JP3821773B2 - ピロ燐酸定量用乾式分析素子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は試料液中のピロ燐酸を定量するピロ燐酸定量用乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非常に多くの生合成反応には、ピロ燐酸の放出およびピロ燐酸の分解が含まれる。このため、生合成反応を熱力学的な観点から調べる場合には、ピロ燐酸の定量が有効である。例えば、核酸合成はＤＮＡポリメラーゼによりデオキシヌクレオシド３リン酸を触媒しながら進行する。その際、核酸合成の副産物としてピロ燐酸が放出される。核酸合成において、このピロ燐酸の放出はエネルギー的に非常に重要である。また、このピロ燐酸を検出することで、核酸合成が行われたか否かを確認することも可能である。
【０００３】
従来試料液中のピロ燐酸の定量は、式１に示すような方法（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２）が主に用いられてきた。式１に示す方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をスルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）に変換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによりルシフェリンに作用して生じる発光を検出するものである。そのため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには発光を測定できる装置が必要である。またこの方法は、乾式分析素子への適応が困難であり、測定の簡便性および迅速生の向上を達し得ないという問題がある。
【０００４】
【化１】
【０００５】
これまでも、無機燐定量用試薬は開発、発明されてきた。例えば、「Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２」に記載されているＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をイノシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化してキサンチン、さらに酸化して尿酸を生成させ、このＸＯＤによる酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものである。
【０００６】
また、特開平７−１９７号公報には、前記のＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法において、ＰＮＰの基質として、イノシンの代わりにキサントシンを使用した無機燐定量用試薬とこれを用いた乾式分析素子が開示されている。
【０００７】
しかしながら、これらは、無機燐定量用試薬及び無機燐定量用乾式分析素子であって、試料液中のピロ燐酸を定量することはできない。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２
【非特許文献２】
Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２
【特許文献１】
特開平７−１９７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微量な試料液中のピロ燐酸を比色法で定量することが可能で、かつ簡便性及び迅速性に優れるピロ燐酸定量用乾式分析素子を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため各種試薬を研究した結果、乾式分析素子中においてピロ燐酸をピロホスファターゼで無機燐に変換し、この無機燐を検出することにより、ピロ燐酸を比色測定により簡便かつ迅速に定量することが可能な乾式分析素子を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子が提供される。
【００１２】
好ましくは、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を有する、ピロ燐酸定量用乾式分析素子が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子による反応原理は、式２または式３に示したように、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐（Ｐｉ）に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をキサントシンまたはイノシンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものである。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【化３】
【００１６】
ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，１）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，ＥＣ２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ，ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用することができる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成させるものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によって色素を生成する組成物（例、米国特許４,０８９,７４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素を生成する化合物を含む組成物（例えば４-アミノアンチピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使用することができる。
【００１７】
（Ａ） 乾式分析素子：本発明において使用することのできる乾式分析素子とは、一層または複数層の機能層からなる分析素子であって、その少なくとも一層（または複数の層に渡って）に検出試薬を含有させ、層内での反応により生じた生成色素を、分析素子の外から反射光あるいは透過光により比色定量するものである。
【００１８】
このような乾式分析素子を用いて定量分析するには、液体試料を展開層の表面に一定量点着する。展開層で展開された液体試料は試薬層に達し、ここで試薬と反応し、発色する。点着後、乾式分析素子を適当な時間、一定温度に保って（インクベーション）発色反応を充分に進行させた後、例えば透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定して反射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて定量分析を行う。
【００１９】
乾式分析素子においては、検出を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
【００２０】
(Ｂ) ピロ燐酸定量用乾式分析素子：本発明で使用することのできるピロ燐酸定量用乾式分析素子は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構成とすることができる。乾式分析素子は、前記（Ｅ）項（ピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出）における、式２または式３の反応を行うための試薬の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層としてもよい。このような乾式分析素子として、例えば特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国特許３，９９２，１５８）、特開昭５１−４０１９１号公報（対応米国特許４，０４２，３３５）、及び特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特許０１６６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがある。
【００２１】
本発明で用いることができる乾式分析素子としては、ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子が挙げられる。
このピロ燐酸定量用乾式分析素子においては、ピロホスファターゼを用いて酵素的にピロ燐酸（ＰＰｉ）を無機燐（Ｐｉ）に変換するまでは本明細書中上記した通り行うことができ、それ以降は、生化学検査分野で既知の以下に述べる「無機燐の定量法」（及びそれらに用いられる各反応の組み合わせ）を用いることにより、無機燐（Ｐｉ）の量に応じた発色反応を行うことができる。
【００２２】
なお、「無機燐」を表記する場合、燐酸（燐酸イオン）として、「Ｐｉ」と表記する場合と「ＨＰＯ4 2-、Ｈ2ＰＯ4 1-」と表記する両方の場合がある。以下に示す反応の例では、「Ｐｉ」として表記するが、同じ反応式に対して「ＨＰＯ4 2-」と表記する場合もある。
【００２３】
