CN101464352A

CN101464352A - 氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法

Info

Publication number: CN101464352A
Application number: CNA2007101921456A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2007-12-19
Publication date: 2009-06-24

Abstract

本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。

Description

氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法

技术领域

本发明涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。

扩散法是标本碱化后，释放出NH₃，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH₃扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。

检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明氨(离子)浓度测定方法原理如下：

氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+

腺苷二磷酸+磷酸根

磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+

磷酸烯醇式丙酮酸+水

二氧化碳+还原型辅酶甲酸脱氢酶甲酸+辅酶

这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase；EC 6.3.1.2)酶(偶)联磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase；EC 4.1.1.31)、甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应终点比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(离子)反应产生磷酸根，再通过(偶)联合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨(离子)的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨(离子)诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酰胺合成酶 6000U/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000U/L

甲酸脱氢酶 10000U/L

谷氨酸 10mmol/L

腺苷三磷酸 3mmol/L

草酰乙酸 5mmol/L

本发明的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶。

还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：

试剂1

试剂2

缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶。

试剂3

缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。

还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨(离子)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括：

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酰胺合成酶 6000U/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000U/L

甲酸脱氢酶 10000U/L

谷氨酸 10mmol/L

腺苷三磷酸 3mmol/L

草酰乙酸 5mmol/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。

实施例二

本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酸 10mmol/L

腺苷三磷酸 3mmol/L

草酰乙酸 5mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

谷氨酰胺合成酶 6000U/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000U/L

甲酸脱氢酶 10000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。

实施例三

本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括：

试剂1

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 50mmol/L

还原型辅酶 0.25mmol/L

谷氨酸 10mmol/L

腺苷三磷酸 3mmol/L

草酰乙酸 5mmol/L

试剂2

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000U/L

甲酸脱氢酶 10000U/L

试剂3

三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液 100mmol/L

稳定剂 500mmol/L

谷氨酰胺合成酶 6000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。

测定氨(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0012；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达2mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.65±0.2ΔA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。

Claims

1.一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)浓度测定方法，其方法原理如下：

氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+

腺苷二磷酸+磷酸根

磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+

磷酸烯醇式丙酮酸+水

二氧化碳+还原型辅酶甲酸脱氢酶甲酸+辅酶

将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出氨(离子)的浓度大小测定结果。

2.一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括：

缓冲液 20——500mmol/L

稳定剂 1——4000mmol/L

还原型辅酶 0.1——0.35mmol/L

谷氨酰胺合成酶 1000——80000U/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000——80000U/L

甲酸脱氢酶 1000——80000U/L

谷氨酸 1——50mmol/L

腺苷三磷酸 1——50mmol/L

草酰乙酸 1——50mmol/L

试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。

其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸组成单剂试剂。

4.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：

由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1—4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。