JP2002369698A - ピロ燐酸定量用試薬及び乾式分析素子 - Google Patents
ピロ燐酸定量用試薬及び乾式分析素子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料液中のピロ燐酸を比色法で定量する
ことが可能な試薬、及び簡便性、迅速性に優れるピロ燐
酸定量用乾式分析素子を提供する。 【解決手段】 上記課題は、ピロ燐酸をピロホスファタ
ーゼで変換し検出することで達成される。
ことが可能な試薬、及び簡便性、迅速性に優れるピロ燐
酸定量用乾式分析素子を提供する。 【解決手段】 上記課題は、ピロ燐酸をピロホスファタ
ーゼで変換し検出することで達成される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は試料液中のピロ燐酸
を定量するピロ燐酸定量用試薬及びこれを用いた乾式分
析素子に関する。
を定量するピロ燐酸定量用試薬及びこれを用いた乾式分
析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】非常に多くの生合成反応には、ピロ燐酸
の放出およびピロ燐酸の分解が含まれる。このため、生
合成反応を熱力学的な観点から調べる場合には、ピロ燐
酸の定量が有効である。例えば、核酸合成はＤＮＡポリ
メラーゼによりデオキシヌクレオシド３リン酸を触媒し
ながら進行する。その際、核酸合成の副産物としてピロ
燐酸が放出される。核酸合成において、このピロ燐酸の
放出はエネルギー的に非常に重要である。
の放出およびピロ燐酸の分解が含まれる。このため、生
合成反応を熱力学的な観点から調べる場合には、ピロ燐
酸の定量が有効である。例えば、核酸合成はＤＮＡポリ
メラーゼによりデオキシヌクレオシド３リン酸を触媒し
ながら進行する。その際、核酸合成の副産物としてピロ
燐酸が放出される。核酸合成において、このピロ燐酸の
放出はエネルギー的に非常に重要である。
【０００３】従来試料液中のピロ燐酸の定量は、式１に
示すような方法（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２）が主に用い
られてきた。式１に示す方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）を
スルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）に変
換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによりルシフ
ェリンに作用して生じる発光を検出するものである。そ
のため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには
発光を測定できる装置が必要である。またこの方法は、
乾式分析素子への適応が困難であり、測定の簡便性およ
び迅速生の向上を達し得ないという問題がある。
示すような方法（Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄ，１５６，５５−６０，１９９２）が主に用い
られてきた。式１に示す方法は、ピロ燐酸（ＰＰｉ）を
スルフリラーゼによりアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）に変
換し、アデノシン３燐酸がルシフェラーゼによりルシフ
ェリンに作用して生じる発光を検出するものである。そ
のため、この方法でピロ燐酸（ＰＰｉ）を検出するには
発光を測定できる装置が必要である。またこの方法は、
乾式分析素子への適応が困難であり、測定の簡便性およ
び迅速生の向上を達し得ないという問題がある。
【０００４】
【化１】
【０００５】これまでも、無機燐定量用試薬は開発、発
明されてきた。例えば、「Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２」に記載されている
ＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法は、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をイノシン
と反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯＤ）により酸化してキサンチン、さらに酸
化して尿酸を生成させ、このＸＯＤによる酸化過程で生
じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、こ
れを比色するものである。
明されてきた。例えば、「Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，１１，８３，１９８２」に記載されている
ＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法は、プリンヌクレオシドホス
ホリラーゼ（ＰＮＰ）により無機燐（Ｐｉ）をイノシン
と反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンオキシ
ダーゼ（ＸＯＤ）により酸化してキサンチン、さらに酸
化して尿酸を生成させ、このＸＯＤによる酸化過程で生
じる過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）により発色剤（色素前駆体）を発色させ、こ
れを比色するものである。
【０００６】また、特開平７−１９７号公報には、前記
のＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法において、ＰＮＰの基質と
して、イノシンの代わりにキサントシンを使用した無機
燐定量用試薬とこれを用いた乾式分析素子が開示されて
いる。
のＰＮＰ−ＸＯＤ−ＰＯＤ法において、ＰＮＰの基質と
して、イノシンの代わりにキサントシンを使用した無機
燐定量用試薬とこれを用いた乾式分析素子が開示されて
いる。
【０００７】しかしながら、これらは、無機燐定量用試
薬及び無機燐定量用乾式分析素子であって、試料液中の
ピロ燐酸を定量することはできない。
薬及び無機燐定量用乾式分析素子であって、試料液中の
ピロ燐酸を定量することはできない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試料
液中のピロ燐酸を比色法で定量することが可能な試薬、
及び簡便性、迅速性に優れるピロ燐酸定量用乾式分析素
子を提供することにある。
液中のピロ燐酸を比色法で定量することが可能な試薬、
及び簡便性、迅速性に優れるピロ燐酸定量用乾式分析素
子を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記問題点を
解決するため各種試薬を研究した結果、ピロ燐酸をピロ
ホスファターゼで変換し検出することで、比色測定が可
能で、かつ乾式多析素子に適用が可能な、ピロ燐酸の定
量法を見いだし、本発明を完成するに至った。
解決するため各種試薬を研究した結果、ピロ燐酸をピロ
ホスファターゼで変換し検出することで、比色測定が可
能で、かつ乾式多析素子に適用が可能な、ピロ燐酸の定
量法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明の目的は、キサントシン
またはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ及び発色剤を含有するピロ燐酸定量用試薬及
びそれを用いた乾式分析素子により達成された。
またはイノシン、ピロホスファターゼ、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ及び発色剤を含有するピロ燐酸定量用試薬及
びそれを用いた乾式分析素子により達成された。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のピロ燐酸定量用試薬によ
