CN109988816A - 一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 - Google Patents

一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学及生物化学技术领域，具体涉及一种腺苷脱氨酶检测试剂盒。该试剂盒包括试剂R1和试剂R2；试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、防腐剂、4‑氨基安替比林和缓冲液；试剂R2包括：腺苷、显色剂、防腐剂和缓冲液。该腺苷脱氨酶检测剂盒采用连续监测法来进行测定，主波长为550nm，具有灵敏高、准确性好等优点。

Description

一种腺苷脱氨酶测定试剂盒
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体涉及一种腺苷脱氨酶测定试剂盒。
背景技术
腺苷脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是嘌呤核苷代谢中重要的酶类，是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。其活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一。血清中的ADA活性测定可用于：判断急性肝损伤及残留病变；协助诊断慢性肝病；有助于肝纤维的诊断；有助于黄疸的鉴别。此外，ADA缺乏与重症联合免疫缺陷病(SCID)有关，可作为核酸代谢重要的酶类；ADA缺乏可导致核酸代谢障碍，影响到胸腺的发育，从而引起免疫功能缺陷。脑脊液ADA检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标。ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上也具有重要价值。因此，测定血液、体液中的ADA及其同工酶水平对这些疾病的鉴别、诊断、治疗及免疫功能的研究日趋受到临床重视。
近十几年来，随着对ADA的深入研究，检测方法也不断发展。目前比色法已发展了五代。第一代ADA测试：ADA将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)和氨(NH3)。通过动态测量腺苷265nm处吸光度下降的速度，测算ADA的活性大小。但是该法高底物浓度造成吸光度过高，仅适用于腺苷浓度低于40.00μmol/L。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此，该法不适用于临床应用。
第二代ADA测试：原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot显色反应测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清ADA活性单位。该法所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。基于同样的原因，ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)反应，通过测量340nm波长下NADPH(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate reduced form，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，还原型辅酶II)吸光度下降的速度来计算ADA活性。该法也因血清含氨干扰，以及测试系统中过高的NADPH造成非特异性氧化，而不能准确计算ADA活性。
第三代ADA测试：通过ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purinenucleosidephosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)反应连续监测法。通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算ADA活性。但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。
第四代ADA测试：通过ADA偶联PNP，XOD，过氧化氢酶(Catalase)和醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)，借助过氧化氢(H2O2)反应测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法克服了以往ADA测试的困难，但是，该法剂成本高，阻碍实际临床使用。
第五代ADA测试：ADA酶解腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)；再通过PNP的作用，生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)；后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和过氧化氢(H2O2)；最后在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的作用下H2O2再与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(EHSPT)、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AAP)反应，生成紫红色的有色醌(Ouinone dye)。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。从反应原理可知该法具有较强的抗干扰能力，目前医院主要应用基于第五代ADA测试原理的检测试剂进行血清等标本中ADA活性的测定，具有方便、快速的优点。
