CN111662955B - 一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 - Google Patents

一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；所述试剂R1的组分包括：缓冲液、防腐剂、保护剂、抗干扰剂、表面活性剂、反应增强剂、过氧化物酶、嘌呤核甘磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、4‑氨基安替比林和水；所述试剂R2的组分包括：缓冲液、保护剂、反应增强剂、防腐剂、腺苷、色原物质和水。本发明分析灵敏度高，线性可高达300U/L以上，重复性好，抗干扰能力强。

Description

一种腺苷脱氨酶测定试剂盒
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体是一种测定腺昔脱氨酶的试剂盒。
背景技术
腺昔脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)是瞟岭核昔代谢中重要的酶类，是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。其活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与ALT或GGT等组成肝酶语能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中的ADA活性测定可用于:判断急性肝损伤及残留病变:协助诊断慢性肝病:有助于肝纤维的诊断:有助于黄症的鉴别。此外，ADA活性缺乏与重症联合免疫缺陷病(SC1D)有关，作为核酸代谢重要的酶类，ADA缺乏可导致核酸代谢障碍，影响到胸腺的发育，从而引起免疫功能缺陷。脑脊液ADA检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标。ADA在良恶性难辨的渗出液鉴别诊断上也具有重要价值。因此，测定血液、体液中的ADA及其同工酶水平对这些疾病的鉴别、诊断、治疗及免疫功能的研究日趋受到临床重视。
近十几年来，随着对ADA的深入研究，检测方法也不断发展。目前比色法己发展了五代。
第一代ADA测试：ADA将腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine)和氨(NH3)。通过动态测量腺苷265nm处吸光度下降的速度，测算ADA的活性大小。但是该法高底物浓度造成吸光度过高，仅适用于腺苷浓度低于40.00μmol/L。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此，该法不适用于临床应用。
第二代ADA测试:原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot显色反应测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清ADA活性单位。该法所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。
基于同样的原因，ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase，GLDH)反应通过测量340nm处NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reducedform，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，还原型辅酶II)吸光度下降的速度来计算ADA活性。该法也因血清含氨干扰，以及测试系统中过高的NADPH造成非特异性氧化，而不能准确计算ADA活性。
第三代ADA测试：通过ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleosidephosphorylase，PNP)和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XOD)反应连续监测法。通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算ADA活性。但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。
第四代ADA测试：通过ADA偶联PNP、XOD、过氧化氢酶(Ca talase)和醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)，借助过氧化氢(H2O2)反应测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法克服了以往ADA测试的困难，但是，该法剂成本高，阻碍实际临床使用。
第五代ADA测试：ADA酶解腺苷(Adenos ine)脱氨产生次黄苷(Inosine)，再通过PNP的作用，生成次黄嘌呤(Hypoxanthine)，后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和过氧化氢(H2O2)；最后在过氧化物酶(Peroxidase，POD)的作用下H2O2再与N乙基N-(2起基3磺丙基)-3甲基苯肢(EHSPT)、4氨基安替比林(4-aminoantipyrine，4-AAP)反应，生成紫红色的有色眼(Ouinone dye)。通过动态测量有色眼550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。
目前大部分市售试剂盒存在以下问题：分析灵敏度不够，线性范围窄，重复性差，且抗干扰能力弱。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，本发明分析灵敏度高，线性可高达300U/L，重复性好，抗干扰能力强。
本发明，一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成：
试剂R1的组分：
Figure BDA0002602182670000021
试剂R2的组分：
Figure BDA0002602182670000022
Figure BDA0002602182670000031
进一步地，所述磷酸盐为磷酸钾、β-甘油磷酸钠和磷酸氢二钠中的一种或几种。
再进一步地，所述试剂R2中还包括甘油，甘油浓度为0.5～30wt％。
还进一步地，所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300和庆大霉素硫酸盐中的一种或几种。