無機燐の定量法としては酵素法と燐モリブテン酸塩法が知られている。以下、無機燐の定量法としての酵素法と燐モリブテン酸塩法について説明する。
【００２４】
ａ．酵素法
Ｐｉを定量検出するための一連の反応における最後の「呈色反応」に用いる酵素に応じて、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる方法とグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法がある。以下、これらの方法の具体例を説明する。
【００２５】
（１）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる方法の例
（１−１）
無機燐（Ｐｉ）を、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により、イノシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して尿酸を生成する。この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いて、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールとを酸化縮合させてキノンイミン色素を形成し、これを比色する。
【００２６】
（１−２）
無機燐（Ｐｉ）、コカルボキシラーゼ（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、Ｍｇ2+の存在下で、ピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）により酸化してアセチル酢酸を生成する。この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いて、上記（１−１）の場合と同様に、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールとを酸化縮合させてキノンイミン色素を形成し、これを比色する。
【００２７】
なお、上記の（１−１）および（１−２）における最後の呈色反応は、過酸化水素の検出試薬として既知の「Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬」を使用して行うことができる。この反応で、フェノールは「水素供与体」として働く。「水素供与体」として用いるフェノールは古典的で、現在は改良された様々な「水素供与体」が使用されている。このような水素供与体の具体例としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、及びＮ−スルホプロピルアニリンなどが挙げられる。
【００２８】
（２）グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法
（２−１）
無機燐（Ｐｉ）とグリコーゲンとをホスホリラーゼを用いて反応させ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−１−Ｐ）を生成させる。生じたグルコース−１−燐酸をホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、グルコース−６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコース−６−燐酸とニコチアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）との存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡＤＨにし、これを比色する。
【００２９】
（２−２）
無機燐（Ｐｉ）とマルトースとをマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて反応させ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−１−Ｐ）を反応させる。以下、上記（２−１）と同様に、生じたグルコース−１−燐酸をホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、グルコース−６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコース−６−燐酸とニコチアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）との存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡＤＨにし、これを比色する。
【００３０】
ｂ．燐モリブテン酸塩法
酸性下で無機燐（燐酸塩）と水溶性モリブテン酸イオンとを錯化させた「燐モリブテン酸塩（Ｈ3［ＰＯ4Ｍｏ12Ｏ36］）を直接定量する「直接法」と、上記直接法の反応に続いて、還元剤により、Ｍｏ（IV）からＭｏ（III）として、モリブテン青（Ｍｏ（III））を定量する「還元法」とがある。水溶性モリブテン酸イオンの例としては、モリブテン酸アルミニウム、モリブテン酸カドミウム、モリブテン酸カルシウム、モリブテン酸バリウム、モリブテン酸リチウム、モリブテン酸カリウム、モリブテン酸ナトリウム、モリブテン酸アンモニウムなどが挙げられる。還元法で使用される代表的な還元剤の例としては、１，２，４アミノナフトールスルホン酸、硫酸第一鉄アンモニウム、塩化第一鉄、塩化第一スズ−ヒドラジン、硫酸−ｐ−メチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−フェニレンジアミン、アスコルビン酸、マラカイトグリーンなどが挙げられる。
【００３１】
光透過性水不透過性支持体を用いる場合の乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。ただし、本発明の内容はこれに限定されない。
(１) 支持体上に試薬層を有するもの。
(２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するもの。
(３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に有するもの。
(４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層をこの順に有するもの。
(５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１試薬層、をこの順に有するもの。
【００３２】
上記（１）ないし（３）において試薬層は異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層には、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。
【００３３】
支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、その間に接着層を設けてもよい。
【００３４】
以下、各層や試薬等について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
支持体：支持体は光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させるため通常、これらの表面に下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。
【００３６】
試薬層：試薬層はピロ燐酸検出試薬を含有する。この試薬層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましい。これら水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーからなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは試薬層で生成される生成物（色素）や、試薬層内に含有する試薬などを考慮して決められる。
【００３７】
試薬層として多孔性層を用いる場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブランフイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５５−９０８５９号公報（対応米国特許４,２５８,００１）、特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許４,４８６,５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ ０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公報、特開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
【００３８】
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００３９】
例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるのも有用な方法である。
【００４０】