る反応原理は、式２または式３に示したように、ピロ燐
酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐酸（Ｐｉ）
に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮ
Ｐ）により無機燐酸（Ｐｉ）をキサントシンまたはイノ
シンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して
尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ
2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色
剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものであ
る。
る反応原理は、式２または式３に示したように、ピロ燐
酸（ＰＰｉ）をピロホスファターゼで無機燐酸（Ｐｉ）
に変換し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮ
Ｐ）により無機燐酸（Ｐｉ）をキサントシンまたはイノ
シンと反応させ、生じたキサンチンまたはヒポキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）により酸化して
尿酸を生成させ、この酸化過程で生じる過酸化水素（Ｈ
2Ｏ2）を用いてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により発色
剤（色素前駆体）を発色させ、これを比色するものであ
る。
【００１２】
【化２】
【００１３】
【化３】
【００１４】ピロホスファターゼ（ＥＣ３，６，１，
１）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，Ｅ
Ｃ２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ
Ｄ，ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ，ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用するこ
とができる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化
水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成さ
せるものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によ
って色素を生成する組成物（例、米国特許４,０８９,７
４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、
特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４
１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；
酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素
を生成する化合物を含む組成物（例えば４-アミノアン
チピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使
用することができる。
１）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ，Ｅ
Ｃ２．４．２．１）、キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ
Ｄ，ＥＣ１．２．３．２）及びペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ，ＥＣ１．１１．１．７）は市販のものを使用するこ
とができる。発色剤（すなわち色素前駆体）は、過酸化
水素とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）により色素を生成さ
せるものであればよく、例えば、ロイコ色素の酸化によ
って色素を生成する組成物（例、米国特許４,０８９,７
４７等に記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素、
特開昭５９−１９３３５２号公報（ＥＰ ０１２２６４
１Ａ）等に記載のジアリールイミダゾーロイコ色素）；
酸化されたときに他の化合物とカップリングにより色素
を生成する化合物を含む組成物（例えば４-アミノアン
チピリン類とフェノール類又はナフトール類）などを使
用することができる。
【００１５】本発明の試薬には、必要に応じて緩衝剤な
どの試薬を添加してもよい。本試薬での至適ｐＨは好ま
しくは６．０〜８．０の範囲であり、最も好ましいｐＨ
範囲は７．０〜７．５である。また乾式分析素子に適用
する場合には、界面活性剤を併用することが望ましい。
緩衝剤としては後述のものが、界面活性剤としては、非
イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン
性界面活性剤を使用できるが、特に非イオン性界面活性
剤を使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤と
しては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル、ポリグリセリンアルキルフェニルエーテル、及びポ
リオキシエチレンアルキルエーテルが使用できる。
どの試薬を添加してもよい。本試薬での至適ｐＨは好ま
しくは６．０〜８．０の範囲であり、最も好ましいｐＨ
範囲は７．０〜７．５である。また乾式分析素子に適用
する場合には、界面活性剤を併用することが望ましい。
緩衝剤としては後述のものが、界面活性剤としては、非
イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン
性界面活性剤を使用できるが、特に非イオン性界面活性
剤を使用することが好ましい。非イオン性界面活性剤と
しては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル、ポリグリセリンアルキルフェニルエーテル、及びポ
リオキシエチレンアルキルエーテルが使用できる。
【００１６】本発明のピロ燐酸定量用試薬を適用する乾
式分析素子は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構
成とすることができる。乾式分析素子は、式２または式
３の反応を行うための試薬層の他、支持体、展開層、検
出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層
を含む多重層としてもよい。このような乾式分析素子と
して、例えば特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国
特許３,９９２,１５８）、特開昭５１−４０１９１号公
報（対応米国特許４,０４２,３３５）、及び特開昭５５
−１６４３５６号公報（対応米国特許４,２９２,２７
２）、特開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特
許０１６６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがあ
る。
式分析素子は、公知の多種の乾式分析素子と同様の層構
成とすることができる。乾式分析素子は、式２または式
３の反応を行うための試薬層の他、支持体、展開層、検
出層、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層
を含む多重層としてもよい。このような乾式分析素子と
して、例えば特開昭４９−５３８８８号公報（対応米国
特許３,９９２,１５８）、特開昭５１−４０１９１号公
