CN102692411A - 一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种医药试剂，具体的说是一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，由以下物质组成，从血液样品中的红细胞释放血红蛋白的溶解缓冲剂；能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶；能够氧化并消除样本中的干扰物质的氧化剂；能够将血红蛋白变性并且能够加快蛋白酶反应速率的氧化剂；能够加快蛋白酶反应速率的加速反应剂；与物质a中能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段进行氧化还原反应的果糖基氨基酸氧化酶；能够与产生的过氧化氢发生显色反应的显色剂；能够催化过氧化氢和显色剂发生显色反应的过氧化物酶。本发明同现有技术相比，可以直接对糖化血红蛋白进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药试剂，具体的说是一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂。
背景技术
由于血液中的糖化血红蛋白反映了生物中血糖值过去的情况，因此被作为糖尿病的诊断和治疗的重要指标。对于检测糖化血红蛋白，例如：HPLC、电泳法、免疫法等。但是对于上述的HPLC法、电泳法，需要专用的仪器设备，检测成本高昂，目前对于我国普及面不大，对于上述的免疫法等，成本虽然比较低，但是存在准确度和灵敏度低的缺点。
因此，对于测定糖化血红蛋白，酶法具备了不需要专用的仪器，检测成本低，且通过特异性蛋白酶对糖化血红蛋白切断为糖化多肽及糖化氨基酸，并通过特异性的氧化还原反应进行显色测定，因此准确度及灵敏度都较高，稳定性能较好。
采用的酶法测定糖化血红蛋白百分比的方法，即首先，蛋白酶作用于糖化血红蛋白，通过切下含β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段，在通过果糖基氨基酸氧化酶（FAOD）作用于上述切断的糖化片段，产生过氧化氢。通过过氧化物酶的氧化作用和显色剂的显色反应得到的过氧化氢的量与上述糖化血红蛋白的百分比成正比例关系。目前测定糖化血红蛋白百分比用的比较多的方法是在双通道测定糖化血红蛋白百分比，即反应分两步进行，第一步反应是测定样本中的总血红蛋白的量，第二步反应是测定样本中糖化血红蛋白的量，最后得到两步反应后数值的比值，即糖化血红蛋白的百分比，这种形式对于仪器需要占用两个通道，这样的方法对于医院的应用带来了很多的不便。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂。
为了实现上述目的，本发明设计了一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：由以下物质组成，
（a）从血液样品中的红细胞释放血红蛋白的溶解缓冲剂；
（b）能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶；
（c）能够氧化并消除样本中干扰物质的氧化剂；
（d）能够将血红蛋白变性并且能够加快蛋白酶反应速率的氧化剂；
（e）能够加快蛋白酶反应速率的加速反应剂；
（f）与物质a中能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段进行氧化还原反应的果糖基氨基酸氧化酶；
（g）能够与产生的过氧化氢发生显色反应的显色剂；
（h）能够催化过氧化氢和显色剂发生显色反应的过氧化物酶。
所述物质a中的缓冲剂为TritonX-100、Tween-20、Brij35中的一种；添加的浓度为0.1%-1%的重量，室温下静置3-10分钟即可溶血完全。
所述物质b中的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、猪胰蛋白酶、氨肽酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种；蛋白酶的浓度范围为100-5000KU/L。
所述物质c中的氧化剂是戴斯马丁氧化剂或者高碘酸钠，其浓度范围为0.5-10mmol/L。
所述的物质d中的氧化剂为四唑鎓盐。
所述的四唑鎓盐是2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基-2H-四唑盐、2，5-二苯基-3-（间甲苯基）四唑盐、2，5-二苯基-3-（对甲苯基）四唑盐、2，3-二苯基-5-（2-噻吩基）四唑盐、铁氰化钾、碘酸钾。其中优选2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐中的一种，其浓度范围为0.05-10mmol/L。