こうして作られる試薬層の厚さは特に制限されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。
【００４１】
親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである。
【００４２】
親水性ポリマーバインダーで構成される試薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許３,９９２,１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４,２９２,２７２）、特開昭５４−１０１３９８号公報（対応米国特許４,１３２,５２８）等の明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成物と親水性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとする試薬層の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ／ｍ2〜約５０ｇ／ｍ2、好ましくは約４ｇ／ｍ2〜約３０ｇ／ｍ2の範囲である。
【００４３】
試薬層には式２または式３の試薬組成物の他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧 基礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２０頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編「Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５,４６７−４７７頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４,３００−３１０頁（１９８０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；ＭＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使用することはできない。
【００４４】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調製することができる。ピロ燐酸定量用乾式分析素子は一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４,１６９,７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４,３８７,９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。
【００４５】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液体試料中の被検物であるピロ燐酸の定量検出ができる。例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を試薬層に点着する。点着した分析素子を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。分析素子内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のピロ燐酸の量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
【００４６】
測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４,４２４,１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
【実施例】
実施例１
(１) ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μmの無色透明ポリエチレンテレフタレ−ト（ＰＥＴ）平滑フイルムシ−ト（支持体）上に表１記載の組成（ａ）の水溶液を、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
【００４８】
【表１】
表１：
試薬層水溶液の組成 ( ａ )
ゼラチン １８．８ｇ/ｍ2
ｐ-ノニルフェノキシポリキシド−ル １．５ｇ/ｍ2
(グリシド−ル単位：平均10含有)
(Ｃ9Ｈ19−Ｐｈ−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−Ｏ)10Ｈ)
キサントシン １．９６ｇ/ｍ2
ペルオキシダ−ゼ １５０００ＩＵ/ｍ2
キサンチンオキシダ−ゼ １３６００ＩＵ/ｍ2
プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ ３４００ＩＵ/ｍ2
ロイコ色素 ０．２８ｇ/ｍ2
(２−(３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル)−４−
フェネチル−５−(４−ジメチルアミノフェニル)イミダゾ−ル）
水 １３６ｇ/ｍ2
( 希ＮａＯＨ溶液でｐＨを６．８に調整 )
【００４９】
この試薬層の上に下記の表２記載の組成（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して接着層を設けた。
【００５０】
【表２】
表２：
接着層水溶液の組成 ( ｂ )
ゼラチン ３．１ｇ/ｍ2
ｐ-ノニルフェノキシポリキシド−ル ０．２５ｇ/ｍ2
(グリシド−ル単位：平均10含有)
(Ｃ9Ｈ19−Ｐｈ−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−Ｏ)10Ｈ)
水 ５９ｇ / ｍ 2
【００５１】
次いで接着層の上に３０ｇ／ｍ2の割合で水を全面に供給してゼラチン層を膨潤させ、その上に純ポリエステル製のブロ−ド織物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。
【００５２】
次にこの展開層の上から下記の表３記載の組成（ｃ）の水溶液を以下の被覆率となるようにほぼ均一塗布し、乾燥させ、１３ｍｍ×１４ｍｍに裁断し、プラスチック製マウント材内に収めることで、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作成した。
【００５３】
【表３】
表３：
展開層水溶液の組成 ( ｃ )
ＨＥＰＥＳ ２．３ｇ/ｍ2
スクロ−ス ５．０ｇ/ｍ2
ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス ０．０４ｇ/ｍ2
(メトキシ基１９〜２４％、ヒドロキシプロポキシ基４〜１２％)
ピロフォスファタ−ゼ １４０００ＩＵ/ｍ2
水 ９８．６ｇ/ｍ2
( 希ＮａＯＨ溶液でｐＨを７．２に調整 )
【００５４】
測定例１：試料溶液中のピロ燐酸濃度とピロ燐酸定量用乾式分析素子の発色の関係
純度を確認したピロ燐酸カリウム（和光純薬）を用いて、０；０．１；０．２；０．５；１．０（ｍＭ）の各濃度のピロ燐酸水溶液を調整し、実施例１で作製した乾式多層分析素子に２０μＬを点着した。乾式分析素子を３７℃にて６分間インクベーション後、波長６５０ｎｍにて指示体側から反射濃度（ＯＤR）を測定した。結果を表４及び図１に示す。これから、本乾式分析素子を用いて試料液中のピロ燐酸を定量的に測定できることが判る。
【００５５】
【表４】
表４：
試料溶液中のピロ燐酸濃度と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係
ピロ燐酸濃度 ( ｍＭ ) ５分後の反射光学濃度（ＯＤ R ）
０ ０．３６
０．１ ０．４６
０．２ ０．５９
０．５ ０．８０
１．０ １．０１
【００５６】
測定例２：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたヒト全血中の緑膿菌の検出
（１）緑膿菌を添加したヒト全血の調製
ＬＢ培地(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ)で一晩培養した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）の培養液を元に、ＰＢＳによる希釈で濃度を変化させた溶液を、ＥＤＴＡ採血したヒト全血に添加することで、１ｍＬ当りそれぞれ、０、５×１０5、５×１０6、２．５×１０6、５×１０7、１×１０8 の菌体個数を含む６水準のヒト全血を調製した。ここで、菌体個数は分光光度計を用いて見積もった値である。
【００５７】
(２) ヒト全血からの核酸の抽出、精製
上記（１）で調整した緑膿菌を添加し調整した６水準のヒト全血を試料とし、そのそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。
【００５８】
(３) ＰＣＲ増幅
上記（２）で、６水準のヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００５９】
＜プライマ−＞
緑膿菌のゲノム核酸に特異的(ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ(Iｎａｋ)Ｎ末)な配列を持つ以下のプライマ−セットを使用した。
