CN105861631A - 血清中肌酐的紫外分光测定方法 - Google Patents

血清中肌酐的紫外分光测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中肌酐紫外分光测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：将试剂分为两部分，其中试剂Ⅱ中仅有肌酐亚氨基水解酶有效组分，试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶、α‑酮戊二酸、NADH有效成分；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中内源性NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解酶水解后生成NH3，NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。

Description

血清中肌酐的紫外分光测定方法
技术领域
本发明涉及一种测定血清中肌酐含量的方法，属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中肌酐的紫外分光测定方法。
背景技术
肌酐又称甲基胍基乙酸内酰胺，分子式为C4H70N3，是一种相对分子质量较小(分子量113.12)，熔点255℃，具有水溶性(80.1g/L，16℃)的极性有机含氮化合物，肌酐在肌肉中从磷酸肌酸通过自发和不可逆转化而形成。正常情况下，人体内肌酐含量基本稳定，一般维持在3～14mg/L，肾脏机能受损时，肌酐的正常排泄受到阻碍，血清中肌酐含量增加，因此血清肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。Jaffe在1886年发现肌酐和苦味酸在碱性环境中反应时，可生成一种红色物质，Green-wald第1个系统地研究了Jaffe反应的化学过程，认为Jaffe反应的红色产物是肌酐与苦味酸之间生成1：1和1；2的络合物。一些肌酐的同系物或衍生物如胍基乙酸内酰胺，5-甲基胍基乙酸内酰胺以及乙酰乙酸、丙酮酸、胆红素、乙内酰脲等物质均能和苦味酸发生反应，这些物质称为“假肌酐”，可导致肌酐测定结果偏高，大量的假肌酐存在于红细胞中，因此，肌酐的测定不宜采用全血法测定，目前肌酐主要是利用肌酐在肌酐氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色)，在505nm波长下测定其吸光度A，其A值的大小和样品中肌酐的含量成正比的原理而设计的。肌氨酸氧化酶法灵敏度高，线性范围宽，试剂稳定性好。其主要干扰物为样品中肌酸，为去除肌酸的干扰，可采用双试剂在试剂中去除肌酸的干扰。肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法的指示系统是Trinder反应，Trinder系统明显受维生素C的干扰。毛细管电泳是近10年来才进入实际应用的一种仪器分析方法，分离效率高，分析速度快，样品用量少，自动化程度高。Seki等采用柱切换技术检测血清中的肌酐，同位素稀释质谱法(ID/MS)通过向样品溶液中加入一种同位素标记物作为内标物，在溶质与标记物溶液充分平衡以后，对样品进行预处理，利用GC或LC-MS测定标记物与溶质的峰强度比来测定肌酐的浓度。
本发明的技术方案是:血清中内源性NH3在谷氨酸脱氢酶催化下与α-酮戊二酸、NADH反应生成NAD+后，加入试剂Ⅱ肌酐亚氨基水解酶水解肌酐生成N-甲基乙内酰脲和NH3，生成的NH3在谷氨酸脱氢酶催化下与α-酮戊二酸、NADH反应生成NAD+，以第一步反应为空白，以第二步反应生成的NAD+计算出肌酐的含量，如反应式(1)(2)(3)，本发明方法不同于一步法，一步法易受内源性NH3的干扰而使结果偏高，本发明采用两步酶法克服了内源性NH3的干扰，同时也克服了血清试剂本底颜色的干扰，目前，临床实验室常采用肌酐氧化酶法测定肌酐，但此法所用工具酶多，杂酶干扰大，易受还原性物质干扰，因此，本发明克服了上述缺点。
反应过程为：
第一步反应
第二步反应
解决的问题是:我们所用的仅以肌酐亚氨基水解酶为第二试剂的两步酶测定方法，由于第一步反应体系中有谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH有效成分，血清中内源性NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解酶水解后生成NH3，NH3在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
发明内容：
为了能简单及准确地测定肌酐，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、不受内源性NH3影响的血清两步酶测定方法。
本发明采用的技术方案是：将试剂分为两部分，其中试剂Ⅱ中仅有肌酐亚氨基水解酶有效组分，试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH有效成分；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中内源性NH3在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解酶水解后生成NH3，NH3在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
肌酐浓度＝F×ΔODCr/Δt
ΔODCr/Δt是单位时间内肌酐产生的速率，F是校正因数。
本发明与现有技术相比有如下优点：
1.本发明的方法检测时不受内源性NH3影响。由于内源性NH3在加入试剂Ⅰ就完成反应，不会参与第二步反应，因此排除了内源性NH3的影响，使NH3的生成肌酐成等比关系，检测数据能真实反映肌酐的状况。
2.本发明使用方法和范围与原有两步酶法相同，不增加实验人员的负担，不增加试剂成本，本方法能用于血清和尿液肌酐检测，如采用单一试剂肌酐的紫外分光测定方法易受内源性NH3的干扰而使测定结果偏低。
如上所述，本发明是一种经济方便易行，准确性更高的肌酐检测方法。今后可广泛应用于临床检测。
附图说明
图1是本发明测定健康人体血清中肌酐紫外分光测定方法的反应曲线图。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a.试剂Ⅰ：
Tris-盐酸缓冲液100mmol/L，谷氨酸脱氢酶2500U/L，α-酮戊二酸100mmol/L，NADH 1.3mmol/L，Proclin-300 200μl。
b.试剂Ⅱ：
试剂Ⅱ内含Tris-盐酸缓冲液100mmol/L，肌酐亚氨基水解酶1000U/L，Proclin-300 200μl。
c.标准液：265μmol/L肌酐标准血清(市售)。
其中Proclin-300为液体高效防腐剂。
实施例2
测定程序
双试剂法：在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3μl样品加入到225μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入75μl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在340nm波长处检测，仪器自动计算出肌酐结果，反应参数见表1。
表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
肌酐浓度＝F×ΔODCr/Δt
其中ΔODCr/Δt是单位时间内肌酐产生的速率，F是校正因数，测定方法为带标准的速率法，其实时反应曲线如附图1所示。
下面通过采用本方法与肌酐氧化酶法测定肌酐比较来说明本研究方法的准确性。
1.检测对象：待检者102例，其中男58人，平均年龄43.5岁；女性44人，平均年龄42.5岁，空腹静脉采血2 mL。
2.采用方法及试剂
2.1试剂：
(1)本发明方法采用实施例1中的试剂Ⅰ、试剂Ⅱ。
(2)肌酐氧化酶方法采用北京利德曼生化股份有限公司生产的肌酐试剂盒。
2.2.仪器：(1)日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪。
2.3.方法
2.3.1肌酐氧化酶法样品∶试剂＝1：60：20，37℃，样品与试剂Ⅰ温浴3分钟，加入试剂Ⅱ后，反应5.1分钟，600nm波长处终点法测定。
2.3.2本发明方法样品∶试剂Ⅰ：试剂Ⅱ＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂Ⅱ后，反应5.1分钟，340nm波长处速率法测定。
2.3.3本发明方法与肌酐氧化酶法测定结果统计学比较：两种方法测定结果比较无显著性差异(t＝3.3689,P>0.05，n＝102)；
Y本发明方法＝0.9869X肌酐氧化酶方法-0.1128，R2＝0.9866，两种方法呈良好相关性,本发明方法技术指标为：线性范围达1.1～4500μmol/L，平均回收率为99.2％，高、中、低批内变异系数和批间变异系数分别为0.46％～2.30％和097％～2.45％，健康人群的血清肌酐参考范围为55～108μmol/L(男性)、46～89μmol(女性)。本专利具有选择性好、灵敏度高、测定简便、抗干扰能力强等优点，可用于血、尿肌酐检测，可满足不同层次的临床实验室需要，适合临床推广应用。
经过以上比较可看出，本发明采用肌酐亚氨基水解酶偶联谷氨酸脱氢酶法虽与现有试剂配方组成基本相同，但因谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH有效成分同在试剂I中，试剂II仅有肌酐亚氨基水解酶，所以血清加入试剂后发生的反应与单一试剂方法的反应所包含的待测物NH3的含量不同，测定结果不同，实际效果也完全不一样。因此，本发明通过改变试剂Ⅰ、Ⅱ的组分能够保证血清中肌酐检测的准确性，本方法所用工具酶少，干扰少，结果更加可靠。

