CN111575339A - 1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂 - Google Patents

1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂 Download PDF

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Abstract

提供一种快速测定含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒。1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，及其所使用的定量试剂和定量用试剂盒，对于含葡萄糖试样中1，5‑脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用辅酶I和葡萄糖脱氢酶与NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的清除酶系，清除试样中葡萄糖交叉反应产生的干扰然后采用氧化型辅酶II和1，5‑脱水葡萄糖醇‑6‑磷酸脱氢酶的测定酶系，定量测定生成的还原型辅酶II的方法。

Description

1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂
技术领域
本发明涉及利用不同辅酶的酶学方法定量生物试样中1，5-脱水葡萄糖醇及其定量试剂和定量试剂盒。
背景技术
1，5-脱水葡萄糖醇(简称1，5-AG)可弥补其他血糖监控指标的不足，例如空腹血糖、糖化白蛋白、糖化血红蛋白分别只能反映即时、近2～3周和近2～3个月的血糖，没有一个指标能准确反映最近3～7天的血糖变化情况，1，5-AG刚好补了这个空缺。1，5-AG水平越低，说明血糖控制越差。
1，5-脱水葡萄糖醇的化学结构与葡萄糖非常相似，已知商品化定量1，5-脱水葡萄糖醇的试剂盒都必需清除试样中葡萄糖的干扰，由于生物试样中葡萄糖的含量远远大于1，5-脱水葡萄糖醇，并且1，5-脱水葡萄糖醇的含量很低，故准确定量测定1，5-脱水葡萄糖醇的含量非常困难。
目前测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶学方法主要包括(1)吡喃糖氧化酶法，该方法采用葡萄糖激酶和丙酮酸激酶去除试样中葡萄糖的干扰，但葡萄糖激酶与1，5-脱水葡萄糖醇也发生作用，使测定不准确；并且该方法直接采用Trinder’s显色法，测定灵敏度低。(2)1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶法(中国专利授权公告号CN1179051C)，该方法采用二磷酸腺苷依赖型己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸果糖激酶将试样中的葡萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸，去除葡萄糖干扰，该方法酶系复杂，定量试剂中含有6个酶和多个辅酶，以消除葡萄糖产物和二磷酸腺苷的影响，在同一试剂中难以获得针对全部工具酶的最佳反应条件，并且，磷酸葡萄糖异构酶也会发生可逆反应，使测定不准确。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种更加简便、节约的测定含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的方法，试样中的葡萄糖被完全清除，并且消除逆反应，不会干扰1，5-脱水葡萄糖醇的定量测定方法，以及采用这些方法的试剂和试剂盒。
本发明的另一个优点是清除试样中葡萄糖的酶系与测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系采用不同的酶系及其辅酶或类似物，从而进一步消除干扰。
本发明的另一个优点是测定1，5-脱水葡萄糖醇的酶系不受二磷酸腺苷浓度的影响，可以选用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶。
该方法采用氧化型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称NAD)，或其类似物例如氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称thio-NAD)、或氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(简称APAD)，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系(酶系1)，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，达到实质上完全清除试样中葡萄糖干扰的目的；随之采用通常的三磷酸腺苷依赖型己糖激酶和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，在氧化型辅酶II选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称NADP)或氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称thio-NADP)，存在下与1，5-脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型NADP进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。
另外，本发明还涉及1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，其含有氧化型NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶。
另外，本发明还涉及1，5二脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由含有氧化型NAD或其类似化合物、葡萄糖脱氢酶、NAD依赖型苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、三磷酸腺苷、三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、NADP、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶的试剂组成。
另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应。
另外，本发明还涉及试样中葡萄糖的清除试剂，其特征在于该试剂含有氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶。
另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于采用氧化型NAD或其类似物，与葡萄糖脱氢酶和NAD依赖型苹果酸脱氢酶组成的循环酶系，将试样中的葡萄糖完全转化为葡萄糖酸内酯，并通过清除还原型NAD消除逆反应，采用酶反应对试样中1，5-脱水葡萄糖醇进行定量。
另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂，该试剂含有氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。