虽然目前基于上述第五代的ADA检测方法及试剂已在临床得到一定应用，但仍存在以下缺点：检测ADA的灵敏度不足，血清中ADA的含量较少，文献报道正常人群血清ADA参考值大多在4-20U/L之间，癌症病人及缺铁性贫血患者血清中的ADA活性显著降低，因此样品中低值ADA活性的准确定量不容忽视。目前已有的ADA检测试剂盒难以对低值ADA活性进行准确定量。比如，中国专利CN108690868A公开了一种腺苷脱氨酶测定试剂盒及其测定方法，该试剂盒成分较简单，稳定性好，但是添加的天门冬氨酸钠可能会影响腺苷脱氨酶的活性，降低试剂盒的灵敏度。因此，亟需一种具有高灵敏度的腺苷脱氨酶测定剂盒。
发明内容
针对现有腺苷脱氨酶测定剂盒存在灵敏度低的问题，本发明提供的腺苷脱氨酶测定剂盒具有操作简单，灵敏度及准确率高的优点，适用于临床全自动生化分析。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供了一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2；
所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、防腐剂、4-氨基安替比林和缓冲液；
所述的试剂R2包括：腺苷、显色剂、防腐剂、缓冲液、聚六亚甲基胍和β-环糊精。
优选地，所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒中，所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶100.0-300.0U/L、黄嘌呤氧化酶300.0-500.0U/L、过氧化物酶400.0-800.0U/L、防腐剂0.2-1.0g/L、4-氨基安替比林0.4-1.5mmol/L和缓冲液80.0-100.0mmol/L；
所述的试剂R2包括：腺苷6.0-20.0mmol/L、显色剂1.0-3.0mmol/L、防腐剂0.2-1.0g/L、缓冲液80.0-100.0mmol/L、聚六亚甲基胍1.0-3.0g/L和β-环糊精100.0-500.0mg/L。
其中，所述的防腐剂为叠氮化钠和硫柳汞中的至少一种或几种；优选为叠氮化钠。
其中，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和3-吗啉丙磺酸缓冲液中的至少一种或几种；优选地，所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
其中，所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺和苯酚中的至少一种或几种；优选地，所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺。
最优选地，所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶200.0U/L、黄嘌呤氧化酶400.0U/L、过氧化物酶600.0U/L、叠氮化钠0.5g/L、4-氨基安替比林1.0mmol/L和三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L；
所述的试剂R2包括：腺苷10.0mmol/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺20.0mmol/L、叠氮化钠0.5g/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L、聚六亚甲基胍2.0g/L和β-环糊精300.0mg/L。
所述的试剂R1的pH值为6.5-7.5，试剂R2的pH值为6.5-7.5。
本发明还提供了上述腺苷脱氨酶测定试剂盒的测定方法。
所述腺苷脱氨酶测定试剂盒适用于杜邦AR、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞BS320、迪瑞CS600、雅培C8000、东芝TBA40FR、奥林巴斯AU2700、贝克曼DXC800、西门子ADVIA2400、罗氏P800等全自动生化分析仪。
该腺苷脱氨酶测定试剂盒的测定方法为两点终点法，反应方向为升反应，具体为：
(1)绘制标准曲线：
使用浓度分别为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0U/L的腺苷脱氨酶标准品，将180μL试剂R1和5μL腺苷脱氨酶标准品混合均匀，37℃孵育3min后得到反应液a，测定吸光度A空白，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
向反应液a中加入90μL试剂R2混合均匀，37℃反应2min，得到反应液b，测定吸光度A标准，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
以标准品的吸光度变化值ΔA0(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。
(2)测定腺苷脱氨酶含量：
将180μL试剂R1和5μL待测人血清样本混合均匀，37℃孵育3min后得到反应液1，测定吸光度A1，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
向反应液1中加入90μL试剂R2混合均匀，37℃反应2min，得到反应液2，测定吸光度A2，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
计算样本的吸光度变化值ΔA＝A2-A1。
(3)根据步骤(1)得到的标准曲线方程，计算样本中腺苷脱氨酶的浓度。