更进一步地，所述色原物质为TOPS、TOOS、4-氯酚、TBHBA、MADB和EHSPT中的一种或几种。
更进一步地，所述缓冲液为Tris、PB、MOPSO/Na和Hepes缓冲液中的一种或几种。
更进一步地，所述表面活性剂为TritonX-100、PEG6000、Tween20和Tween80中的一种或几种。
更进一步地，所述试剂R1所含组分及浓度为：100mmol/L Tris缓冲液，1.2mol/L天门冬氨酸，0.05mol/L谷氨酸，0.2KU/L嘌呤核苷酸磷酸化酶，0.8KU/L黄嘌呤氧化酶，3KU/L过氧化物酶，2mmol/L 4-AAP，0.05wt％Proclin300，1.2KU/L抗坏血酸氧化酶，5mmol/L偏钒酸钠，0.5wt％Triton X-100，0.2wt％Tween80，100mmol/L氯化镁，50mmol/L氯化钾，20mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mmol/L苯甲酸钠，20mmol/L甘露醇，所述试剂R1的pH为7.0；
所述试剂R2所含组分及浓度为：100mmol/L磷酸盐缓冲液，20mmol/L腺苷，5mmol/LTOPS，0.05wt％proclin300，20wt％甘油，150mmol/L磷酸氢二钠，100mmol/L甘露醇，所述试剂R2的pH为3.0。
本发明的有益效果是：本试剂盒分析灵敏度高，线性范围可高达300U/L，重复性好，并且抗干扰能力强。
附图说明
图1为本发明提出的一种腺苷脱氨酶测定试剂盒的线形图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制各方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中己有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edi tion,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edi tion,2001:Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates:theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego:Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edi tion,Academic Press,San Diego,1998:METHODSIN ENZYMOLOGY,Vo l.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999:和]METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vo l.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000041
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000042
对比例1
(空白组：实施例1去除天门冬氨酸、谷氨酸、甘露醇、磷酸盐、氯离子、钠离子、镁离子、抗坏血酸氧化酶和偏钒酸钠)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000043
Figure BDA0002602182670000051
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000052
对比例2
(空白组+天门冬氨酸)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000053
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000054
对比例3
(空白组+谷氨酸)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000055
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000056
Figure BDA0002602182670000061
对比例4
(空白组+甘露醇)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000062
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000063
对比例5
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000064
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000065
对比例6
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇+氯离子+钠离子+镁离子)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000066
Figure BDA0002602182670000071
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000072
对比例7
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇+磷酸根离子)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000073
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000074
对比例8
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇+磷酸根离子+氯/钠/镁离子)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000081
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000082
对比例9
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇+磷酸根离子+氯/钠/镁离子+抗坏血酸氧化酶)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000083