另外，本发明还涉及含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量试剂盒，该试剂盒由氧化型NAD或其类似物、葡萄糖脱氢酶、草酰乙酸、NAD依赖型苹果酸脱氢酶，以及对1，5-脱水葡萄糖醇定量所需的酶和化合物组成。
本发明中所指试样是有可能含有葡萄糖的任何试样，例如血液、血浆、血清、尿液等生物体试样。
试样中葡萄糖的清除方法可以按照下述反应式进行：
Figure BSA0000179190090000031
GDH：葡萄糖脱氢酶
MDH：苹果酸脱氢酶
NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
仅仅将葡萄糖转化为葡萄糖酸内酯时，由于反应是可逆的，生成的葡萄糖酸内酯可以再转化为葡萄糖，在该反应体系中通过将NADH转化为NAD，防止了葡萄糖的再转化，试样中的葡萄糖可以完全消除。另外，氧化NADH后，也消除了NADH对后续测定的影响。
上述消除葡萄糖的方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。
葡萄糖脱氢酶NAD或NADP依赖型均可以，特别优选NAD依赖型，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。
NAD依赖型苹果酸脱氢酶的浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选2～30U/mL。
两种酶都是市售商品，如东洋坊公司的NAD/NADP依赖型葡萄糖脱氢酶，积水公司的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶，东洋坊公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶，Sorachim公司的NAD依赖型苹果酸脱氢酶。
氧化型辅酶I选自NAD，或thio-NAD、APAD等类似物，浓度优选0.01mM～100mM，更优选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化镁、土温20、或曲拉通X-100，无机盐类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～0.5％。
通过上述反应消除葡萄糖后，即可采用由三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、氧化型辅酶II和1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶组成的酶系(酶系2)，与1，5-脱水葡萄糖醇反应，对生成的还原型辅酶II进行定量，达到测定1，5-脱水葡萄糖醇的目的。
试样中1，5-脱水葡萄糖醇的的定量方法可以按照下述反应式进行：
Figure BSA0000179190090000041
ATP：三磷酸腺苷
ADP：二磷酸腺苷
1，5-AG-6-P：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸
1，5-AG-6-PDH：1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶
上述酶反应方法必要时在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。
检测1，5-脱水葡萄糖醇所需的酶、辅酶II只要不影响试样中消除葡萄糖，不干扰后续定量，可以与消除葡萄糖的酶系共存。
ATP依赖型己糖激酶浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/mL。
1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶必需选择NADP依赖型，以隔离消除葡萄糖的酶系1，保证测定准确性，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/mL。
辅酶II的浓度优选0.01mM～100mM，更优选0.1～50mM，特别优选1～10mM。赋活剂如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、土温20、或曲拉通X-100，无机盐类的浓度优选0.001～30g/L，更优选0.01～10g/L，特别优选0.1～9g/L，表面活性剂的浓度优选0.001～10％，更优选0.01％～1％，特别优选0.1％～0.5％。
两种酶很容易从市售商品获得，如三磷酸腺苷依赖型己糖激酶可从罗氏公司、东洋坊公司、旭化成公司购得，NADP依赖型1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶可从旭化成公司购得。
由于1，5-脱水葡萄糖醇在试样中的浓度很低，糖代谢异常情况下浓度更低，故有必要对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，例如黄递酶催化还原型辅酶II与四唑盐反应，生成甲臜色素，选择摩尔吸光度高的四唑盐，生成的甲臜色素吸光度更高。常用的四唑盐包括氯化2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑(简称INT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’-二甲基]-双[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑盐氯化物](简称NTB)、2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简称WST-1)，硝基蓝四唑盐、2-(4-碘代苯)-3-(2，4-二硝基苯)-5-(2，4-二硫代苯)-2H-四唑钠盐(简称WST-3)，2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-(2-磺乙基)氨基甲酰苯基]-3，3’-二甲氧基-4，4’-二亚苯基)二四氮唑二钠盐(简称WST-5)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)4，4’-二甲基]-双(2，5-二苯基-2H-四唑盐氯化物)(简称TB)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-苯基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-硫代苯基)-2H-四唑盐(简称MTS)等。
四唑盐浓度优选0.01～50mM，特别优选0.1～10mM。
本发明中使用的黄递酶为NADP依赖型，以进一步隔离消除葡萄糖的酶系1，保证测定准确性，其商品可从旭化成公司购得，浓度优选0.1～200U/mL，更优选0.5～50U/mL，最优选1～30U/mL。
另外，对生成的还原型辅酶II采用高灵敏度方法定量，还可以采用Trinder’s方法，用NADPH氧化酶氧化NADPH生成过氧化氢，对过氧化氢进行显色定量。Trinder’s方法中使用的过氧化物酶和各种色原体，包括独立色原体和与4-氨基安替比林组合的色原体，优选摩尔吸光度高的独立色原体，以提高测定灵敏度。
独立色原体包括10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪(简称DA-67)，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺(简称DA-64)，10-N-羧基甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(简称CCAP)等。
