CN116124750A - 一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用 - Google Patents

一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用 Download PDF

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CN116124750A CN202310195512.7A CN202310195512A CN116124750A CN 116124750 A CN116124750 A CN 116124750A CN 202310195512 A CN202310195512 A CN 202310195512A CN 116124750 A CN116124750 A CN 116124750A
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詹深山
蒋佳俊
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Abstract

本发明提供了一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。腺苷本身具有较强的荧光，其被腺苷脱氨酶水解后，所得水解产物荧光降低，从而导致检测体系溶液荧光强度降低，通过腺苷水解前后荧光强度变化，对体系中腺苷脱氨酶的含量进行检测。本发明中所述腺苷脱氨酶含量的检测方法操作简单、不需要大型仪器设备、材料便宜易得，能够准确快速地检测待测样品中腺苷脱氨酶的含量，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有较为广阔的应用前景。

Description

一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。
背景技术
腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是一种巯基酶，属于细胞免疫功能相关的核酸代谢酶类。ADA缺乏可导致核酸代谢障碍，影响胸腺发育，从而引起免疫功能缺陷。重症联合免疫缺陷病即与ADA缺乏相关。
人体许多组织中均有ADA分布，其中胸腺、脾和其他淋巴组织中含量最高，肺、肝、肾和骨胳肌等处含量较低。血清中的ADA主要来自肝脏，是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一。测定血清中ADA的活性，可用于诊断急性肝损伤及残留病变、辅助判断慢性肝病、诊断肝纤维、鉴别黄疸和阿米巴肝脓肿等。脑脊液中ADA检测可作为中枢神经系统疾病鉴别和诊断的重要指标。
此外，ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上也具有重要价值。因此，测定体液和血液中的ADA水平对免疫功能的研究以及相关疾病的鉴别、诊断和治疗具有十分重要的意义。开发简单、快速、灵敏的ADA检测方法也越来越受到广泛的重视。
随着对ADA的深入研究，其检测方法也不断发展。目前市场上已发展出四代ADA检测方法。
第一代ADA测试方法由于高底物浓度造成吸光度过高，其仅适合在腺苷浓度低于40μM时使用。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此该法不能满足临床应用。
第二代ADA测试方法所需仪器简单、试剂易配制，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。同样原因，对于ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)反应方法来说，其是通过测量340nm处NADPH吸光度下降的速度来测算ADA活性。所述方法也因血清含氨，以及测试系统中过高NADPH造成非特异性氧化而易受干扰。
对于第三代ADA测试方法，在293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。第四代ADA测试方法虽克服了以往ADA测试的困难，但其所需的试剂成本高，阻碍了实际临床使用。鉴于现有技术的上述不足，亟需一种新型的ADA检测方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种腺苷脱氨酶含量的检测方法及其应用。本发明中检测腺苷脱氨酶含量的方法操作简单、不需要大型仪器设备、材料便宜易得，能够准确快速地检测待测样品中腺苷脱氨酶的含量，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有较大的应用推广价值。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种腺苷脱氨酶含量的检测方法，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：
利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。
本发明选择合适的腺苷，并同时采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。所述检测腺苷脱氨酶含量的原理是腺苷具有较强的本征荧光，当腺苷被腺苷脱氨酶水解，生成氨和肌苷后，其水解产物释放较低强度的荧光；在一定浓度范围内，腺苷脱氨酶的浓度越高，腺苷被消耗得越多，检测体系对外释放的荧光就越弱，通过荧光强度变化对体系中的腺苷脱氨酶的含量进行检测。
优选地，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。
在相同条件下三磷酸腺苷(ATP)比一磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)的荧光更明显，更适合应用于检测。
优选地，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下具体步骤：
(1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
(2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
优选地，步骤(1)中，所述水解反应溶剂包括HEPES缓冲液或水，优选为HEPES缓冲液。
优选地，所述HEPES缓冲液的浓度为8-12mM，例如可以是8mM、9mM、10mM、11mM或12mM等，所述HEPES缓冲液的pH值为7.2-7.6，例如可以是7.2、7.4或7.6等。
优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷的浓度为45-55mM，例如可以是45mM、48mM、50mM、52mM或55mM等。
优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0-25U/mL，例如可以是0U/mL、0.25U/mL、5U/mL、12.5U/mL或25U/mL等。
优选地，步骤(1)中，所述水解反应的温度为30-37℃，例如可以是30℃、32℃、35℃或37℃等，所述水解反应的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h或2h等。
优选地，步骤(1)中，所述荧光检测参数为：激发波长为270-280nm，例如可以是270nm、275nm或280nm等，发射波长为360-400nm，例如可以是360nm、380nm、390nm或400nm等。
优选地，步骤(2)中，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度。
作为本发明的优选技术方案，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：
