CN104673878A - 一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒 - Google Patents

一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒。所述试剂盒组成如下：试剂Ⅰ为含有菠萝蛋白酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、TritonX-100的pH7.0-10.0Tris缓冲液；试剂II为含果糖氨基酸氧化酶(FAOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液为试剂II；试剂Ⅲ为含氨基酸氧化酶(DAO)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液。

Description

一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒
技术领域
本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒。
背景技术
糖化血清白蛋白(GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物，即血清白蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短，测定糖化白蛋白的浓度可有效反映患者过去2～3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响。目前，临床广泛采用测定糖化血清白蛋白(GA)与白蛋白(ALB)浓度的比值(CGA/CALB)来反映较短期内糖尿病的控制程度。
自糖化血清白蛋白对糖尿病的诊断意义被临床所认识以来，已有阴离子交换层析法、高效液相色谱法、糖化氨基酸氧化酶分析法等诸多方法应用于血清GA的测定。前两种方法需要对GA进行复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。糖化氨基酸氧化酶分析法虽好，但只能单独检测GA浓度，而不能同时检测ALB浓度，从而无法直接报告CGA/CALB比值。为了弥补此缺点，临床工作者常采用两个独立的体系分别检测GA和ALB浓度，即用糖化氨基酸氧化酶分析法测定GA浓度、用溴甲酚绿或溴甲酚紫比色法测定ALB浓度，再进一步求出CGA/CALB比值。由于用两个独立的检测体系进行测量时影响因素多、变异系数大，得出的CGA/CALB比值存在准确性不佳、重复性差的缺点。
因此，需求一种单体系测定糖化白蛋白与白蛋白比值(CGA/CALB)的试剂盒，对提高检测结果的准确性和重复性显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，建立一种基于氨基酸氧化酶-过氧化物酶偶联、可单体系测定CGA/CALB比值的新试剂盒。该试剂盒置2-8℃保存可稳定36个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
本发明的试剂盒具体组成如下：
试剂Ⅰ为含有菠萝蛋白酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、TritonX-100的pH7.0-10.0Tris缓冲液；
试剂II为含果糖氨基酸氧化酶(FAOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液为试剂II；
试剂Ⅲ为含氨基酸氧化酶(DAO)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液。
在本发明的一个实施方案中，所述试剂I中，pH 7.00-10.00Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，菠萝蛋白酶浓度为30-120KU/L、TOOS浓度为0.5-5mmol/L、TritonX-100浓度为0.5-10ml/L。
所述试剂II中，7.0-10.0Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，FAOD浓度为20-100KU/L，POD浓度为5-30KU/L，4-AAP浓度为1.0-3.0mmol/L、海藻糖浓度为10-50g/L。
所述试剂Ⅲ中，7.0-10.0Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，DAO浓度为200-500KU/L，海藻糖浓度为10-50g/L。
在本发明另一个实施方案中，所述试剂I中，pH 8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，菠萝蛋白酶浓度为60-90KU/L、TOOS浓度为2-4mmol/L、TritonX-100浓度为4-6ml/L。
所述试剂II中，8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，FAOD浓度为40-80KU/L，POD浓度为15-20KU/L，4-AAP浓度为1.0-3.0mmol/L、海藻糖浓度为20-40g/L。
所述试剂Ⅲ中，8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，DAO浓度为300-400KU/L，海藻糖浓度为20-40g/L。
在本发明进一步地实施方案中，所述试剂I中，菠萝蛋白酶的浓度为75KU/L、TOOS浓度为2.75mmol/L、TritonX-100的浓度为5.25ml/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L；