所述物质e中的加速反应剂为葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、正十二烷基-β-D-麦芽糖、亚硝酸钾、亚硝酸钠、硝基苯中的一种，其浓度范围为0.01-1mmol/L。
所述物质f中果糖基氨基酸氧化酶是纯化的或是重组产生的。
所述果糖基氨基酸氧化酶为作用于a-氨基被糖化的氨基酸或肽，同时催化产生过氧化氢的酶，其浓度为0.2-100KU/L。
所述物质h中的过氧化物酶为辣根过氧化物酶，其浓度范围为20-800KU/L。
所述物质g中的显色剂为N-（羧甲基氨基羰基）-4，4’-双（二甲氨基）二苯基胺钠（DA-64）、10-（羧甲基氨基羰基）-3，7-双（二甲氨基）吩噻嗪盐（DA-67）、Trinder试剂中的一种，其浓度范围为0.02-10mmol/L。
本发明同现有技术相比，在不需要单独测定血液样品中总血红蛋白的条件下，可以直接对糖化血红蛋白进行测定。
附图说明
图1为本发明方法及测定试剂盒与东曹HPLC法测试结果相关性趋势图。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。
本发明是利用氧化还原反应测定试样中的糖化血红蛋白的方法，提高了现有糖化血红蛋白测定方法的准确度和精密度，并且本方法提供了测定糖化血红蛋白准确度、精密度、操作性能均优良的糖化血红蛋白测定试剂盒。
本发明的测定方法中，作为溶血缓冲液，可以使用Triton系表面活性剂、Triton系表面活性剂、Brij系表面活性剂等非离子表面活性剂，具体而言，所述的表面活性剂为TritonX-100、Tween-20、Brij35中的一种。具体添加量为，在处理溶液中血细胞的浓度为1%-10%时，添加上述表面活性剂的浓度为0.1-1%的重量，室温下静置3-10分钟即可溶血完全，上述表面活性剂的浓度不受特别限制，优选0.1-5%之间。
作为蛋白酶，可以使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、猪胰蛋白酶、氨肽酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的至少一种蛋白酶。其中优选枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶E，更加优选枯草杆菌蛋白酶中的一种，使用这种蛋白酶测定糖化血红蛋白，其中糖化血红蛋白以外的糖化蛋白质或者糖化肽很难被分解，而且，所采用的果糖基氨基酸氧化酶也只作用于糖化血红蛋白分解的糖化氨基酸，因此这种方法测定的只有糖化血红蛋白，蛋白酶的浓度不受特别限制，优选100-5000KU/L之间。
作为能够氧化并消除样本中的干扰物质的氧化剂为戴斯马丁氧化剂或者高碘酸钠，主要氧化血液中一些低分子量的还原物质，例如抗坏血酸、胆红素、尿酸等一些干扰物质，其氧化剂的浓度不受特别限制，优选0.5-10mmol/L之间。
作为能够将血红蛋白变性并且能够加快蛋白酶反应速率的氧化剂是四唑鎓盐，可以使用2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基-2H-四唑盐、2，5-二苯基-3-（间甲苯基）四唑盐、2，5-二苯基-3-（对甲苯基）四唑盐、2，3-二苯基-5-（2-噻吩基）四唑盐、铁氰化钾、碘酸钾中的一种。其中优选2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐中的一种。除了氧化血液中的血红蛋白大分子外，还可以加快蛋白酶的酶切反应，能够使反应迅速达到终点，其浓度不受特别限制，优选0.05-10mmol/L之间。
作为能够加快蛋白酶反应速率的加速反应剂，可以使用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、正十二烷基-β-D-麦芽糖、亚硝酸钾、亚硝酸钠、硝基苯等，其中优选亚硝酸钾、亚硝酸钠中的一种，在这些加速反应剂的存在下对糖化血红蛋白进行处理时，可以实现蛋白酶处理的高效率和时间缩短化，并且由于可以高效的进行蛋白酶酶切，可以不需要增加使用的蛋白酶量，进而使试剂克服了由于增加蛋白酶浓度而产生的一系列不利的作用。优选亚硝酸钾、亚硝酸钠，且浓度范围不受特别限制，优选0.01-1mmol/L之间。
作为能够与上述切断的糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段进行氧化还原反应的果糖基氨基酸氧化酶，可以使用任意的果糖基氨基酸氧化酶，可以是纯化的或是重组产生的，其中优选作用于а-氨基被糖化的氨基酸或肽，同时催化产生过氧化氢的酶，且浓度范围不受特别限制，优选0.2-100KU/L。
