CN109085160A - 血清中鸟嘌呤的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血清中鸟嘌呤的测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂II中仅有鸟嘌呤脱氨酶有效组分，指示剂及其它有效组分同在试剂I中；其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中游离氨与试剂Ⅰ中α‑酮戊二酸、NADH在谷氨酸脱氢酶作用下生成NAD⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶水解后生成氨，经反应生成NAD⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NAD⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NAD⁺可直接测出鸟嘌呤的含量。本发明检测时不受内源性游离氨影响，本方法是一种快捷、准确性更高的血清中鸟嘌呤检测方法。

Description

血清中鸟嘌呤的测定方法

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中鸟嘌呤的测定方法。

背景技术

鸟嘌呤是一种有机碱，广泛存在于动、植物界,化学名称为2-氨基-6-氧嘌呤，无色正方形晶体或结晶性粉末，在含有过量氨存在的水溶液中，慢慢蒸去水得小菱形晶体，熔点360℃(分解并部分升华),溶于氨水、苛性碱及稀矿酸液，微溶于乙醇、乙醚，对紫外线有强烈的吸收性，为鸟苷和鸟苷酸的组成成分。其盐酸盐为单水合粉末状晶体，在100℃时失水，200℃时失去氯化氢，溶于酸化的水。鸟嘌呤可由鱼鳞经盐酸水解而得。为组成核酸的重要碱基，是DNA和RNA 中4种主要碱基之一，也是各种鸟苷酸的组成分。其N9与核糖或脱氧核糖C1 以β-糖苷键连接而成鸟苷或脱氧鸟苷。

临床实验室采用生化分析仪测定血清中鸟嘌呤，其方法是试剂I中含有NH₃、α-酮戊二酸、NADH，试剂II中仅有鸟嘌呤脱氨酶酶有效组分，指示剂及其它有效组分同在试剂I中；血清中游离氨与试剂Ⅰ中α-酮戊二酸、NADH在谷氨酸脱氢酶作用下生成NAD⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶作用下水解后生成氨，经反应生成NAD⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NAD⁺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的NAD⁺可直接计算(测)出鸟嘌呤的含量。本发明检测时不受内源性游离氨影响，本方法是一种快捷、准确性更高的血清中鸟嘌呤检测方法。

发明内容：

为了能简单、方便、快捷及准确地测定血清中鸟嘌呤，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、能够不受内源性氨影响的血清中鸟嘌呤的测定方法。

本发明采用的技术方案是：试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶，α-酮戊二酸， NADH及适量防腐剂；试剂Ⅱ内含有鸟嘌呤水解酶及适量防腐剂，其测定方法为：待测血清样品先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中游离氨与试剂Ⅰ反应生成NAD⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶水解后产生氨，经反应也生成NAD⁺；仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NAD⁺为空白，从试剂Ⅱ反应产生的NAD⁺计算出鸟嘌呤的含量，计算公式为：

OD_鸟嘌呤＝OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

鸟嘌呤浓度＝F×OD_鸟嘌呤

其中OD_鸟嘌呤是鸟嘌呤产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。

试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中防腐剂选自Proclin-300。

试剂的配比为：试剂Ⅰ每升Tris-HCl缓冲液内含Tris-HCl 80mmol～ 120mmol、谷氨酸脱氢酶4000～8000U、NADH 0.2～0.6mmol,Proclin-300 100μl～300μl；试剂Ⅱ每升Tris-HCl缓冲液内含Tris-HCl 80mmol～120 mmol、鸟嘌呤水解酶1600U～2400U、Proclin-300100μl～300μl。

上述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-HCl缓冲液的pH值为8.2±0.2。

上述测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶80～120∶40～ 60。本发明试剂Ⅱ中仅有鸟嘌呤脱氨酶一种有效组分，α-酮戊二酸、NADH及谷氨酸脱氢酶等有效组分同在试剂Ⅰ中，游离氨和鸟嘌呤脱氨生成的氨生成的 NAD⁺先后呈色，其测定反应为：

第一步反应

第二步反应

本发明血清中游离氨与试剂Ⅰ反应生成NAD⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴 4～7分钟，鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶水解后产生氨，经反应也生成NAD⁺,仪器在 334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NAD⁺为空白，从试剂Ⅱ反应产生的NAD⁺计算出鸟嘌呤的含量，通过设置仪器测定参数，仪器将试剂Ⅰ反应生成的NAD⁺设为空白，由试剂Ⅱ反应生成的NAD⁺计算出鸟嘌呤的含量，这样测定结果消除了原有游离氨干扰的影响。

本发明与现有技术相比有如下优点：

1.本发明的方法检测时不受内源性氨影响，由于游离氨在加入试剂Ⅰ就完成反应，不会参与以后的反应，而加入试剂Ⅱ后鸟嘌呤脱氨酶才开始反应，仪器通过内空白法排除了游离氨的影响。