与4-氨基安替比林组合的色原体包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-间甲苯胺(简称TOOS)，N，N-二(4-磺丙基)-3-甲苯胺(简称TODB)等。
反应在水性介质、缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、电子受体、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶存在下，在10～50℃条件下反应1～30分钟，优选2～10分钟。
缓冲液例如磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、Good‘s缓冲液等。
赋活剂例如各种无机盐类、表面活性剂，如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、硫酸锌、甘油、甘露糖醇、海藻糖、土温20、曲拉通X-100等。
稳定剂例如牛血清白蛋白、氨基酸、可溶性淀粉、聚乙二醇、螯合剂等。
其它可以添加的酶或辅酶例如过氧化氢酶、FAD等。
防腐剂例如ProClin 300、叠氮钠等。
本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类物、草酰乙酸、己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。
上述试剂可以制成1，5-脱水葡萄糖醇定量用试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2组成，试剂1含有(a)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者(b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。
本发明的葡萄糖消除用试剂含有葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。
本发明的1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂含有三磷酸腺苷依赖型己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。
该定量试剂可以制成由试剂1和试剂2组成的试剂盒，其中试剂1含有(a)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，或者(b)葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶、氧化型辅酶I或其类似物、草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。试剂2含有(a)己糖激酶、三磷酸腺苷、1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶、氧化型辅酶II，或者(b)己糖激酶、三磷酸腺苷、氧化型辅酶II，必要时还含有上述缓冲液、酶活性调节剂、赋活剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、色原体、黄递酶、四唑盐、其它酶及其基质或辅酶等。
本发明的各种试剂可以调制成冻干品后供给，也可以溶解于水等液体中供给。
附图说明
【图1】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。
【图2】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。
【图3】表示1，5-脱水葡萄糖醇的标准曲线，横轴的1，5-AG(μg/mL)表示1，5-脱水葡萄糖醇的浓度，纵轴表示毫吸光度mAbs。
【图4】表示采用本法得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(a：纵轴)与市售对照试剂得到的1，5-脱水葡萄糖醇浓度(b：横轴)的相关图。
具体实施方式
以下给出具体实施例：
实施例1
配制具有如下组成的葡萄糖消除用试剂：
Figure BSA0000179190090000071
实施例2
配制具有如下组成的1，5-脱水葡萄糖醇定量用试剂：
试剂1
Figure BSA0000179190090000072
试剂2
Figure BSA0000179190090000081
实施例3
将1，5-脱水葡萄糖醇的25μg/mL标准溶液稀释成具有不同浓度的5溶液作为试样，在6μL试样和纯水中加入240μL实施例2中的试剂1，在37℃下作用5分钟，之后加入80μL实施例2中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，绘制标准曲线如图1所示。
实施例4
进行葡萄糖消除试样以确定本方法的有效性。在试管内加入240μL实施例2中的试剂1，分别加入(a)纯水、(b)含25μg/mL的1，5-脱水葡萄糖醇溶液、(c)含2000mg/dL的葡萄糖溶液、(d)含25μg/mL的1，5-脱水葡萄糖醇和2000mg/dL的葡萄糖的溶液6μL，在37℃下作用5分钟，之后分别加入80μL实施例2中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，结果如表1所示(c)与(a)的值几乎一致，采用本方法可以完全清除(c)检测液中的高浓度葡萄糖。(b)和(d)的值几乎相同，因此可以说明本方法的有效性。
表1：
Figure BSA0000179190090000082
实施例5
采用20例血清试样，与市售1，5-AG商品同时进行测定比对，明确本方法的相关性和实用性，在6μL试样和纯水中加入240μL实施例2中的试剂1，在37℃下作用5分钟，之后加入80μL实施例2中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，结果如图2所示，相关系数r＝0.9908，回归方程y＝1.0132x+0.0851。
实施例6
配制具有如下组成的1，5-脱水葡萄糖醇定量用试剂：
试剂1
Figure BSA0000179190090000091
试剂2
Figure BSA0000179190090000092
实施例7
将1，5-脱水葡萄糖醇的25μg/mL标准溶液稀释成具有不同浓度的5溶液作为试样，在6μL试样和纯水中加入240μL实施例6中的试剂1，在37℃下作用5分钟，之后加入80μL实施例6中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，绘制标准曲线如图3所示。
实施例8
进行葡萄糖消除试样以确定本方法的有效性。在试管内加入240μL实施例6中的试剂1，分别加入(a)纯水、(b)含25μg/mL的1，5-脱水葡萄糖醇溶液、(c)含2000mg/dL的葡萄糖溶液、(d)含25μg/mL的1，5-脱水葡萄糖醇和2000mg/dL的葡萄糖的溶液6μL，在37℃下作用5分钟，之后分别加入80μL实施例6中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，结果如表1所示(c)与(a)的值几乎一致，采用本方法可以完全清除(c)检测液中的高浓度葡萄糖。(b)和(d)的值几乎相同，因此可以说明本方法的有效性。
表2：
Figure BSA0000179190090000101
实施例9
采用20例血清试样，与市售1，5-AG商品同时进行测定比对，明确本方法的相关性和实用性，在6μL试样和纯水中加入240μL实施例6中的试剂1，在37℃下作用5分钟，之后加入80μL实施例6中的试剂2，再使之反应5分钟，记录540nm处的测定吸光度，结果如图4所示，相关系数r＝0.9881，回归方程y＝1.0009x+0.0368。