将上述步骤中产生的过氧化氢与显色剂发生显色反应，显色剂可以选用N-（羧甲基氨基羰基）-4，4’-双（二甲氨基）二苯基胺钠（DA-64）、10-（羧甲基氨基羰基）-3，7-双（二甲氨基）吩噻嗪盐（DA-67）、Trinder试剂中的一种，优选N-（羧甲基氨基羰基）-4，4’-双（二甲氨基）二苯基胺钠（DA-64）中的一种，其浓度范围不受特别限制，优选0.02-10mmol/L之间。而过氧化物酶是指能够催化过氧化氢和显色剂发生显色反应的酶，也可以使用商购的辣根过氧化物酶。其浓度范围不受特别限制，有限浓度范围为20-800KU/L。
通过以下实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
将新鲜血液样品用Triton X-100溶血缓冲液溶血处理3分钟后，将溶血后的样品用嗜热菌蛋白酶处理，通过果糖基氨基酸氧化酶进行氧化还原反应，对生成的过氧化氢进行显色测定。
测定所用的新鲜全血样品是糖化血红蛋白糖化率为10.9%的人全血，其糖化率是通过东曹HPLC法求得。
试样前处理液组成：
经氧化还原反应液组成：
取1ml上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品，向其中添加4ml试样前的处理液，并在37℃下反应3分钟，向以上反应液中添加1ml的氧化还原反应液，继续在37℃下反应5分钟后，通过紫外分光光度计对主波长700nm、副波长800nm处进行吸光度的测定。
实施例2：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为蛋白酶E，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
实施例3：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为枯草杆菌蛋白酶，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
实施例4：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为中性蛋白酶，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
实施例5：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为猪胰蛋白酶，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
实施例6：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为氨肽酶，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
实施例7：
将实施例1中的嗜热菌蛋白酶替换为菠萝蛋白酶，其他反应条件与实施例1相同，对上述溶血后的10.9%的糖化血红蛋白样品进行吸光度测定。
如下表所示，为以上实施例1至实施例7对吸光度的测定结果。
表一：
| 蛋白酶 | 吸光度(主波长－副波长) | |
| 实施例1 | 嗜热菌蛋白酶 | 0.023 |
| 实施例2 | 蛋白酶E | 0.052 |
| 实施例3 | 枯草杆菌蛋白酶 | 0.075 |
| 实施例4 | 中性蛋白酶 | 0.012 |
| 实施例5 | 猪胰蛋白酶 | 0.009 |
| 实施例6 | 氨肽酶 | 0.002 |
| 实施例7 | 菠萝蛋白酶 | 0.014 |
分别比较表1中各实施例中蛋白酶的作用效果，由吸光度数据可以看出，实施例3中的枯草杆菌蛋白酶反应后的吸光度最高，说明本发明中的枯草杆菌蛋白酶对糖化血红蛋白酶解效果最好，另外，实施例2中的蛋白酶E反应后的吸光度变化为0.052仅次于枯草杆菌蛋白酶的作用效果。例如实施例6中的氨肽酶基本未反应。因此，从本发明的蛋白酶选择上，优选枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶E。
实施例8：
按照下述配方配置糖化血红蛋白测定试剂组，并检测试剂组的准确度、精密度。
试剂1：
CHES缓冲液，pH9.0 1-100mmol/L
TritonX-100 0.1-5%
试剂2：
试剂3：
通过对赋值分别为5.4%和10.9%的校准品进行定标测定，测定相应的△A值，以△A为Y轴，百分含量为X轴。在自动分析仪上，采用线性模式建立校准线。计算时根据样本的△A值在校准线上找到相应的百分含量。
采用上述方法测得的糖化血红蛋白的百分比数值与试样靶值数值相关，产品靶值通过东曹HPLC方法获得。测定数值如下表二所示。