プライマ−(upper)：５'-ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣ-３'（配列番号１）
プライマ−(lower):５'-ＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣ-３'（配列番号２）
【００６０】
以下に示す反応液の組成で、[デネイチャ−：９４℃・１分、アニ−リング：５５℃・１分、ポリメラ−ゼ伸長反応：７２℃・１分]を３０サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。
【００６１】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ
２０μＭ プライマ−(ｕｐｐｅｒ) １μＬ
２０μＭ プライマ−(ｌｏｗｅｒ) １μＬ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ０．２５μＬ
（２）で得た核酸試料液 ５μＬ
精製水 ３３．７５μＬ
【００６２】
(４)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（３）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、実施例１で製作した乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベ−ション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化を図２に、５分後の反射光学濃度（ＯＤR）を表５に、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を図３に示した。
【００６３】
【表５】
表５：ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係
緑膿菌個数 (/1 ｍＬ：ヒト全血 ) ５分後の反射光学濃度（ＯＤ R ）
０ ０．５３０
５×１０5 ０．５５５
５×１０6 ０．５７２
２．５×１０6 ０．５９５
５×１０7 ０．６２３
１×１０ 8 ０．６５５
【００６４】
測定例２の結果より、緑膿菌を含むヒト全血より定法に従って得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を、緑膿菌のゲノム核酸に特異的な配列を持つプライマ−セットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのままもちいて、生成したピロ燐酸を、本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤR）として測定することで、ヒト全血中に存在する緑膿菌の量に応じた反射光学濃度（ＯＤR）が得られることがわかる。
【００６５】
測定例３：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出
(１)タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既知である、各々１人から採取した血液試料のそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。
【００６６】
(２) ＰＣＲ増幅
上記（１）で、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００６７】
＜プライマ−＞
プライマ−は、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかに、共通のプライマ−(ｕｐｐｅｒ)と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定(プライマ−塩基配列の下線部分)した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する、２種のプライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）および、プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）のセットを使用した。
【００６８】
プライマ−(upper)：
５'-ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ-３'（配列番号３）
プライマ−(lower-1):
５'-ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡ３'（配列番号４）
または、
プライマ−(upper)：
５'-ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ-３'（配列番号３）
プライマ−(lower-2):
５'-ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＡ-３’（配列番号５）
【００６９】
以下に示す反応液の組成で、[デネイチャ−：９４℃・２０秒、アニ−リング：６０℃・３０秒、ポリメラ−ゼ伸長反応：７２℃・１分３０秒]を３５サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。
【００７０】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ
５μＭプライマ−(upper) ２μＬ
５μＭプライマ−(lower-1または-2) ２μＬ
Ｔａｑ ０．５μＬ
（１）で得た核酸断片試料液 ０．５μＬ
精製水 ３５μＬ
【００７１】
(３)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（２）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、実施例１で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベーション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化を図４に、５分後の反射光学濃度（ＯＤR）を表６に示した。
【００７２】
【表６】
【００７３】
測定例３の結果より、共通プライマ−と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマ−それぞれとのプライマ−セットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま用いて、生成したピロリン酸量を、本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤR）の大小として測定し、その反射光学濃度（ＯＤR）の大小と使用したＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマ−の関係により、試料のＡＬＤＨ２の活性型、すなわちアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することができることがわかる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のピロ燐酸定量用試薬を適応したピロ燐酸定量用乾式分析素子を使用することで、簡便かつ迅速に、比色測定を行う簡単な装置で、ピロ燐酸を定量することが可能である。
【００７５】
【配列表】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試料溶液中のピロ燐酸濃度と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を示す。
【図２】図２は、ヒト全血中の緑膿菌個数と反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化の関係を示す。
【図３】図３は、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を示す。
【図４】図４は、試料のＡＬＤＨ−２の活性型／不活性型と反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化の関係を示す。●：プライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）使用、○：プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）使用
【発明の属する技術分野】
本発明は試料液中のピロ燐酸を定量するピロ燐酸定量用乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
非常に多くの生合成反応には、ピロ燐酸の放出およびピロ燐酸の分解が含まれる。このため、生合成反応を熱力学的な観点から調べる場合には、ピロ燐酸の定量が有効である。例えば、核酸合成はＤＮＡポリメラーゼによりデオキシヌクレオシド３リン酸を触媒しながら進行する。その際、核酸合成の副産物としてピロ燐酸が放出される。核酸合成において、このピロ燐酸の放出はエネルギー的に非常に重要である。また、このピロ燐酸を検出することで、核酸合成が行われたか否かを確認することも可能である。
【０００３】