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000091
对比例10
(空白组+天门冬氨酸+谷氨酸+甘露醇+磷酸根离子+氯/钠/镁离子+偏钒酸钠)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000092
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000093
对比例11
(实施例1中R2试剂调为pH 6.0)
试剂R1的制备：
Figure BDA0002602182670000094
Figure BDA0002602182670000101
试剂R2的制备：
Figure BDA0002602182670000102
使用实施例1中的试剂盒，检测市售的腺苷脱氢酶。用接近线性区间上限的高浓度腺苷脱氢酶样品和接近线性区间下限的低浓度腺苷脱氢酶样品或纯化水混合成至少5个稀释浓度的腺苷脱氢酶样品，试剂校准后重复测定3次稀释后的腺苷脱氢酶样品，根据测定均值和理论值进行线性拟合。
实施例1的线性结果：
Figure BDA0002602182670000103
实施例1的线性范围为300U/L以上，线性相关系数为R2＝0.9986，如图1所示。
针对实施例1、对比例1、对比例2、对比例3以及对比例4进行稳定性测试。将待检试剂分成两份，一份放2-8℃保存，一份放37℃加速，7天后取出同时用因子法(理论因数F＝829)进行梯度稀释样本测试，进行稳定性比对分析。结果如下：
Figure BDA0002602182670000104
Figure BDA0002602182670000111
根据国家规定，企业制定的试剂有效期应在超期一个月内仍稳定，实施例1结果符合要求。将每组的未加速数据与37℃加速7天数据进行对比，将两者的差的绝对值除以未加速数据得到相对偏差，可见，相对于对比例1、2、3和4，实施例1的加速后数据与未加速数据差距最小，因此实施例1是本发明稳定性最好的；对比例1由于缺乏保护剂，加速后数据与未加速数据差距最大，稳定性最差；对比例2中含有天门冬氨酸，对比例3中含有谷氨酸，对比例4中含有甘露醇，加速后数据与未加速数据差距相较对比例1较小，但大于实施例1，这是由于实施例1中的天门冬氨酸、谷氨酸和甘露醇的协同作用使其稳定性有显著的提升。
用实施例1、对比例1～6以及市售试剂盒为对照试剂做对比实验，其中标本号1～16为临床血清，标本号17～19为加入了市售腺苷脱氢酶的临床样品。其中对照试剂为北京利德曼生化股份有限公司生产的腺苷脱氨酶(ADA)测定试剂盒(过氧化物酶法)，该试剂盒的成分未知，为同领域高质量产品，检测结果精度高，因此作为对照标准。
Figure BDA0002602182670000112
Figure BDA0002602182670000121
结果表明，本发明制备的试剂盒与对照试剂相关性较好，测值一致。对比例1中不含保护剂，对比例2、3和4分别含有天门冬氨酸、谷氨酸和甘露醇，对比例5中含有天门冬氨酸、谷氨酸和甘露醇，将对比例1～5的数据与对照试剂数据进行对比，偏差较大，尤其高浓度标本(17～19号)的数据明显偏低；对比例6中含有保护剂以及氯离子、镁离子和钠离子，对比例7中含有保护剂和磷酸根离子，相对于对比例1～4，对比例6和7的数据在高浓度范围与对照试剂数据差距缩小，但是相较实施例1与对照试剂的偏差还是较大，这是由于氯离子、镁离子、钠离子和磷酸盐的联用，显著地缩小了实施例1与对照试剂的结果差距，尤其是对于高浓度标本的检测；对比例8中含有保护剂和盐离子，对比例9中含有保护剂、盐离子和抗坏血酸氧化酶，对比例10中含有保护剂、盐离子和偏钒酸钠，虽然对比例8～10相对于对照试剂数据的偏差，和对比例1～7比虽然明显降低，但是相较实施例1还是明显偏大，这是由于实施例1中的抗坏血酸氧化酶和偏钒酸钠的协同作用，使得实施例1的抗干扰能力更强；而对比例11的数据则说明，本发明试剂盒中R2试剂对于pH值较敏感，这是由于腺苷在酸性条件下较稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成：
试剂R1的组分：
试剂R2的组分：
。
2.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述磷酸盐为磷酸钾、β-甘油磷酸钠和磷酸氢二钠中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中还包括甘油，甘油浓度为0.5～30wt％。
4.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述防腐剂为叠氮钠、ProClin300和庆大霉素硫酸盐中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述色原物质为TOPS、TOOS、4-氯酚、TBHBA、MADB和EHSPT中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为Tris、PB、MOPSO/Na和Hepes缓冲液中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为TritonX-100、PEG6000、Tween20和Tween80中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的腺苷脱氨酶测定试剂盒，其特征在于：
所述试剂R1所含组分及浓度为：100mmol/L Tris缓冲液，1.2mol/L天门冬氨酸，0.05mol/L谷氨酸，0.2KU/L嘌呤核苷酸磷酸化酶，0.8KU/L黄嘌呤氧化酶，3KU/L过氧化物酶，2mmol/L 4-AAP，0.05wt％ Proclin300，1.2KU/L抗坏血酸氧化酶，5mmol/L偏钒酸钠，0.5wt％Triton X-100，0.2wt％Tween80，100mmol/L氯化镁，50mmol/L氯化钾，20mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mmol/L苯甲酸钠，20mmol/L甘露醇，所述试剂R1的pH为7.0；
所述试剂R2所含组分及浓度为：100mmol/L磷酸盐缓冲液，20mmol/L腺苷，5mmol/LTOPS，0.05wt％proclin300，20wt％甘油，150mmol/L磷酸氢二钠，100mmol/L甘露醇，所述试剂R2的pH为3.0。
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