2.本发明采用自动化仪器直接测出鸟嘌呤的结果，与现有的液相色谱相比，本发明的测定方法能自动化，减少检测成本和时间，提高了检测效率。

3.同时由于只需一次检测，因而减少了检测时的误差，提高了准确率，不增加实验人员的负担，不增加试剂成本。

如上所述，本发明是一种经济方便易行，准确性更高的鸟嘌呤检测方法。今后可广泛应用于临床检测和常规体检中。

附图说明：

图1为血清中鸟嘌呤测定实时反应曲线。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试剂的组成：

a.试剂Ⅰ：

试剂Ⅰ每升缓冲液内含Tris-HCl 100mmol、谷氨酸脱氢酶6000U、NADH 0.4 mmol,Proclin-300200μl。

b.试剂Ⅱ：

试剂Ⅱ每升缓冲液内含Tris-HCl 100mmol、鸟嘌呤水解酶2000U、Proclin-300200μl。

c.标准液：500μmol/L鸟嘌呤碱性溶液。

其中，Proclin-300为液体高效防腐剂。

实施例2

测定程序

在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3μl样品加入到300μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入150μl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育 5.1分钟，全自动分析仪在340nm波长处检测，仪器自动计算出鸟嘌呤结果，具体见表1。

表1.本发明自动化生化分析仪测试条件

反应OD_鸟嘌呤计算值＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

鸟嘌呤浓度＝F×OD_鸟嘌呤

其中OD_鸟嘌呤是鸟嘌呤产生的吸光度。OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积， R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积。F是校正因数，由于本法是负向反应，校正因数和鸟嘌呤产生的吸光度OD_鸟嘌呤均为负值。

加入试剂II后OD₁的稀释倍数为[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]，加入试剂II后的吸光度即为OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]。所以，由鸟嘌呤产生的NAD⁺的吸光度变化为：OD_鸟嘌呤＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁ +R₂V₂)]，即OD_鸟嘌呤＝OD₂–(2+150)/(2+150+50)×OD₁。只要测出OD₁和OD₂即可计算出鸟嘌呤的浓度。

下面通过采用本方法与高效液相色谱法(HPLC)测定鸟嘌呤比较来说明本研究方法的准确性。

1.检测对象：待检者52例，其中男28人，平均年龄46.5岁；女性24人，平均年龄49.5岁，空腹静脉采血2mL。

2.方法

2.1本发明方法样品∶试剂I∶试剂II＝1∶80～120∶40～60。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5.1分钟，340nm波长处终点法测定。

2.2HPLC法测定采用岛津LC-10A高效液相色谱仪,流动相为含1％异丙醇和 0.5％乙腈的正己烷，流速1.2ml/min，检测波长240nm，取样品制备中的正己烷层直接进样，进样体积5μl，将标准溶液的浓度与被测定样品内标峰面积比进行线性回归，得回归方程，用于样品鸟嘌呤浓度计算。

本研究方法与HPLC法测定结果显示两种方法无显著性差异 (t＝0.3505,P>0.05，n＝52)，呈良好相关性，Y_{本发明方法}＝0.9672X_HPLC法-0.3790， R₂＝0.9734，本发明方法精密度：批内CV<2.9％，批间差<5.0％。线性范围21.2～ 2800μmol/L，浓度为500μmol/L鸟嘌呤ΔA范围为0.11～0.13μmol/L。

经过以上比较可看出，本发明方法与高效液相色谱法无显著性差异，存在良好的相关性，因在试剂II中仅有鸟嘌呤脱氨酶有效组分，指示剂及其它有效组分同在试剂I中本发明方法能够保证血清中鸟嘌呤检测的准确性。

Claims (6)

1.一种血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ中含有谷氨酸脱氢酶，α-酮戊二酸，NADH及适量防腐剂；试剂Ⅱ内含有鸟嘌呤水解酶及适量防腐剂；其测定方法为：待测血清样品与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中游离氨与试剂Ⅰ反应生成NAD⁺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，鸟嘌呤在鸟嘌呤脱氨酶水解后产生氨，经反应也生成NAD⁺，仪器在334nm～340nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的NAD⁺为空白，从试剂Ⅱ反应产生的NAD⁺计算出鸟嘌呤的含量，计算公式为：

OD_鸟嘌呤＝OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

鸟嘌呤浓度＝F×OD_鸟嘌呤

其中OD_鸟嘌呤是鸟嘌呤产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R₁V₁是试剂Ⅰ的体积，R₂V₂是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。

2.根据权利要求1所述的血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于指示反应为谷氨酸脱氢酶催化氨、α-酮戊二酸及NADH生成NAD⁺的指示反应。

3.根据权利要求1所述的血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ及试剂Ⅱ中防腐剂选自Proclin-300。

4.根据权利要求1所述的血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ每升Tris-HCl缓冲液内含Tris-HCl 80mmol～120mmol、谷氨酸脱氢酶4000～8000U、NADH 0.2～0.6mmol,Proclin-300100μl～300μl；试剂Ⅱ每升Tris-HCl缓冲液内含Tris-HCl 80mmol～120mmol、鸟嘌呤水解酶1600U～2400U、Proclin-300100μl～300μl。

5.根据权利要求4所述的血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-HCl缓冲液的pH值为8.2±0.2。

6.根据权利要求4所述的血清中鸟嘌呤的测定方法，其特征在于测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶80～120∶40～60。