従来試料液中のピロ燐酸の定量は、式１に示すような方法（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２）が主に用いられてきた。式１に示す方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をスルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）に変換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによりルシフェリンに作用して生じる発光を検出するものである。そのため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには発光を測定できる装置が必要である。またこの方法は、乾式分析素子への適応が困難であり、測定の簡便性および迅速生の向上を達し得ないという問題がある。
【０００４】
【化１】
これまでも、無機燐定量用試薬は開発、発明されてきた。例えば、「Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２」に記載されているＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をイノシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化してキサンチン、さらに酸化して尿酸を生成させ、このＸＯＤによる酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものである。
【０００６】
また、特開平７−１９７号公報には、前記のＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法において、ＰＮＰの基質として、イノシンの代わりにキサントシンを使用した無機燐定量用試薬とこれを用いた乾式分析素子が開示されている。
【０００７】
しかしながら、これらは、無機燐定量用試薬及び無機燐定量用乾式分析素子であって、試料液中のピロ燐酸を定量することはできない。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２
【非特許文献２】
Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２
【特許文献１】
特開平７−１９７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微量な試料液中のピロ燐酸を比色法で定量することが可能で、かつ簡便性及び迅速性に優れるピロ燐酸定量用乾式分析素子を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため各種試薬を研究した結果、乾式分析素子中においてピロ燐酸をピロホスファターゼで無機燐に変換し、この無機燐を検出することにより、ピロ燐酸を比色測定により簡便かつ迅速に定量することが可能な乾式分析素子を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子が提供される。
【００１２】
好ましくは、キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を有する、ピロ燐酸定量用乾式分析素子が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子による反応原理は、式２または式３に示したように、ピロ燐酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐（Ｐｉ）に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をキサントシンまたはイノシンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものである。
【００１４】
【化２】
【化３】
ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，１）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，ＥＣ２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ，ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用することができる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成させるものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によって色素を生成する組成物（例、米国特許４,０８９,７４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素を生成する化合物を含む組成物（例えば４-アミノアンチピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使用することができる。
【００１７】
（Ａ） 乾式分析素子：本発明において使用することのできる乾式分析素子とは、一層または複数層の機能層からなる分析素子であって、その少なくとも一層（または複数の層に渡って）に検出試薬を含有させ、層内での反応により生じた生成色素を、分析素子の外から反射光あるいは透過光により比色定量するものである。
【００１８】
このような乾式分析素子を用いて定量分析するには、液体試料を展開層の表面に一定量点着する。展開層で展開された液体試料は試薬層に達し、ここで試薬と反応し、発色する。点着後、乾式分析素子を適当な時間、一定温度に保って（インクベーション）発色反応を充分に進行させた後、例えば透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波長域で反射光量を測定して反射光学濃度を求め、予め求めておいた検量線に基づいて定量分析を行う。
【００１９】
乾式分析素子においては、検出を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
【００２０】
(Ｂ) ピロ燐酸定量用乾式分析素子：本発明で使用することのできるピロ燐酸定量用乾式分析素子は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構成とすることができる。乾式分析素子は、前記（Ｅ）項（ピロ燐酸（ＰＰｉ）の検出）における、式２または式３の反応を行うための試薬の他、支持体、展開層、検出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含む多重層としてもよい。このような乾式分析素子として、例えば特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国特許３，９９２，１５８）、特開昭５１−４０１９１号公報（対応米国特許４，０４２，３３５）、及び特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４，２９２，２７２）、特開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特許０１６６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがある。
【００２１】
本発明で用いることができる乾式分析素子としては、ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子が挙げられる。
このピロ燐酸定量用乾式分析素子においては、ピロホスファターゼを用いて酵素的にピロ燐酸（ＰＰｉ）を無機燐（Ｐｉ）に変換するまでは本明細書中上記した通り行うことができ、それ以降は、生化学検査分野で既知の以下に述べる「無機燐の定量法」（及びそれらに用いられる各反応の組み合わせ）を用いることにより、無機燐（Ｐｉ）の量に応じた発色反応を行うことができる。
【００２２】
なお、「無機燐」を表記する場合、燐酸（燐酸イオン）として、「Ｐｉ」と表記する場合と「ＨＰＯ4 2-、Ｈ2ＰＯ4 1-」と表記する両方の場合がある。以下に示す反応の例では、「Ｐｉ」として表記するが、同じ反応式に対して「ＨＰＯ4 2-」と表記する場合もある。
【００２３】
無機燐の定量法としては酵素法と燐モリブテン酸塩法が知られている。以下、無機燐の定量法としての酵素法と燐モリブテン酸塩法について説明する。
【００２４】
ａ．酵素法
Ｐｉを定量検出するための一連の反応における最後の「呈色反応」に用いる酵素に応じて、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる方法とグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法がある。以下、これらの方法の具体例を説明する。
【００２５】
（１）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いる方法の例
（１−１）