Claims (7)

1.含葡萄糖试样中1，5-脱水葡萄糖醇的定量方法，其特征在于在葡萄糖清除酶系采用一种辅酶，在1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系采用另一种辅酶，通过不同的辅酶隔离葡萄糖清除酶系与1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系，通过对1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系辅酶的变化进行定量。
2.如权利要求1所述的定量方法，其中所述葡萄糖清除酶系采用的辅酶是氧化型辅酶I选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、以及氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸。
3.如权利要求1所述的定量方法，其中所述1，5-脱水葡萄糖醇定量酶系辅酶是氧化型辅酶II选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
4.如权利要求1或3所述的定量方法，辅酶II的定量是通过NADP依赖型黄递酶和四唑盐生成的色素进行的。
5.1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂盒，其含有第1试剂和氧化型辅酶I，第2试剂和氧化型辅酶II；
第1试剂含有葡萄糖脱氢酶，NAD依赖型苹果酸脱氢酶，草酰乙酸，辅酶I选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、以及氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸；
第2试剂含有三磷酸腺苷，三磷酸腺苷依赖型己糖激酶，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，辅酶II选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
6.1，5-脱水葡萄糖醇定量试剂盒，其含有第1试剂和氧化型辅酶I，第2试剂和氧化型辅酶II；
第1试剂含有葡萄糖脱氢酶，NAD依赖型苹果酸脱氢酶，草酰乙酸，1，5-脱水葡萄糖醇-6-磷酸脱氢酶，辅酶I选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、以及氧化型3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸；
第2试剂含有三磷酸腺苷，三磷酸腺苷依赖型己糖激酶，辅酶II选自氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
7.如权利要求5或6所述的定量试剂盒，其中第1试剂和第2试剂中还分开含有NADP依赖型黄递酶和四唑盐。
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