(1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，所述水解反应混合液中腺苷的浓度为45-55mM，所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0-25U/mL，在30-37℃下水解反应0.5-2h；检测反应后的荧光强度，所述荧光检测参数为：激发波长为270-280nm，发射波长为360-400nm；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
(2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
第二方面，本发明提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒中的试剂包括腺苷和腺苷脱氨酶标准品。
优选地，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
(1)荧光强度检测：将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
(2)制作标准曲线：根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
第四方面，本发明提供第一方面所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法、第二方面所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒或第三方面所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒的使用方法在腺苷脱氨酶检测领域中的应用。
在本发明中，考察了不同核苷的本征荧光强度，包括腺苷(AMP、ADP和ATP)、胸苷(TMP、TDP和TTP)、胞苷(CMP、CDP和CTP)、鸟苷(GMP、GDP和GTP)和尿苷(UMP、UDP和UTP)。在500μL的反应体系中，浓度相同的不同核苷(500mM，5μL)荧光强度检测结果图如图1所示，从图1中可知相较于其他核苷，腺苷(AMP、ADP和ATP)的本征荧光强度最为明显，在激发光波长280nm下，AMP的荧光强度达到1788，ADP的荧光强度达到3818，ATP的荧光强度达到5986。在相同条件下三磷酸腺苷(ATP)比一磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)的荧光强度更明显，更适合应用于检测。
在本发明中，还考察了不同浓度的ATP的荧光强度。在500μL的反应体系中，不同体积的ATP(250mM)荧光强度检测结果图如图2所示，从图2中可知随着ATP(250mM)体积的逐渐增大，反应体系的荧光先增大，到达峰值后降低，结果表明250mM的ATP体积为10μL时，体系释放的荧光最强。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
现有大多数ADA检测方法的检测体系组成复杂、成本较高、操作步骤繁琐，本发明所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法克服了上述缺点，提供了一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的ADA检测方法。所述检测方法涉及的原理简单、材料便宜易得、用时较短，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有较大的应用推广价值。
附图说明
图1是浓度相同的不同核苷(500mM，5μL)的荧光强度检测结果图。
图2是不同体积的ATP(250mM)的荧光强度检测结果图。
图3是由ATP(250mM，10μL)组成的检测体系中加入不同体积ADA(250U/mL)之后的荧光强度检测结果图。
图4是由ATP(250mM，10μL)组成的检测体系的荧光强度变化与ADA(250U/mL)体积之间的线性关系。
图5是由ATP组成的检测体系中加入不同种类的酶后荧光强度检测结果图。
图6是由ATP组成的检测体系与不同的酶作用后的荧光强度变化。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下实施例和测试例中所用各组分来源如下所示：
组分 厂家 CAS号
三磷酸腺苷 上海源叶生物科技有限公司 9000-83-3
一磷酸腺苷 上海源叶生物科技有限公司 61-19-8
二磷酸腺苷 上海源叶生物科技有限公司 58-64-0
腺苷脱氨酶标准品 上海源叶生物科技有限公司 9026-93-1
实施例1
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述试剂盒由三磷酸腺苷和腺苷脱氨酶标准品组成。使用所述试剂盒对腺苷脱氨酶含量进行检测。所述腺苷脱氨酶含量的检测步骤如下：
(1)将三磷酸腺苷、腺苷脱氨酶标准品和HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)配制成水解反应混合液，所述水解反应混合液的体积为500μL，所述水解反应混合液中所述三磷酸腺苷的浓度为50mM，所述腺苷脱氨酶标准品的浓度分别为0U/mL、0.25U/mL、5U/mL、12.5U/mL和25U/mL，在37℃下水解反应1h；检测反应后的荧光强度，所述荧光检测参数为：激发波长为280nm，发射波长为380nm；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度，所述待测样品含有25U/mL腺苷脱氨酶，所述空白对照为水；待测样品检测实验做三组平行。
(2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
检测结果如图3和图4所示，其中图3为由ATP(250mM，10μL)组成的检测体系中加入不同体积ADA(250U/mL)之后的荧光强度检测结果图，从图3中可知随着ADA(250U/mL)体积的增加，检测体系的荧光规律性降低。将检测体系的荧光强度变化对250U/mL ADA的体积作图，可得拟合度为0.96的直线，线性方程为y＝8.08+25.77x，R2为0.96，结果如图4所示，图4为由ATP(250mM，10μL)组成的检测体系的荧光强度变化与ADA(250U/mL)体积之间的线性关系。基于3δ/s(δ为15次空白测定的标准偏差，s为标准曲线的斜率)可算得所述检测体系对ADA的检测限为0.51U/mL。
实施例2
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述试剂盒与实施例1的区别仅在于所述腺苷为二磷酸腺苷。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例3
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述试剂盒与实施例1的区别仅在于所述腺苷为一磷酸腺苷。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例4
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，所述试剂盒与实施例1的区别仅在于所述水解反应溶剂为水。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应混合液中所述三磷酸腺苷的浓度为30mM。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应混合液中所述三磷酸腺苷的浓度为65mM。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应的时间为0.5h。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应的时间为2h。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应的时间为0.3h。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述水解反应的时间为3h。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例11