無機燐（Ｐｉ）を、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）により、イノシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して尿酸を生成する。この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いて、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールとを酸化縮合させてキノンイミン色素を形成し、これを比色する。
【００２６】
（１−２）
無機燐（Ｐｉ）、コカルボキシラーゼ（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、Ｍｇ2+の存在下で、ピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）により酸化してアセチル酢酸を生成する。この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いて、上記（１−１）の場合と同様に、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とフェノールとを酸化縮合させてキノンイミン色素を形成し、これを比色する。
【００２７】
なお、上記の（１−１）および（１−２）における最後の呈色反応は、過酸化水素の検出試薬として既知の「Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬」を使用して行うことができる。この反応で、フェノールは「水素供与体」として働く。「水素供与体」として用いるフェノールは古典的で、現在は改良された様々な「水素供与体」が使用されている。このような水素供与体の具体例としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、及びＮ−スルホプロピルアニリンなどが挙げられる。
【００２８】
（２）グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる方法
（２−１）
無機燐（Ｐｉ）とグリコーゲンとをホスホリラーゼを用いて反応させ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−１−Ｐ）を生成させる。生じたグルコース−１−燐酸をホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、グルコース−６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコース−６−燐酸とニコチアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）との存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡＤＨにし、これを比色する。
【００２９】
（２−２）
無機燐（Ｐｉ）とマルトースとをマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を用いて反応させ、グルコース−１−燐酸（Ｇ−１−Ｐ）を反応させる。以下、上記（２−１）と同様に、生じたグルコース−１−燐酸をホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）により、グルコース−６−燐酸（Ｇ−６−Ｐ）にする。グルコース−６−燐酸とニコチアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）との存在下、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）により、ＮＡＤを還元してＮＡＤＨにし、これを比色する。
【００３０】
ｂ．燐モリブテン酸塩法
酸性下で無機燐（燐酸塩）と水溶性モリブテン酸イオンとを錯化させた「燐モリブテン酸塩（Ｈ3［ＰＯ4Ｍｏ12Ｏ36］）を直接定量する「直接法」と、上記直接法の反応に続いて、還元剤により、Ｍｏ（IV）からＭｏ（III）として、モリブテン青（Ｍｏ（III））を定量する「還元法」とがある。水溶性モリブテン酸イオンの例としては、モリブテン酸アルミニウム、モリブテン酸カドミウム、モリブテン酸カルシウム、モリブテン酸バリウム、モリブテン酸リチウム、モリブテン酸カリウム、モリブテン酸ナトリウム、モリブテン酸アンモニウムなどが挙げられる。還元法で使用される代表的な還元剤の例としては、１，２，４アミノナフトールスルホン酸、硫酸第一鉄アンモニウム、塩化第一鉄、塩化第一スズ−ヒドラジン、硫酸−ｐ−メチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−フェニレンジアミン、アスコルビン酸、マラカイトグリーンなどが挙げられる。
【００３１】
光透過性水不透過性支持体を用いる場合の乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。ただし、本発明の内容はこれに限定されない。
(１) 支持体上に試薬層を有するもの。
(２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するもの。
(３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に有するもの。
(４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層をこの順に有するもの。
(５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１試薬層、をこの順に有するもの。
【００３２】
上記（１）ないし（３）において試薬層は異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層には、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホスファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。
【００３３】
支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、その間に接着層を設けてもよい。
【００３４】
以下、各層や試薬等について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
支持体：支持体は光不透過性（不透明）、光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いることができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させるため通常、これらの表面に下塗り層を設けるか、親水化処理を施す。
【００３６】
試薬層：試薬層はピロ燐酸検出試薬を含有する。この試薬層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーからなる層とするのが好ましい。これら水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーからなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは試薬層で生成される生成物（色素）や、試薬層内に含有する試薬などを考慮して決められる。
【００３７】
試薬層として多孔性層を用いる場合、その多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であってもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリコット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブランフイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５５−９０８５９号公報（対応米国特許４,２５８,００１）、特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許４,４８６,５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ ０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公報、特開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層の積層物も好適である。
【００３８】
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００３９】
例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるのも有用な方法である。
【００４０】
こうして作られる試薬層の厚さは特に制限されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。
【００４１】
親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルアミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである。
【００４２】