Claims (5)

1.一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于将试剂分为两部分，其中试剂Ⅱ中仅有肌酐亚氨基水解酶有效组分，试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH有效成分；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中内源性NH3与试剂Ⅰ在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐亚氨基水解酶水解后生成NH3，NH3在谷氨酸脱氢酶作用下反应生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
2.一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂Ⅰ内含Tris-盐酸缓冲液80～120mmol/L，谷氨酸脱氢酶2000～3000U/L，α-酮戊二酸80～120mmol/L，NADH 1.2～1.4mmol/L，Proclin-300150～250μl；试剂Ⅱ内含Tris-盐酸缓冲液80～120mmol/L，肌酐亚氨基水解酶800～1200U/L，Proclin-300150～250μl。
3.一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中防腐剂选自Proclin-300。
4.一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-盐酸缓冲液的pH值为7.8±8.2。
5.一种血清中肌酐的紫外分光测定方法，其特征在于测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶70～80∶20～30。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109085160A (zh) * 2018-05-09 2018-12-25 天津市宝坻区人民医院 血清中鸟嘌呤的测定方法
CN110511976A (zh) * 2019-09-09 2019-11-29 天津市宝坻区人民医院 血清中l-精氨酸的测定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102023158A (zh) * 2010-10-19 2011-04-20 李立和 血清中肌酐的两步酶测定方法
CN103773833A (zh) * 2013-12-19 2014-05-07 深圳市雷诺华科技实业有限公司 肌酐测定试剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102023158A (zh) * 2010-10-19 2011-04-20 李立和 血清中肌酐的两步酶测定方法
CN103773833A (zh) * 2013-12-19 2014-05-07 深圳市雷诺华科技实业有限公司 肌酐测定试剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FOSTATI.P: "一种改进的肌酐酶学测定法", 《国外医学临床生物化学与检验学分册》 *
梁夯等: "血清肌酐二步酶法检测新技术研究", 《检验医学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109085160A (zh) * 2018-05-09 2018-12-25 天津市宝坻区人民医院 血清中鸟嘌呤的测定方法
CN110511976A (zh) * 2019-09-09 2019-11-29 天津市宝坻区人民医院 血清中l-精氨酸的测定方法

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