所述试剂II中，FAOD浓度为60KU/L、POD浓度为17.5KU/L、4-AAP浓度为2.0mmol/L、海藻糖浓度为30g/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L；
所述试剂III中，DAO浓度为350KU/L、海藻糖浓度为30g/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L。
本发明试剂盒的测定原理为：
第一步，配制含有菠萝蛋白酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂Ⅰ，按一定比例加入含糖化白蛋白和白蛋白的血清样本。在TritonX-100的存在下，菠萝蛋白酶将血清样本中的糖化白蛋白(GA)和白蛋白(ALB)迅速降解为果糖氨基酸、甘氨酸等氨基酸混合物；
第二步，配制含果糖氨基酸氧化酶(FAOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)、海藻糖的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂II，将试剂II按一定比例加入到第一步试剂I和待测血清样品的混合溶液中。第一步反应中生成的果糖氨基酸被果糖氨基氧化酶所氧化产生过氧化氢，过氧化氢再在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐反应生成紫红色化合物，检测540nm的吸光度值A1，与标准对照后计算出糖化白蛋白浓度CGA；
第三步，配制含氨基酸氧化酶(DAO)、海藻糖的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂Ⅲ，将试剂Ⅲ按一定比例加入到第二步反应所得的混合溶液中。混合溶液中的氨基酸被氨基酸氧化酶反应产生过氧化氢，过氧化氢再在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐反应生成紫红色化合物，引起540nm处的吸光度值上升，检测540nm的吸光度值A2，与标准对照后计算出白蛋白浓度CALB；第四步，将第二步所测得的糖化白蛋白浓度CGA除以第三步所测得白蛋白浓度CALB得血清CGA/CALB比值。
本发明还提供了采用本发明试剂盒测定糖化白蛋白与白蛋白比值(CGA/CALB)的方法，其包括以下步骤：
(1)、配制含有菠萝蛋白酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂Ⅰ，按一定比例加入含糖化白蛋白和白蛋白的血清样本；
(2)、配制含果糖氨基酸氧化酶(FAOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)、海藻糖的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂II，将试剂II按一定比例加入到第一步试剂I和待测血清样品的混合溶液中，检测540nm的吸光度值AU,1，与标准对照后计算出血清糖化白蛋白浓度CGA；
(3)、配制含氨基酸氧化酶(DAO)、海藻糖的pH7.0-10.0三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为试剂Ⅲ，将试剂Ⅲ按一定比例加入到第二步反应所得的混合溶液中，检测540nm的吸光度值A U,2，与标准对照后计算出白蛋白浓度CALB；
(4)、将第(2)步所测得的糖化白蛋白浓度CGA除以第(3)步所测得白蛋白浓度CALB得血清CGA/CALB比值。
步骤(1)中的反应条件为在37℃环境中反应180-300秒；
步骤(1)中的血清样本与试剂I的体积比为V血清:V试剂I＝5:140；
步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应180-300秒；
步骤(2)中的血清样本与试剂I、试剂Ⅱ的体积比为V血清:V试剂I:V试剂Ⅱ＝5:140:60；
步骤(2)中所述的血清糖化白蛋白浓度的计算公式为：CGA＝[(AU,1–AB,1)/(AS,1-AB,1)]×C标准GA。其中AU,1为步骤(2)所测得的样品管吸光度值，AS,1为步骤(2)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，AB,1为步骤(2)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度变化值，C标准GA为标准液中GA的浓度；
步骤(3)中的反应条件为在37℃环境中反应180-300秒；
步骤(3)中的血清样本与试剂I、试剂Ⅱ的体积比为V血清:V试剂I:V试剂Ⅱ:V试 剂Ⅲ＝5:140:60:45。
步骤(3)中所述的白蛋白浓度的计算公式为：CALB＝[(AU,2–AB,2)/(AS,2-AB,2)]×C标准ALB。其中AU,2为步骤(3)所测得的样品管吸光度值，AS,2为步骤(3)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，AB,2为步骤(3)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度变化值，C标准ALB为标准液中ALB的浓度；
步骤(4)中所述的CGA/CALB比值的计算公式为：CGA/CALB(％)＝CGA/CALB×100％
具体实施方式
下面将进一步的通过举例来说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
样品液：糖化白蛋白的浓度为0.1-55g/L，白蛋白的浓度为0.1-60g/L。
标准液：精密称取优级纯糖化白蛋白、白蛋白，用去离子水稀释至糖化白蛋白浓度为25g/L、白蛋白浓度为40g/L。
