CN110511976A

CN110511976A - 血清中l-精氨酸的测定方法

Info

Publication number: CN110511976A
Application number: CN201910836357.6A
Authority: CN
Inventors: 张超; 刘冰; 李立和
Original assignee: Tianjin Baodi Hospital
Current assignee: Tianjin Baodi Hospital
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2019-11-29

Abstract

本发明公开了一种血清中L‑精氨酸的测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂II中仅有精氨酸酶有效组分，色原物质及其它有效组分同在试剂I中，血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中尿素与试剂Ⅰ反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，L‑精氨酸水解生成L‑鸟氨酸和尿素，尿素经反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的氧化型NADP⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的氧化型NADP⁺，计算出L‑精氨酸的含量，本发明不受内源性尿素影响，是一种准确性更高的L‑精氨酸检测方法。

Description

血清中L-精氨酸的测定方法

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中L-精氨酸的测定方法。

背景技术

血清中氨基酸测定方法很多，常用的有：1.分光光度法物质对光的选择性吸收只有芳香族氨基酸在紫外区有吸收，通常利用氨基酸与衍生剂反应生成有色物质，常用的衍生化试剂如茚三酮，乙酰丙酮－甲醛等；2.气象色谱法将氨基酸衍生为易气化的物质，利用气态试样中各组分在两相间的分配系数不同进行分析，不能用一根色谱柱实现全氨基酸测定，应用不广泛，气质联用除了可以测定浓度外还可以发现新的氨基酸；3.液相色谱法各组分在两相间分配系数不同，经过反复的吸附－解吸附过程对其进行分离检测；A、紫外可见光检测器；B、荧光检测器；C、质谱检测器；D、积分脉冲安培检测技术；E、蒸发发散射检测技术；4.毛细管电泳法高压电场的驱动下据各组分间分配行为上的差异实现分离，具进样少、绝对灵敏度及分辨率高，无须梯度洗脱，分析速度快；5.近红外光谱法用统计学方法在样品待测属性值与近红外光谱数据间建立一个关联模型而间接对待测物质进行定量分析；6.化学发光法通过分子从激发态返回基态时发出的光信号间接对氨基酸进行分析，具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点；7.生化酶法是以日本东洋纺试剂为代表，测定原理为L-精氨酸酶分解L-精氨酸为L-鸟氨酸和尿素，尿素在尿素酶的催化下生成氨和二氧化碳，氨、NADPH和α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下生成谷氨酸、水、NADP⁺，根据生成的NADP⁺量计算出L-精氨酸的含量。

反应公式为：

(1)精氨酸酶

L-精氨酸＋H₂OL-鸟氨酸＋尿素

(2)尿素酶

尿素＋H₂ONH₃＋CO₂

(3)GLDH

NH₃＋α-酮戊二酸＋NADPH谷氨酸＋H₂O+NADP⁺

但在本方法测定中，通过生成尿素的含量来反映出L-精氨酸的含量，既包含了血清中内源性尿素，也包含了L-精氨酸分解产生的尿素，因此，此方法测定结果出现较大偏差。

发明内容：

为了能简单、方便、快捷及准确地测定血清中L-精氨酸，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、不受内源性尿素影响的血清中L-精氨酸的测定方法。

本发明采用的技术方案是：试剂Ⅰ中含有α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶、尿素酶等主要成分及适量防腐剂；试剂Ⅱ内仅含有L-精氨酸酶及适量防腐剂；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中尿素与试剂Ⅰ反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，L-精氨酸水解后生成L-鸟氨酸和尿素，尿素经反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的氧化型NADP⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的氧化型NADP⁺计算出L-精氨酸的含量，计算公式为：

OD_L-精氨酸 = OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁）/(SV+R₁V₁ +R₂V₂)]