本发明与现有技术相比，本发明的有益效果有：
1、本发明通过优化试剂盒中各试剂的配比，本发明的试剂盒具有较宽的线性检测范围(0-500U/L)，显著优于现有技术；
2、本发明通过向试剂R2中加入聚六亚甲基胍和β-环糊精，使得试剂盒的灵敏度显著增加；
3、本发明提供的腺苷脱氨酶测定试剂盒准确度高，理论浓度与实测浓度的线性相关系数R2≧0.99；
4、本发明提供的腺苷脱氨酶测定试剂盒，所需标本量少(5μL血清即可)，且基本不受胆红素、甘油三酯和血红蛋白等影响；当胆红素、甘油三酯和血红蛋白分别高至90μM、3mM和5g/L时，对腺苷脱氨酶测定无明显影响。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例的腺苷脱氨酶测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶100.0U/L、黄嘌呤氧化酶300.0U/L、过氧化物酶400.0U/L、硫柳汞0.2g/L、4-氨基安替比林0.4mmol/L和3-吗啉丙磺酸缓冲液80.0mmol/L；
试剂R2包括：腺苷6.0mmol/L、苯酚1.0mmol/L、硫柳汞0.2g/L、3-吗啉丙磺酸缓冲液80.0mmol/L、聚六亚甲基胍1.0g/L和β-环糊精100.0mg/L；
试剂R1和试剂R2的pH值均为6.5。
实施例2
本实施例的腺苷脱氨酶测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶300.0U/L、黄嘌呤氧化酶500.0U/L、过氧化物酶800.0U/L、叠氮化钠1.0g/L、4-氨基安替比林1.5mmol/L和三羟甲基氨基甲烷缓冲液100.0mmol/L；
试剂R2包括：腺苷20.0mmol/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺3.0mmol/L、叠氮化钠1.0g/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液100.0mmol/L、聚六亚甲基胍3.0g/L和β-环糊精500.0mg/L；
试剂R1和试剂R2的pH值均为7.5。
实施例3
本实施例的腺苷脱氨酶测定试剂盒组分及其浓度如下：
试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶200.0U/L、黄嘌呤氧化酶400.0U/L、过氧化物酶600.0U/L、叠氮化钠0.5g/L、4-氨基安替比林1.0mmol/L和三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L；
试剂R2包括：腺苷10.0mmol/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺20.0mmol/L、叠氮化钠0.5g/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L、聚六亚甲基胍2.0g/L和β-环糊精300.0mg/L；
试剂R1和试剂R2的pH值均为7.0。
对比例1
与实施例3相比，区别仅在于试剂R2中的聚六亚甲基胍含量为0.5g/L。
对比例2
与实施例3相比，区别仅在于试剂R2中的β-环糊精含量为50mg/L。
对比例3
与实施例3相比，区别仅在于试剂R2中的聚六亚甲基胍含量为3.5g/L、β-环糊精含量为550mg/L。
对比例4
中国专利CN108690868A所述试剂盒。
上述实施例及对比例的测定方法如下：使用日立7080全自动生化分析仪，具体参数见下表1：
表1测定条件
主波长 550nm 样品 5μL
次波长 800nm 试剂R1 180μL
反应温度 37℃ 试剂R2 90μL
反应方向 升反应 反应类型 终点法
操作步骤：
(1)绘制标准曲线：
使用浓度分别为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0U/L的腺苷脱氨酶标准品，将180μL试剂R1和5μL腺苷脱氨酶标准品，37℃孵育3min后得到反应液a，测定吸光度A空白，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
向反应液a中加入90μL试剂R2混合均匀，37℃反应2min，得到反应液b，测定吸光度A标准，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
以标准品的吸光度变化值ΔA0(A标准-A空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。
(2)测定腺苷脱氨酶含量：
将180μL试剂R1和5μL待测人血清样本混合均匀，37℃孵育3min后得到反应液1，测定吸光度A1，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
向反应液1加入90μL试剂R2混合均匀，37℃反应2min，得到反应液2，测定吸光度A2，测定主波长为550nm、次波长为800nm；
计算样本的吸光度变化值ΔA(A2-A1)，根据标准曲线方程，得到样本中腺苷脱氨酶的浓度。
实验例1腺苷脱氨酶测定试剂盒线性范围的测试
使用生理盐水分别配制浓度为0.0、100.0、200.0、300.0、400.0、500.0U/L的腺苷脱氨酶标准品，分别用实施例1-3和对比例4所述试剂测定ADA含量，结果如表2所示：
表2线性范围对比
理论值U/L 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 R2
实施例1 105.0 211.0 312.0 393.0 490.0 0.998
线性偏差％ 5.0％ 5.5％ 4.0％ -1.8％ -2.0％
实施例2 108.0 203.0 308.0 390.0 495.0 0.998