表二：
| 样品号 | 靶值 | 测定值 |
| 1 | 4.72 | 4.69 |
| 2 | 5.52 | 5.55 |
| 3 | 5.10 | 5.05 |
| 4 | 6.68 | 6.73 |
| 5 | 7.09 | 7.16 |
| 6 | 8.43 | 8.52 |
| 7 | 8.65 | 8.54 |
| 8 | 3.86 | 3.99 |
| 9 | 6.88 | 6.95 |
| 10 | 9.60 | 9.71 |
| 11 | 9.05 | 8.90 |
| 12 | 10.26 | 10.38 |
| 13 | 14.30 | 14.50 |
| 14 | 15.54 | 15.80 |
| 15 | 16.64 | 16.75 |
采用以上试剂重复测定10次糖化血红蛋白试样高低值，靶值分别为5.4%和9.6%，分别计算上述试剂的精密度。糖化血红蛋白试样高低值分别通过东曹HPLC方法赋值。计算结果如下表三所示。
表三：
| 糖化血红蛋白低值5.4% | 糖化血红蛋白低值9.6% | |
| 均值 | 5.44% | 9.78% |
| 批内SD | 0.06 | 0.08 |
| 批内CV% | 1.8% | 2.3% |
实施例9
通过本发明配制的试剂与东曹HPLC法测试糖化血红蛋白相关性分析。该相关性分析检测了50例临床样本进行比较，采用的糖化血红蛋白校准品数值分别为5.4%和10.9%，分别是通过东曹HPLC方法对全血材料的糖化血红蛋白数值进行检验并赋值，并且添加赋形剂和稳定剂后进行冻干的全血材料，糖化血红蛋白试样高值（9.6%）低值（5.3%）分别通过东曹HPLC方法赋值。测定数据见下表四所示。
表四：
| 样本号 | 本发明试剂盒HbA1c% | 东曹HPLC法HbA1c% |
| 1 | 5.43% | 5.57% |
| 2 | 5.86% | 5.97% |
| 3 | 4.17% | 4.32% |
| 4 | 4.75% | 4.89% |
| 5 | 6.25% | 6.37% |
| 6 | 5.63% | 5.73% |
| 7 | 3.78% | 3.95% |
| 8 | 5.26% | 5.42% |
| 9 | 7.50% | 7.68% |
| 10 | 4.39% | 4.51% |
| 11 | 4.37% | 4.57% |
| 12 | 6.72% | 6.97% |
| 13 | 7.73% | 7.92% |
| 14 | 5.71% | 5.92% |
| 15 | 5.52% | 5.78% |
| 16 | 6.12% | 6.37% |
| 17 | 4.28% | 4.52% |
| 18 | 4.83% | 4.97% |
| 19 | 9.46% | 9.62% |
| 20 | 5.73% | 5.92% |
| 21 | 3.16% | 3.41% |
| 22 | 7.65% | 7.73% |
| 23 | 8.91% | 9.23% |
| 24 | 7.46% | 7.68% |
| 25 | 5.83% | 5.93% |
| 26 | 8.16% | 8.34% |
| 27 | 7.65% | 7.86% |
| 28 | 8.34% | 8.51% |
| 29 | 10.42% | 10.53% |
| 30 | 3.97% | 4.16% |
| 31 | 7.83% | 8.07% |
| 32 | 11.93% | 12.18% |
| 33 | 15.67% | 15.89% |
| 34 | 13.76% | 13.93% |
| 35 | 4.83% | 5.04% |
| 36 | 6.97% | 7.18% |
| 37 | 4.65% | 4.83% |
| 38 | 12.76% | 12.97% |
| 39 | 12.34% | 12.67% |
| 40 | 7.46% | 7.69% |
| 41 | 3.43% | 3.56% |
| 42 | 5.18% | 5.34% |
| 43 | 4.47% | 4.72% |
| 44 | 5.29% | 5.56% |
| 45 | 8.72% | 8.97% |
| 46 | 4.92% | 5.27% |
| 47 | 3.75% | 3.92% |
| 48 | 3.34% | 3.57% |
| HbA1c低值 | 5.41% | 5.32% |
| HbA1c高值 | 9.73% | 9.61% |
表四中数据分别为本试剂盒测定和东曹HPLC法测定样本糖化血红蛋白数据，以东曹HPLC法为横坐标，以本法测定糖化血红蛋白测定试剂为纵坐标，做相关性分析图，所得实施例的相关分析式为：“y=0.9971x－0.0016，R2=0.9991”。