L-精氨酸浓度= F×OD_L-精氨酸

其中OD_L-精氨酸是L-精氨酸产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。

试剂的配比为：试剂Ⅰ：每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解α-酮戊二酸10.0～20.0mmol、NADPH 0.40～0.60mmol、谷氨酸脱氢酶4000～6000U、尿素酶1000U～2000U、Proclin-300 100µl～300µl；试剂Ⅱ每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解L-精氨酸酶2000U～2400U、Proclin-300 100µl～300µl。

上述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8±0.2（25℃）。试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中防腐剂选自Proclin-300。

上述测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II=1∶100～140∶30～50。

本发明的试剂盒虽与原有的试剂盒试剂组成成分相同，但两种试剂组合方式不同，产生的效果不同，目前已有的试剂盒测定结果包含有L-精氨酸和内源性尿素含量之和。本发明试剂Ⅱ中仅有L-精氨酸酶一种有效组分，α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶、尿素酶等色原物及工具酶同在试剂Ⅰ中，由于内源性尿素生成的NADP⁺和L-精氨酸水解生成的尿素后生成的NADP⁺先后呈色，以试剂Ⅰ反应产生的氧化型NADP⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的氧化型NADP⁺，计算出L-精氨酸的含量，测定效果明显不同，其原理为：

第一步反应

(1)尿素酶

尿素＋H₂ONH₃＋CO₂

(2)GLDH

NH₃＋α-酮戊二酸＋NADPH 谷氨酸＋H₂O+NADP⁺

第二步反应

(3)精氨酸酶

L-精氨酸＋H₂OL-鸟氨酸＋尿素

(4)尿素酶

尿素＋H₂ONH₃＋CO₂

(5)GLDH

NH₃＋α-酮戊二酸＋NADPH谷氨酸＋H₂O+NADP⁺

本发明试剂Ⅰ中含有α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶、尿素酶等主要成分及适量防腐剂；试剂Ⅱ内仅含有L-精氨酸酶及适量防腐剂。通过设置仪器测定参数，由于内源性尿素生成的NADP⁺和L-精氨酸水解生成的尿素后生成的NADP⁺先后呈色，以试剂Ⅰ反应产生的氧化型NADP⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的氧化型NADP⁺计算出L-精氨酸的含量，这样测定结果消除了内源性尿素干扰的影响。

本发明与现有技术相比有如下优点：本发明的方法检测时不受内源性尿素影响，特别是肾衰患者，由于尿素在加入试剂Ⅰ就完成反应，不会参与以后的反应。而加入试剂Ⅱ后L-精氨酸才开始反应，因此消除了尿素的影响，使检测数据能真实反映L-精氨酸的含量。本发明的测定方法能自动化，其使用方法与原有方法相同。

附图说明

图1中为本发明L-精氨酸测定反应示意图。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试剂的组成：

a. 试剂Ⅰ：

试剂Ⅰ：每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解α-酮戊二酸15.0mmol、NADPH 0.50mmol、谷氨酸脱氢酶5000U、尿素酶1500U、Proclin-300 200µl。

b.试剂Ⅱ：

试剂Ⅱ每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解L-精氨酸酶2200U、Proclin-300 200µl。

c.标准液：7.0mmol/LL-精氨酸标准血清。

实施例2

测定程序

本发明方法：在美国贝克曼 AU5800全自动化生化分析仪上，仪器自动将2µl样品加入到240µl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入80µl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在340nm波长处检测，仪器自动计算出L-精氨酸结果，具体见表1

表1. 本发明自动化生化分析仪测试条件

OD_L-精氨酸 = OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁）/(SV+R₁V₁ +R₂V₂)]

L-精氨酸浓度= F×OD_L-精氨酸

其中OD_L-精氨酸是L-精氨酸产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。

加入试剂II后OD₁的稀释倍数为[（SV+R₁V₁）/ (SV+R₁V₁+R₂V₂)]，加入试剂II后的吸光度即为OD₁×[（SV+R₁V₁）/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]。所以，由L-精氨酸产生的NADP⁺的吸光度为：OD_L-精氨酸 = OD₂- OD₁×[（SV+R₁V₁）/(SV+R₁V₁ +R₂V₂)]，即OD_L-精氨酸 = OD₂–(2+240)/(2+240+80)×OD₁。只要测出OD₁和OD₂即可计算出L-精氨酸的浓度。