親水性ポリマーバインダーで構成される試薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許３,９９２,１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公報（対応米国特許４,２９２,２７２）、特開昭５４−１０１３９８号公報（対応米国特許４,１３２,５２８）等の明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成物と親水性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマーをバインダーとする試薬層の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ／ｍ2〜約５０ｇ／ｍ2、好ましくは約４ｇ／ｍ2〜約３０ｇ／ｍ2の範囲である。
【００４３】
試薬層には式２または式３の試薬組成物の他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧 基礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２０頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編「Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５,４６７−４７７頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４,３００−３１０頁（１９８０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；ＭＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使用することはできない。
【００４４】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調製することができる。ピロ燐酸定量用乾式分析素子は一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４,１６９,７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４,３８７,９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。
【００４５】
本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液体試料中の被検物であるピロ燐酸の定量検出ができる。例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を試薬層に点着する。点着した分析素子を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。分析素子内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のピロ燐酸の量を求めることができる。点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施できる。
【００４６】
測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４,４２４,１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４７】
【実施例】
実施例１
(１) ピロ燐酸定量用乾式分析素子の作製
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μmの無色透明ポリエチレンテレフタレ−ト（ＰＥＴ）平滑フイルムシ−ト（支持体）上に表１記載の組成（ａ）の水溶液を、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
【００４８】
【表１】
表１：
試薬層水溶液の組成 ( ａ )
ゼラチン １８．８ｇ/ｍ2
ｐ-ノニルフェノキシポリキシド−ル １．５ｇ/ｍ2
(グリシド−ル単位：平均10含有)
(Ｃ9Ｈ19−Ｐｈ−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−Ｏ)10Ｈ)
キサントシン １．９６ｇ/ｍ2
ペルオキシダ−ゼ １５０００ＩＵ/ｍ2
キサンチンオキシダ−ゼ １３６００ＩＵ/ｍ2
プリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ ３４００ＩＵ/ｍ2
ロイコ色素 ０．２８ｇ/ｍ2
(２−(３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル)−４−
フェネチル−５−(４−ジメチルアミノフェニル)イミダゾ−ル）
水 １３６ｇ/ｍ2
( 希ＮａＯＨ溶液でｐＨを６．８に調整 )
【００４９】
この試薬層の上に下記の表２記載の組成（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して接着層を設けた。
【００５０】
【表２】
表２：
接着層水溶液の組成 ( ｂ )
ゼラチン ３．１ｇ/ｍ2
ｐ-ノニルフェノキシポリキシド−ル ０．２５ｇ/ｍ2
(グリシド−ル単位：平均10含有)
(Ｃ9Ｈ19−Ｐｈ−Ｏ−(ＣＨ2ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ2−Ｏ)10Ｈ)
水 ５９ｇ / ｍ 2
【００５１】
次いで接着層の上に３０ｇ／ｍ2の割合で水を全面に供給してゼラチン層を膨潤させ、その上に純ポリエステル製のブロ−ド織物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設けた。
【００５２】
次にこの展開層の上から下記の表３記載の組成（ｃ）の水溶液を以下の被覆率となるようにほぼ均一塗布し、乾燥させ、１３ｍｍ×１４ｍｍに裁断し、プラスチック製マウント材内に収めることで、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作成した。
【００５３】
【表３】
表３：
展開層水溶液の組成 ( ｃ )
ＨＥＰＥＳ ２．３ｇ/ｍ2
スクロ−ス ５．０ｇ/ｍ2
ヒドロキシプロピルメチルセルロ−ス ０．０４ｇ/ｍ2
(メトキシ基１９〜２４％、ヒドロキシプロポキシ基４〜１２％)
ピロフォスファタ−ゼ １４０００ＩＵ/ｍ2
水 ９８．６ｇ/ｍ2
( 希ＮａＯＨ溶液でｐＨを７．２に調整 )
【００５４】
測定例１：試料溶液中のピロ燐酸濃度とピロ燐酸定量用乾式分析素子の発色の関係
純度を確認したピロ燐酸カリウム（和光純薬）を用いて、０；０．１；０．２；０．５；１．０（ｍＭ）の各濃度のピロ燐酸水溶液を調整し、実施例１で作製した乾式多層分析素子に２０μＬを点着した。乾式分析素子を３７℃にて６分間インクベーション後、波長６５０ｎｍにて指示体側から反射濃度（ＯＤR）を測定した。結果を表４及び図１に示す。これから、本乾式分析素子を用いて試料液中のピロ燐酸を定量的に測定できることが判る。
【００５５】
【表４】
表４：
試料溶液中のピロ燐酸濃度と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係
ピロ燐酸濃度 ( ｍＭ ) ５分後の反射光学濃度（ＯＤ R ）
０ ０．３６
０．１ ０．４６
０．２ ０．５９
０．５ ０．８０
１．０ １．０１
【００５６】
測定例２：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたヒト全血中の緑膿菌の検出
（１）緑膿菌を添加したヒト全血の調製
ＬＢ培地(Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ)で一晩培養した緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ Ｓｙｒｉｎｇａｅ）の培養液を元に、ＰＢＳによる希釈で濃度を変化させた溶液を、ＥＤＴＡ採血したヒト全血に添加することで、１ｍＬ当りそれぞれ、０、５×１０5、５×１０6、２．５×１０6、５×１０7、１×１０8 の菌体個数を含む６水準のヒト全血を調製した。ここで、菌体個数は分光光度計を用いて見積もった値である。
【００５７】
(２) ヒト全血からの核酸の抽出、精製
上記（１）で調整した緑膿菌を添加し調整した６水準のヒト全血を試料とし、そのそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。
【００５８】
(３) ＰＣＲ増幅
上記（２）で、６水準のヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００５９】
＜プライマ−＞
緑膿菌のゲノム核酸に特異的(ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ(Iｎａｋ)Ｎ末)な配列を持つ以下のプライマ−セットを使用した。
プライマ−(upper)：５'-ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣ-３'（配列番号１）
プライマ−(lower):５'-ＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣ-３'（配列番号２）
【００６０】