報（対応米国特許４,０４２,３３５）、及び特開昭５５
−１６４３５６号公報（対応米国特許４,２９２,２７
２）、特開昭６１−４９５９号公報（対応ＥＰＣ公開特
許０１６６３６５Ａ）の各明細書に開示されたものがあ
る。
【００１７】光透過性水不透過性支持体を用いる場合の
乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。
ただし、本発明の内容はこれに限定されない。 (１) 支持体上に試薬層を有するもの。 (２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するも
の。 (３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に
有するもの。 (４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層を
この順に有するもの。 (５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層、をこの順に有するもの。
乾式分析素子は、実用的に次のような構成を取り得る。
ただし、本発明の内容はこれに限定されない。 (１) 支持体上に試薬層を有するもの。 (２) 支持体上に検出層、試薬層をこの順に有するも
の。 (３) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層をこの順に
有するもの。 (４) 支持体上に第２試薬層、光反射層、第１試薬層を
この順に有するもの。 (５) 支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層、をこの順に有するもの。
【００１８】上記（１）ないし（３）において試薬層は
異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層に
は、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必
要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質
キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２
試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な
酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３
に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素
前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬
層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反
応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ
反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホ
スファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試
薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。
異なる複数の層から成ってもよい。例えば第１試薬層に
は、式２または式３に示すピロホスファターゼ反応に必
要な酵素ピロホスファターゼ、ＰＮＰ反応に必要な基質
キサントシンまたは基質イノシンと酵素ＰＮＰを、第２
試薬層には、式２または式３に示すＸＯＤ反応に必要な
酵素ＸＯＤを、そして第３試薬層には、式２または式３
に示すＰＯＤ反応に必要な酵素ＰＯＤと発色色素（色素
前駆体）を、それぞれ含有させてもよい。あるいは試薬
層を２層として、第１試薬層ではピロホスファターゼ反
応とＰＮＰ反応を、第２試薬層ではＸＯＤ反応とＰＯＤ
反応を進行させてもよい。又は、第１試薬層ではピロホ
スファターゼ反応とＰＮＰ反応とＸＯＤ反応を、第２試
薬層でＰＯＤ反応を進行させてもよい。
【００１９】支持体と試薬層又は検出層との間には吸水
層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けても
よい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、その
間に接着層を設けてもよい。
層を設けてもよい。また各層の間には濾過層を設けても
よい。また試薬層の上には展開層を設けてもよく、その
間に接着層を設けてもよい。
【００２０】以下、各層や試薬等について詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】支持体：支持体は光不透過性（不透明）、
光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのも
のも用いることができるが、一般的には光透過性で水不
透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体
の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレー
ト、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させる
ため通常、これらの表面に下塗り層を設けるか、親水化
処理を施す。
光半透過性（半透明）、光透過性（透明）のいずれのも
のも用いることができるが、一般的には光透過性で水不
透過性の支持体が好ましい。光透過性水不透過性支持体
の材料として好ましいものはポリエチレンテレフタレー
ト、ポリスチレンである。親水性層を強固に接着させる
ため通常、これらの表面に下塗り層を設けるか、親水化
処理を施す。
【００２２】試薬層：試薬層はピロ燐酸検出試薬を含有
する。この試薬層の水浸透性を確保するためには、多孔
性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバイ
ンダーからなる層とするのが好ましい。これら水浸透性
層のうち、親水性ポリマーバインダーからなる連続層と
するのが好ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは
試薬層で生成される生成物（色素）や、試薬層内に含有
する試薬などを考慮して決められる。
する。この試薬層の水浸透性を確保するためには、多孔
性媒体からなる多孔性層とするか、親水性ポリマーバイ
ンダーからなる層とするのが好ましい。これら水浸透性
層のうち、親水性ポリマーバインダーからなる連続層と
するのが好ましい。用いる親水性ポリマーバインダーは
試薬層で生成される生成物（色素）や、試薬層内に含有
する試薬などを考慮して決められる。
【００２３】試薬層として多孔性層を用いる場合、その
多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であっ
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリ
コット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号
公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブラン
フイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５
５−９０８５９号公報（対応米国特許４,２５８,００
１）、特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許
４,４８６,５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子
からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよ
い。特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ
０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公
報、特開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開Ｅ
Ｐ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号
公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭
６２−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２
６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層
の積層物も好適である。
多孔性媒体は繊維質であってもよいし、非繊維質であっ
てもよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、
織物布地（例えば平織り布地）、編物布地（例えばトリ
コット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることがで
きる。非繊維質材料としては特開昭４９−５３８８８号
公報等に記載の酢酸セルロースなどからなるメンブラン
フイルター、特開昭４９−５３８８８号公報、特開昭５
５−９０８５９号公報（対応米国特許４,２５８,００
１）、特開昭５８−７０１６３号公報（対応米国特許
４,４８６,５３７）等に記載の無機物又は有機物微粒子
からなる連続空隙含有粒状構造物層等のいずれでもよ
い。特開昭６１−４９５９号公報（対応欧州公開ＥＰ
０１６６３６５Ａ）、特開昭６２−１１６２５８号公
報、特開昭６２−１３８７５６号公報（対応欧州公開Ｅ
Ｐ ０２２６４６５Ａ）、特開昭６２−１３８７５７号
公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２６４６５Ａ）、特開昭
６２−１３８７５８号公報（対応欧州公開ＥＰ ０２２
６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多孔性層
の積層物も好適である。
【００２４】多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例
した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する
展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち
織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特
開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー
放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速
度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報
（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１
９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１
３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ
３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公
報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような
親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
した面積に液体を展開する、いわゆる計量作用を有する
展開層であってもよい。展開層としては、これらのうち
織物布地、編物布地などが好ましい。織物布地などは特
開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー
放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展開速
度等を調節するため特開昭６０−２２２７７０号公報
（対応：ＥＰ ０１６２３０１Ａ）、特開昭６３−２１
９３９７号公報（対応西独特許公開ＤＥ ３７１７９１
３Ａ）、特開昭６３−１１２９９９号公報（対応：ＤＥ
３７１７９１３Ａ）、特開昭６２−１８２６５２号公
報（対応：ＤＥ ３７１７９１３Ａ）に記載したような
親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させてもよい。
【００２５】例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等
に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に
設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５
５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるの
も有用な方法である。
に本発明の試薬を予め含浸又は塗布した後、支持体上に
設けた他の水浸透性層、例えば検出層の上に、特開昭５
５−１６４５３５６号公報のような方法で接着させるの
も有用な方法である。
【００２６】こうして作られる試薬層の厚さは特に制限
されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５
０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当
である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法に
よる場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく
変化し得る。
されないが、塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５
０μｍ程度、好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当
である。ラミネートによる積層など、塗布以外の方法に
よる場合、厚さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく
変化し得る。
【００２７】親水性ポリマーバインダーからなる水浸透
性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルア
ミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーと
の共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリア
クリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマ
ーとの共重合体などである。
性層で試薬層を構成する場合、使用できる親水性ポリマ
ーとしては、例えば、以下のものがある。ゼラチン及び
これらの誘導体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロー
ス誘導体（例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガ
ロース、アルギン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合