下面通过采用本发明方法与高效液相色谱法（HPLC）测定L-精氨酸比较来说明本研究方法的准确性。

1.检测对象：待检者36例，其中男18人，平均年龄44.0岁；女性18人，平均年龄45.5岁，空腹静脉采血2 mL。

2.采用方法及试剂

2.1试剂：本发明方法采用实施例1中样品∶试剂I∶试剂II=1∶100～140∶30～50。

2.2.仪器：（1）美国贝克曼 AU5800全自动化生化分析仪；（2）日本岛津LC-10A高效液相色谱仪。

2.3.方法

2.3.1.本发明方法样品2μl，试剂I 240μl，试剂II 80μl，37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II反应5.1分钟，340nm波长处终点法测定。

2.3.2. HPLC法测定采用岛津LC-10A高效液相色谱仪,流动相为含1%异丙醇和0.5%乙腈的正己烷，流速1.2 ml/min，检测波长230nm。取样品制备中的正己烷层直接进样，测定L-精氨酸时进样体积5μl将标准溶液的浓度对L-精氨酸/内标峰面积比进行线性回归，得回归方程，用于样品L-精氨酸浓度计算。

本研究方法与HPLC法测定结果比较：结果显示两种方法无显著性差异（t=0.3461,P >0.05，n=36），呈良好相关性，Y_{本发明方法}=1.015_XHPLC法-0.2422，R²=0.9969，本发明的技术参数为：批内精密度<5.0%，批间精密度<6.0%，线性范围为0.16～841.6mmol/L，空白吸光度<0.30(0.5cm,37℃，340nm)，灵敏度为8.0mmol/L的样本吸光度变化为≥0.032。

经过以上比较可看出，本发明虽与日本东洋纺试剂成分相同，但组合方式不同，试剂II仅有精氨酸水解酶，血清中内源性尿素与L-精氨酸分解产生的尿素先后呈色，如图1所示，实际效果也完全不一样，因此，本发明通过改变试剂Ⅰ、Ⅱ的组分能够保证血清中L-精氨酸检测的准确性。

Claims

1.一种血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ中含有α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶、尿素酶等主要成分及适量防腐剂；试剂Ⅱ内仅含有L-精氨酸酶及适量防腐剂；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中尿素与试剂Ⅰ反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，L-精氨酸水解后生成L-鸟氨酸和尿素，尿素经反应生成谷氨酸和氧化型NADP⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的氧化型NADP⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的氧化型NADP⁺计算出L-精氨酸的含量，计算公式为：OD_L-精氨酸 = OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁）/(SV+R₁V₁ +R₂V₂)]

L-精氨酸浓度= F×OD_L-精氨酸，其中OD_L-精氨酸是L-精氨酸产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。

2.根据权利要求1所述的血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ中含有α-酮戊二酸、NADPH、谷氨酸脱氢酶、尿素酶等主要成分及适量防腐剂；试剂Ⅱ内仅含有L-精氨酸酶及适量防腐剂。

3.根据权利要求1所述的血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中防腐剂选自Proclin-300。

4.根据权利要求1所述的血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解α-酮戊二酸10.0～20.0mmol、NADPH 0.40～0.60mmol、谷氨酸脱氢酶4000～6000U、尿素酶1000U～2000U、Proclin-300 100µl～300µl；试剂Ⅱ每升50mmolTris-HCl缓冲液中溶解L-精氨酸酶2000U～2400U、Proclin-300 100µl～300µl。

5.根据权利要求4所述的血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.8±0.2（25℃）。

6.根据权利要求4所述的血清中L-精氨酸的测定方法，其特征在于测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II=1∶100～140∶30～50。