以下に示す反応液の組成で、[デネイチャ−：９４℃・１分、アニ−リング：５５℃・１分、ポリメラ−ゼ伸長反応：７２℃・１分]を３０サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。
【００６１】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μＬ
２０μＭ プライマ−(ｕｐｐｅｒ) １μＬ
２０μＭ プライマ−(ｌｏｗｅｒ) １μＬ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ０．２５μＬ
（２）で得た核酸試料液 ５μＬ
精製水 ３３．７５μＬ
【００６２】
(４)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（３）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、実施例１で製作した乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベ−ション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化を図２に、５分後の反射光学濃度（ＯＤR）を表５に、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を図３に示した。
【００６３】
【表５】
表５：ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係
緑膿菌個数 (/1 ｍＬ：ヒト全血 ) ５分後の反射光学濃度（ＯＤ R ）
０ ０．５３０
５×１０5 ０．５５５
５×１０6 ０．５７２
２．５×１０6 ０．５９５
５×１０7 ０．６２３
１×１０ 8 ０．６５５
【００６４】
測定例２の結果より、緑膿菌を含むヒト全血より定法に従って得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を、緑膿菌のゲノム核酸に特異的な配列を持つプライマ−セットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのままもちいて、生成したピロ燐酸を、本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤR）として測定することで、ヒト全血中に存在する緑膿菌の量に応じた反射光学濃度（ＯＤR）が得られることがわかる。
【００６５】
測定例３：ピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いたアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）検出
(１)タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液の調製
予め塩基配列のシーケンシングにより、ＡＬＤＨ２遺伝子関連部位の特定の１塩基種が異なることにより、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型であることが既知である、各々１人から採取した血液試料のそれぞれから、市販の核酸抽出、精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を用いて抽出、精製したゲノミック核酸断片を１ｍＬの精製蒸留水中に回収することで、タ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液を調製した。
【００６６】
(２) ＰＣＲ増幅
上記（１）で、ＡＬＤＨ２活性型またはＡＬＤＨ２不活性型それぞれのヒト全血試料から抽出・精製して得たタ−ゲット核酸断片を含む核酸試料液をそのまま用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った。
【００６７】
＜プライマ−＞
プライマ−は、１２番染色体上のＡＬＤＨ２遺伝子関連部位のなかに、共通のプライマ−(ｕｐｐｅｒ)と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定(プライマ−塩基配列の下線部分)した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する、２種のプライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）および、プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）のセットを使用した。
【００６８】
プライマ−(upper)：
５'-ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ-３'（配列番号３）
プライマ−(lower-1):
５'-ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡ３'（配列番号４）
または、
プライマ−(upper)：
５'-ＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＡＴＧＡ-３'（配列番号３）
プライマ−(lower-2):
５'-ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＡＡＡ-３’（配列番号５）
【００６９】
以下に示す反応液の組成で、[デネイチャ−：９４℃・２０秒、アニ−リング：６０℃・３０秒、ポリメラ−ゼ伸長反応：７２℃・１分３０秒]を３５サイクル繰り返することでＰＣＲ増幅を実施した。
【００７０】
＜反応液の組成＞
１０×ＰＣＲバッファ− ５μＬ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ
５μＭプライマ−(upper) ２μＬ
５μＭプライマ−(lower-1または-2) ２μＬ
Ｔａｑ ０．５μＬ
（１）で得た核酸断片試料液 ０．５μＬ
精製水 ３５μＬ
【００７１】
(３)ピロ燐酸定量用分析素子を用いた検出
前記（２）におけるＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま、実施例１で製作したピロ燐酸定量用乾式分析素子上に各々２０μＬ点着し、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を３７℃にて５分間インキュベーション後、波長６５０ｎｍにて支持体側から測定して得られた反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化を図４に、５分後の反射光学濃度（ＯＤR）を表６に示した。
【００７２】
【表６】
測定例３の結果より、共通プライマ−と、ＡＬＤＨ２の活性を決定する１塩基多型に対応する部分を３'末端付近に設定した、ＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマ−それぞれとのプライマ−セットを使用しＰＣＲを行い、そのＰＣＲ増幅反応後の溶液をそのまま用いて、生成したピロリン酸量を、本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子を用いて反射光学濃度（ＯＤR）の大小として測定し、その反射光学濃度（ＯＤR）の大小と使用したＡＬＤＨ２活性型および不活性型に対応する２種のプライマ−の関係により、試料のＡＬＤＨ２の活性型、すなわちアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤＨ２遺伝子）関連部位の１塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することができることがわかる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明のピロ燐酸定量用試薬を適応したピロ燐酸定量用乾式分析素子を使用することで、簡便かつ迅速に、比色測定を行う簡単な装置で、ピロ燐酸を定量することが可能である。
【００７５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試料溶液中のピロ燐酸濃度と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を示す。
【図２】図２は、ヒト全血中の緑膿菌個数と反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化の関係を示す。
【図３】図３は、ヒト全血中の緑膿菌個数と５分後の反射光学濃度（ＯＤR）の関係を示す。
【図４】図４は、試料のＡＬＤＨ−２の活性型／不活性型と反射光学濃度（ＯＤR）の時間変化の関係を示す。●：プライマ−（ｌｏｗｅｒ−１）使用、○：プライマ−（ｌｏｗｅｒ−２）使用
Claims (2)
- ピロ燐酸を無機燐に変換する試薬、および無機燐の量に応じた発色反応を行う試薬群を含有する試薬層を備えるピロ燐酸定量用乾式分析素子。
- キサントシンまたはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含有する試薬層を有する、請求項１に記載のピロ燐酸定量用乾式分析素子。
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