见图1所示，由以上实施例可以看出，本发明方法及测定试剂盒与东曹HPLC法测试结果相关性很好，由此可以说明本法可以精确的测定人体全血样本中的糖化血红蛋白百分比。
Claims (11)
1.一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：由以下物质组成，
（a）从血液样品中的红细胞释放血红蛋白的溶解缓冲剂；
（b）能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段的蛋白酶；
（c）能够氧化并消除样本中干扰物质的氧化剂；
（d）能够将血红蛋白变性并且能够加快蛋白酶反应速率的氧化剂；
（e）能够加快蛋白酶反应速率的加速反应剂；
（f）与物质a中能够切断糖化血红蛋白β链N基末端的糖化缬氨酸或糖化多肽片段进行氧化还原反应的果糖基氨基酸氧化酶；
（g）能够与产生的过氧化氢发生显色反应的显色剂；
（h）能够催化过氧化氢和显色剂发生显色反应的过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质a中的缓冲剂为TritonX-100、Tween-20、Brij35中的一种；添加的浓度为0.1%-1%的重量，室温下静置3-10分钟即可溶血完全。
3.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质b中的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、猪胰蛋白酶、氨肽酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶E、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种；蛋白酶的浓度范围为100-5000KU/L。
4.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质c中的氧化剂是戴斯马丁氧化剂或者高碘酸钠，其浓度范围为0.5-10mmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述的物质d中的氧化剂为四唑鎓盐。
6.根据权利要求5所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述的四唑鎓盐是2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基-2H-四唑盐、2，5-二苯基-3-（间甲苯基）四唑盐、2，5-二苯基-3-（对甲苯基）四唑盐、2，3-二苯基-5-（2-噻吩基）四唑盐、铁氰化钾、碘酸钾。其中优选2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐、2-（4-碘苯基）-3-（2，4-二硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯基）-2H-四唑盐中的一种，其浓度范围为0.05-10mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质e中的加速反应剂为葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、正十二烷基-β-D-麦芽糖、亚硝酸钾、亚硝酸钠、硝基苯中的一种或多种混合物，其浓度范围为0.01-1mmol/L。
8.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质f中果糖基氨基酸氧化酶是纯化的或是重组产生的。
9.根据权利要求8所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述果糖基氨基酸氧化酶为作用于a-氨基被糖化的氨基酸或肽，同时催化产生过氧化氢的酶，其浓度为0.2-100KU/L。
10.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质h中的过氧化物酶为辣根过氧化物酶，其浓度范围为20-800KU/L。
11.根据权利要求1所述的一种测定糖化血红蛋白百分比的试剂，其特征在于：所述物质g中的显色剂为N-（羧甲基氨基羰基）-4，4’-双（二甲氨基）二苯基胺钠（DA-64）、10-（羧甲基氨基羰基）-3，7-双（二甲氨基）吩噻嗪盐（DA-67）、Trinder试剂中的一种，其浓度范围为0.02-10mmol/L。
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