌至完全溶解；加入牛血清蛋白，搅拌至溶解；加入叠氮钠搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；

(4)对上述制备的R1试剂、R2试剂及标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。

进一步的，作为优选：

所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大，影响所配制溶体的表面张力和粘合力，搅拌速度过低则影响其混配效果，控制在450转/分时，在确保搅拌剪切适中的同时，也促进了其内所添加物质的融合。

步骤(1)中，所述的纯化水初始体积为2500ml，定容体积为3000ml。定容前后体积变化在20％左右，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1试剂浓度、溶液稳定性最佳。

步骤(2)中，所述的纯化水初始体积为800ml，定容体积为1000ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。

步骤(3)中，所述的纯化水初始体积为80ml，定容体积为100ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。

本发明的工作原理如下：

(1)灵敏度评价试验

根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度90U/ml吸光度差值(ΔA)≥0.09ABS。

(2)线性范围评价试验

根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。

(3)精密度评价试验

精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次。

(4)准确度评价试验

用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品，以指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。

评估结果：三批试剂的重复性变异系数CV≤8％；相对偏差≤10％；试剂线性可达250U/ml，分析灵敏度90U/ml吸光度差值(ΔA)≥0.09ABS。

本发明利用比色法测定超氧化物歧化酶的方法，其优点是快速灵敏，准确性好，特异性高，稳定性好，操作简便，可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。

附图说明

图1为本申请中抗原-吸光度曲线图；

图2为本申请中抗体-吸光度曲线图；

图3为本申请中测定试剂的准确度柱状图。

具体实施方式

实施例1

本实施例所用主要试剂：

R1试剂：Tris缓冲液：100mmol/L；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)：1mmol/L。

R2试剂：邻苯三酚：20mmol/L:；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)：50mmol/L；叠氮钠：1g/L。

标准样：磷酸盐缓冲液：50mmol/L；牛血清蛋白(BSA)：0.1％；叠氮钠：0.1％。

1)R1试剂的配制

①将2500mlTris缓冲液加入到适当容器中。

②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。

③称取1.1411g乙二醇二乙醚二胺四乙酸加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

④搅拌十分钟以上。

⑤定容至3000ml。

2)R2试剂的配制

①将800ml纯化水加入到适当容器中。

②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。

③称取2.5222g邻苯三酚加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。

④称取18.612g乙二胺四乙酸二钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

⑤称取1.0g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

⑥搅拌十分钟以上。

⑦定容至1000ml。

3)标准品的配制

①将80ml磷酸盐缓冲液加入到适当容器中。

②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。

③称取0.1856g超氧化物歧化酶加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

④称取0.0045g牛血清蛋白加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

⑤称取0.042g叠氮钠加入上述溶液中，搅拌至完全溶解。

⑥搅拌十分钟以上。

⑦定容至100ml。

4)试剂检验

①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。

测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定，基本测定参数如下：

a.方法：终点法，反应方向：向上；波长：405nm，温度37℃。

b.比色杯光径：1cm；R1试剂:225μl,R2试剂:75μl，超氧化物歧化酶标准样：15μl。

c.第一测光点：在R1加入后5分钟读取；第二测光点：在R2加入后5分钟读取。

②试剂外观检查：目测检查。

③装量检查：用通用量具测量。

④试剂空白测定:

用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂)，A2即为工作试剂的空白吸光度。

⑤线性范围测定:

取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。

表1 样本稀释表

实施例	1	2	3	4	5
						生理盐水(ml)	0	0.5	0.5	0.5	0.5
高值标本H(ml)	1	0.5	0.5	0.5	0.5
						稀释比例	原倍	1/2	1/4	1/8	1/16

实施例1样本的浓度为已知定值CH，实施例2-5样本浓度按公式：样本浓度＝CH×稀释比例，计算作为预期值，将稀释好的样本系列充分混匀，在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次，均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测)。

统计学分析：以预期值为横坐标，样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析，确定线性区间计算出直线方程y＝a+bx及相关系数，当相关系数r≥0.990时为线性良好。

数据分析处理采用Microsoft Excel软件。

相关公式如下：

$b=\frac{{\mathrm{n\ΣX}}_i{Y}_i-{\mathrm{\ΣX}}_i\·{\mathrm{\ΣY}}_i}{{{\mathrm{n\ΣX}}_i}^2-{\left({\mathrm{\ΣX}}_i\right)}^2}...\left(1\right)$