样品液中血清糖化白蛋白浓度的计算公式为：CGA＝[(AU,1–AB,1)/(AS,1-AB,1)]×C标准GA。其中AU,1为步骤(2)所测得的样品管吸光度值，AS,1为步骤(2)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，AB,1为步骤(2)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度变化值，C标准GA为标准液中GA的浓度。
样品液中白蛋白浓度的计算公式为：CALB＝[(AU,2–AB,2)/(AS,2-AB,2)]×C标准ALB。其中AU,2为步骤(3)所测得的样品管吸光度值，AS,2为步骤(3)同体积的标准液代替样品所测得的吸光度值，AB,2为步骤(3)同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度变化值，C标准ALB为标准液中ALB的浓度。
样品液中CGA/CALB比值的计算公式为：CGA/CALB(％)＝CGA/CALB×100
实施例1
配制含菠萝蛋白酶浓度为30KU/L、TOOS浓度为0.5mmol/L、TritonX-100浓度为0.5的80mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂I；含FAOD浓度为20KU/L、POD浓度为5KU/L、4-AAP浓度为1.0mmol/L、海藻糖浓度为10g/L的80mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅱ；含DAO浓度为200KU/L、海藻糖浓度为10g/L的80mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅲ。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为BECKMAN LX20全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为5μl，试剂I体积为140μl，试剂Ⅱ体积为60μl，试剂Ⅲ体积为45μl，测定主/副波长为560/800nm。试剂I和样本混合后在测定温度反应180秒；加入试剂Ⅱ混匀后反应180秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；继续加入试剂Ⅲ后反应180秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2。用本法和HPLC法同时测定了25例血清样品液中CGA/CALB比值。表1为本实施例所述方法测定的血清样品中CGA/CALB比值的测定值与HPLC法测定的CGA/CALB比值的对照表。
表1
HPLC法测定值(％) 本法测定值(％)
4.54 4.56
5.98 5.79
6.42 6.55
7.10 7.32
8.81 8.34
9.10 9.54
10.45 10.39
11.92 11.87
12.35 12.73
12.90 13.19
13.82 13.86
14.29 14.51
14.82 14.68
15.02 15.35
16.30 16.73
16.72 16.54
17.20 17.49
18.83 19.01
19.44 19.76
21.07 21.42
21.97 22.05
22.42 22.52
23.62 23.45
24.17 24.23
25.29 25.53
从表1可知，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9943，两者显示了很好的相关性。
实施例2
配制含菠萝蛋白酶浓度为75KU/L、TOOS浓度为2.75mmol/L、TritonX-100浓度为5.25的110mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂I；含FAOD浓度为60KU/L、POD浓度为17.5KU/L、4-AAP浓度为2.0mmol/L、海藻糖浓度为30g/L的110mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅱ；含DAO浓度为350KU/L、海藻糖浓度为30g/L的110mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅲ。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为BECKMAN CX4全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为5μl，试剂I体积为140μl，试剂Ⅱ体积为60μl，试剂Ⅲ体积为45μl，测定主/副波长为560/800nm。试剂I和样本混合后在测定温度反应240秒；加入试剂Ⅱ混匀后反应240秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；继续加入试剂Ⅲ后反应240秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2，计算样品中CGA/CALB比值。
用本法和HPLC法同时测定了25例血清样品液中CGA/CALB比值。与实施例1类似，实施例2试剂盒的测定结果与HPLC法测定结果呈现了较好的相关性，相关系数r为0.9994。
实施例3