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述荧光检测参数为：激发波长为260nm，发射波长为380nm。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例12
本实施例提供一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，与实施例1的区别仅在于，腺苷脱氨酶含量的检测步骤中，所述荧光检测参数为：激发波长为300nm，发射波长为380nm。腺苷脱氨酶含量的检测步骤参照实施例1。
实施例1-10中的待测样品(含有25U/mL腺苷脱氨酶)三组平行检测实验的检测结果如表1所示。
表1
试剂盒 回收率(％) RSD(％)
实施例1 97.5-105.8 1.2-3.6
实施例2 84.9-88.6 3.1-4.6
实施例3 85.3-87.7 3.4-4.7
实施例4 84.3-86.3 3.0-4.6
实施例5 91.1-93.6 1.7-4.3
实施例6 92.5-94.9 1.9-4.4
实施例7 93.4-95.2 2.5-4.2
实施例8 91.5-92.7 2.7-4.8
实施例9 88.4-91.2 4.3-5.1
实施例10 90.2-93.4 3.5-4.2
实施例11 82.6-84.9 3.6-5.8
实施例12 75.1-79.7 3.5-5.4
从表1的结果可知，实施例1中的回收率为97.5-105.8％，RSD为1.2-3.6％，实施例1中的检测方法的检测效果好，准确度高。
通过实施例1与实施例2-3的对比可知，在相同条件下三磷酸腺苷比一磷酸腺苷和二磷酸腺苷更适合应用于检测。
通过实施例1与实施例4的对比可知，所述水解反应溶剂为HEPES缓冲液时，其检测效果更好，HEPES缓冲液为酶反应提供了一个更适宜的反应条件，促使酶最大程度地展现自身活性。
通过实施例1与实施例5-12的对比可知，改变三磷酸腺苷浓度、缩短和延长反应时间、改变荧光检测参数都会影响检测结果的准确度。
测试例1
本测试例用于考察实施例1中所述试剂盒的特异性
(1)配制一系列总体积为500μL反应体系：在HEPES(10mM、pH＝7.4)缓冲液中分别加入ATP母液和不同的酶(包括ADA、漆酶、β-淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、β-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶)进行反应；所述反应体系中ATP的浓度50mM；所述反应体系中所述酶的浓度为1mg/mL。反应条件为37℃、1h。
(2)设置荧光测量参数为Ex(激发波长)＝280nm，Em(发射波长)＝380nm，以空白组为对照(空白组中只含有ATP母液和HEPES缓冲液)，比较加入不同酶的体系的荧光强度的变化。
检测结果如图5和图6所示，图5为由ATP组成的检测体系中加入不同种类的酶后荧光强度检测结果图；图6为由ATP组成的检测体系与不同的酶作用后的荧光强度变化。从图5和图6中可知只有在加入腺苷脱氨酶时，检测体系的荧光才有明显的降低。结果表明，所述的检测腺苷脱氨酶的方法特异性良好，漆酶、β-淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、β-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶均不会对检测产生干扰。
综上，本发明提供的腺苷脱氨酶含量的检测方法操作简单、特异性好、不需要大型仪器设备、材料便宜易得，能够准确快速地检测待测样品中腺苷脱氨酶的含量，且展现出良好的灵敏度和特异性，具有广阔的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下步骤：
利用腺苷的本征荧光，采用腺苷脱氨酶水解腺苷，通过荧光分析法检测腺苷脱氨酶的含量。
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。
3.根据权利要求1或2所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，所述腺苷脱氨酶含量的检测方法包括如下具体步骤：
(1)将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
(2)根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
4.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水解反应溶剂包括HEPES缓冲液或水，优选为HEPES缓冲液；
优选地，所述HEPES缓冲液的浓度为8-12mM，所述HEPES缓冲液的pH值为7.2-7.6。
5.根据权利要求3或4所述的检腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷的浓度为45-55mM；
优选地，步骤(1)中，所述水解反应混合液中所述腺苷脱氨酶标准品的浓度为0-25U/mL；
优选地，步骤(1)中，所述水解反应的温度为30-37℃，所述水解反应的时间为0.5-2h；
优选地，步骤(1)中，所述荧光检测参数为：激发波长为270-280nm，发射波长为360-400nm。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标准曲线的纵坐标为腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度的差值，所述标准曲线的横坐标为腺苷脱氨酶标准品溶液的浓度。
7.一种检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，其特征在于，所述检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒中的试剂包括腺苷和腺苷脱氨酶标准品。
8.根据权利要求7所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒，其特征在于，所述腺苷包括一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷中任意一种或至少两种的组合，优选为三磷酸腺苷。
9.一种权利要求7或8所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
(1)荧光强度检测：将腺苷、腺苷脱氨酶标准品和水解反应溶剂配制成水解反应混合液，进行水解反应，检测反应后的荧光强度；同步检测待测样品和空白对照反应后的荧光强度；
(2)制作标准曲线：根据腺苷脱氨酶标准品与空白对照反应后的荧光强度差值，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中腺苷脱氨酶含量。
10.权利要求1-6中任一项所述的腺苷脱氨酶含量的检测方法、权利要求7或8所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒或权利要求9所述的检测腺苷脱氨酶含量的试剂盒的使用方法在腺苷脱氨酶检测领域中的应用。
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