$\left|a\right|=\frac{|{\mathrm{\ΣY}}_i-{\mathrm{b\ΣX}}_i|}{n}...\left(2\right)$

$r=\frac{{\mathrm{n\ΣX}}_i{Y}_i-{\mathrm{\ΣX}}_i\·{\mathrm{\Σy}}_i}{\sqrt{\[n\·{\mathrm{\ΣX}}_i-\left({\mathrm{\ΣX}}_i\right)\]\[{\mathrm{n\ΣY}}_i-\left({\mathrm{\ΣX}}_i\right)\]}}...\left(3\right)$

式中，C：浓度；V：容积；b：回归线的斜率；∣a∣：回归线截距的绝对值；r：相关系数；Xi：各管预期值；Yi：各管测定值；i：1、2、3.……、n；n：测定样本数。

⑥精密度测定:

a.重复性测定:

用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。

与变异系数CV(％)：

$\stackrel{\‾}{X}=\mathrm{\Σ}X1/n...\left(4\right)$

$CV=\sqrt{\frac{\mathrm{\Σ}(\stackrel{\‾}{X}-X_i)}{{\left(\stackrel{\‾}{X}\right)}^2(n-1)}}...\left(5\right)$

式中：——待测血清样本的均值；

Xi——测定血清样本的测定结果；

n——测定次数；

CV——变异系数。

b.批间差测定

取三个批号送检试剂，每个批号取3瓶，分别测定1份临床样本或质控血清，可选用罗氏质控品，分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用Microsoft Excel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。

相关公式如下:

式中：

——中的最大值；

——中的最小值；

——总均值。

⑦准确性测定:

比对试验：相关系数r≥0.990。相对偏差≤10％；

⑧分析灵敏度:

用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。

根据表1计算得到的预期值、实测值、变异系数CV、批间极差、相对偏差B以及吸光度差值ΔA汇总入表2。

表2 测试结果汇总表a

表3 平行实验测试结果汇总表

表4 分析灵敏度对照表(1-20为平行实验序号)

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										0.1102	0.1123	0.1152	0.112	0.1059	0.1064	0.1067	0.1059	0.1043	0.1044
11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
										0.1121	0.1119	0.1116	0.1109	0.1123	0.1142	0.1136	0.1131	0.11	0.1128

表5 批内重复性对照表

表6 批间精密度对照表

评估结果及表2-6结果表明：本申请试剂的重复性变异系数CV≤8％；相对偏差≤10％；试剂线性可达250U/ml，分析灵敏度90U/ml吸光度差值(ΔA)≥0.09ABS。

本申请利用比色法测定超氧化物歧化酶的方法，快速灵敏，准确性好，特异性高，稳定性好，操作简便，可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

Claims (10)

1.超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：由R1试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1试剂是由乙二醇二乙醚二胺四乙酸溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是由邻苯三酚溶解于添加有乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；所述的超氧化物歧化酶标准样是由牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。

2.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：所述的R1试剂中，缓冲液为Tris缓冲液。

3.如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：所述的乙二醇二乙醚二胺四乙酸的浓度为1mmol/L，缓冲液的浓度为100 mmol/L。

4.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：所述的R2试剂中，邻苯三酚的浓度为20mmol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度20mmol/L，叠氮钠的浓度为1g/L。

5.如权利要求1所述的超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：所述的标准样中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求1或5所述的超氧化物歧化酶的测定试剂，其特征在于：所述的牛血清蛋白的浓度为0.1%，缓冲液的浓度为50 mmol/L，叠氮钠浓度为0.1%。

7.如权利要求1所述超氧化物歧化酶测定试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）R1试剂配制：向缓冲液中加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸，搅拌至完全溶解后定容；

（2）R2试剂配制：向纯化水中加入邻苯三酚，搅拌至完全溶解；加入乙二胺四乙酸二钠，搅拌至溶解；添加叠氮钠搅拌至溶解，继续搅拌后定容；

（3）标准样配制：向缓冲液中加入超氧化物歧化酶，搅拌至完全溶解；加入牛血清蛋白，搅拌至溶解；加入叠氮钠搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；

（4）对上述制备的R1试剂、R2试剂及标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。

8.如权利要求7所述的超氧化物歧化酶测定试剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的纯化水初始体积为2500ml，定容体积为3000ml。

9.如权利要求7所述的超氧化物歧化酶测定试剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的纯化水初始体积为800ml，定容体积为1000ml。

10.如权利要求7所述的超氧化物歧化酶测定试剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的纯化水初始体积为80ml，定容体积为100ml。