配制含菠萝蛋白酶浓度为120KU/L、TOOS浓度为5mmol/L、TritonX-100浓度为10ml/L的200mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂I；含FAOD浓度为100KU/L、POD浓度为30KU/L、4-AAP浓度为3.0mmol/L、海藻糖浓度为50g/L的200mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅱ；含DAO浓度为500KU/L、海藻糖浓度为50g/L的200mmol/L pH8.50Tris-HCl缓冲液为试剂Ⅲ。将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日本岛津UV2201紫外可见分光光度计，反应温度为37℃，样本体积为5μl，试剂I体积为140μl，试剂Ⅱ体积为60μl，试剂Ⅲ体积为45μl，测定主/副波长为560/800nm。试剂I和样本混合后在测定温度反应300秒；加入试剂Ⅱ混匀后反应300秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；继续加入试剂Ⅲ后反应300秒，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2，计算样品中CGA/CALB比值。
用本法和HPLC法同时测定了25例血清样品液中CGA/CALB比值。与实施例1类似，实施例3试剂盒的测定结果与HPLC法测定结果呈现了较好的相关性，相关系数r为0.9917。
实施例4试剂盒的精密度考察
取糖化白蛋白(GA)及白蛋白(ALB)的标准品，按照一定比例分别配制低值质控样本(CGA/CALB比值为5％)和高值质控样本(CGA/CALB比值为40％)，同一天内采用本发明试剂盒重复测定20次，计算批内CV，然后采用相同样本连续测定20天，计算批间CV。
具体结果如下：
实施例5试剂盒的稳定性考察
将本发明实施例1-3制备的试剂盒在4度冰箱环境下放置36个月，然后按照实施例4的方法测定CGA/CALB比值，样本为中值质控样本(CGA/CALB比值为15％)，具体结果如下：
结果表明本发明试剂盒在放置36个月后，仍然可以精确测定CGA/CALB比值。另外，本发明设定了对比试剂盒(对比例)进行稳定性检测，对比试剂盒除Tris-HCl缓冲液的pH值外，其他组分及浓度均同实施例2，结果如下：
对比例1中Tris-HCl缓冲液的pH值为8.0；对比例2中Tris-HCl缓冲液的pH值为9.0。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (5)

1.一种基于氨基酸氧化酶-过氧化物酶偶联、可单体系测定糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒，具体组成如下：
试剂Ⅰ为含有菠萝蛋白酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、TritonX-100的pH7.0-10.0Tris缓冲液；
试剂II为含果糖氨基酸氧化酶(FAOD)、过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液为试剂II；
试剂Ⅲ为含氨基酸氧化酶(DAO)、海藻糖的pH7.0-10.0Tris缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂I中，pH 7.00-10.00Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，菠萝蛋白酶浓度为30-120KU/L、TOOS浓度为0.5-5mmol/L、TritonX-100浓度为0.5-10ml/L。所述试剂II中，7.0-10.0Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，FAOD浓度为20-100KU/L，POD浓度为5-30KU/L，4-AAP浓度为1.0-3.0mmol/L、海藻糖浓度为10-50g/L。所述试剂Ⅲ中，7.0-10.0Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，DAO浓度为200-500KU/L，海藻糖浓度为10-50g/L。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂I中，pH 8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，菠萝蛋白酶浓度为60-90KU/L、TOOS浓度为2-4mmol/L、TritonX-100浓度为4-6ml/L。
所述试剂II中，8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，FAOD浓度为40-80KU/L，POD浓度为15-20KU/L，4-AAP浓度为1.0-3.0mmol/L、海藻糖浓度为20-40g/L。
所述试剂Ⅲ中，8.0-9.0Tris-HCl浓度为100-150mmol/L，DAO浓度为300-400KU/L，海藻糖浓度为20-40g/L。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂I中，菠萝蛋白酶的浓度为75KU/L、TOOS浓度为2.75mmol/L、TritonX-100的浓度为5.25ml/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L；
所述试剂II中，FAOD浓度为60KU/L、POD浓度为17.5KU/L、4-AAP浓度为2.0mmol/L、海藻糖浓度为30g/L、pH8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L；
所述试剂III中，DAO浓度为350KU/L、海藻糖浓度为30g/L、pH 8.5Tris-HCl缓冲液的浓度为110mmol/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含糖化白蛋白标准液和白蛋白标准液，分别为用去离子水稀释至糖化白蛋白浓度为25g/L、白蛋白浓度为40g/L。
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