线性偏差％ 8.0％ 1.5％ 2.7％ -2.5％ -1.0％
实施例3 103.0 201.0 301.0 402.0 499.0 0.999
线性偏差％ 3.0％ 0.5％ 0.3％ 0.5％ -0.2％
对比例1 92.0 180.0 320.0 388.0 465.0 0.991
线性偏差％ -8.0％ -10.0％ 6.7％ -3.0％ -7.0％
对比例2 106.0 188.0 249.0 369.0 477.0 0.992
线性偏差％ 6.0％ -6.0％ -17.0％ -7.8％ -4.6％
对比例3 95.0 176.0 320.0 356.0 452.0 0.986
线性偏差％ -5.0％ -12.0％ 6.7％ -11.0％ -9.6％
对比例4 64.0 185.0 242.0 350.0 377.0 0.980
线性偏差％ -36.0％ -7.5％ -19.3％ -12.5％ -24.6％
结果表明：在0-500.0U/L浓度范围内，本发明试剂盒的测试值能够达到理论值且二者相关性较好，R2均大于0.99，由此可见本试剂盒的线性范围较广。
实验例2腺苷脱氨酶检测试剂盒灵敏度
测定空白液(以5μL生理盐水代替待测样品)和3个不同ADA含量的样品，每个样品测10次，计算吸光度平均值M和标准差(SD)，以样品吸光度-3SD大于空白吸光度+3SD的样品浓度作为ADA测定试剂盒的最低检测灵敏度。
根据表3所示结果，对比例1试剂R2中聚六亚甲基胍含量为0.5g/L，试剂盒的灵敏度在1.5U/L左右；对比例2试剂R2中β-环糊精含量为50mg/L，试剂盒的灵敏度在1.0U/L左右；对比例3试剂R2中聚六亚甲基胍含量为3.5g/L、β-环糊精含量为550mg/L，试剂盒的灵敏度在1.0U/L左右；对比例4试剂盒的灵敏度为2.0U/L以上。而，本发明的提供的试剂盒(实施例1-3)的灵敏度均为0.5U/L以下。由此可知，本发明创造性地添加了聚六亚甲基胍和β-环糊精，并对其含量进行优化，明显提高了试剂盒的灵敏度。
表3腺苷脱氨酶测定试剂盒灵敏度
实验例4干扰实验
使用实施例3所述的试剂盒，在人血清样本中分别加入不同含量的干扰物质后进行ADA含量的测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，试验结果表明胆红素、甘油三酯和血红蛋白的浓度分别在90μM、3.0mM和5g/L以下时，它们对测定结果的干扰均在2％以下(见表4)。
表4干扰实验
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2；
所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、防腐剂、4-氨基安替比林和缓冲液；
所述的试剂R2包括：腺苷、显色剂、防腐剂、缓冲液、聚六亚甲基胍和β-环糊精。
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1的pH值为6.5-7.5，试剂R2的pH值为6.5-7.5。
3.根据权利要求2所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶100.0-300.0U/L、黄嘌呤氧化酶300.0-500.0U/L、过氧化物酶400.0-800.0U/L、防腐剂0.2-1.0g/L、4-氨基安替比林0.4-1.5mmol/L和缓冲液80.0-100.0mmol/L；
所述的试剂R2包括：腺苷6.0-20.0mmol/L、显色剂1.0-3.0mmol/L、防腐剂0.2-1.0g/L、缓冲液80.0-100.0mmol/L、聚六亚甲基胍1.0-3.0g/L和β-环糊精100.0-500.0mg/L。
4.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为叠氮化钠和硫柳汞中的至少一种或几种。
5.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和3-吗啉丙磺酸缓冲液中的至少一种或几种。
6.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺和苯酚中的至少一种或几种。
7.根据权利要求3所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1包括：嘌呤核苷磷酸化酶200.0U/L、黄嘌呤氧化酶400.0U/L、过氧化物酶600.0U/L、叠氮化钠0.5g/L、4-氨基安替比林1.0mmol/L和三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L；
所述的试剂R2包括：腺苷10.0mmol/L、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺20.0mmol/L、叠氮化钠0.5g/L、三羟甲基氨基甲烷缓冲液90.0mmol/L、聚六亚甲基胍2.0g/L和β-环糊精300.0mg/L。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：其在使用时，检测主波长为550nm，次波长为800nm；测定方法为：向180μL试剂R1加入5μL待测样本，维持3min后测得吸光度值A1，再加入90μL试剂R2，反应2min后测得吸光度值A2，计算吸光度变化值ΔA＝A2-A1。
9.根据权利要求8所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：测定方法中所述的维持、反应的温度为37℃。
10.如权利要求1-7任意一项所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒在测定血清腺苷脱氨酶含量中的应用。
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