体やメタアクリルアミド共重合体（例えば、アクリルア
ミド又はメタアクリルアミドと各種ビニル性モニマーと
の共重合体）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリア
クリル酸ナトリウム、アクリル酸と各種ビニル性モノマ
ーとの共重合体などである。
【００２８】親水性ポリマーバインダーで構成される試
薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許
３,９９２,１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公報
（対応米国特許４,２９２,２７２）、特開昭５４−１０
１３９８号公報（対応米国特許４,１３２,５２８）等の
明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成物と親水
性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出
層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けるこ
とができる。親水性ポリマーをバインダーとする試薬層
の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ましくは約
４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ／ｍ2〜
約５０ｇ／ｍ2、好ましくは約４ｇ／ｍ2〜約３０ｇ／ｍ
2の範囲である。
薬層は、特公昭５３−２１６７７号公報（対応米国特許
３,９９２,１５８）、特開昭５５−１６４３５６号公報
（対応米国特許４,２９２,２７２）、特開昭５４−１０
１３９８号公報（対応米国特許４,１３２,５２８）等の
明細書に記載の方法に従って本発明の試薬組成物と親水
性ポリマーを含む水溶液又は水分散液を支持体又は検出
層等の他の層の上に塗布し乾燥することにより設けるこ
とができる。親水性ポリマーをバインダーとする試薬層
の乾燥時の厚さは約２μｍ〜約５０μｍ、好ましくは約
４μｍ〜約３０μｍの範囲、被覆量では約２ｇ／ｍ2〜
約５０ｇ／ｍ2、好ましくは約４ｇ／ｍ2〜約３０ｇ／ｍ
2の範囲である。
【００２９】試薬層には式２または式３の試薬組成物の
他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存
性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補
酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防
止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加
剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができ
る緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧 基
礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２０
頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編「Ｄａｔａ
ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」
第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎｄｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８
頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５,４６７−４７７
頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４,３００−３１０頁（１９８
０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具
体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸
塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；Ｍ
ＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐
酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使
用することはできない。
他に、塗布特性、拡散性化合物の拡散性、反応性、保存
性等の諸性能の向上を目的として、酵素の活性化剤、補
酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤組成物、微粉末、酸化防
止剤、その他、有機物あるいは無機物からなる各種添加
剤を加える事ができる。試薬層に含有させることができ
る緩衝剤の例としては、日本化学会編「化学便覧 基
礎」（丸善(株)、１９６６年発行）１３１２−１３２０
頁、Ｒ．Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ編「Ｄａｔａ
ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」
第２版（Ｏｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃｌａｒｅｎｄｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓｓ，１９６９年発行）４７６−５０８
頁、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５,４６７−４７７
頁（１９６６年）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ」１０４,３００−３１０頁（１９８
０年）に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤系の具
体例として硼酸塩を含む緩衝剤；クエン酸又はクエン酸
塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；ビシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ）を含む緩衝剤；ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤；Ｍ
ＥＳを含む緩衝剤などのグッド緩衝剤等がある。なお燐
酸塩を含む緩衝剤は、ピロ燐酸検出用乾式分析素子に使
用することはできない。
【００３０】本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前
述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調整するこ
とができる。ピロ燐酸定量用乾式分析素子は一辺約５ｍ
ｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等
の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対
応米国特許４,１６９,７５１）、実開昭５６−１４２４
５４号公報（対応米国特許４,３８７,９９０）、特開昭
５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公
報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:Ｗ
Ｏ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて
化学分析スライドとして用いることが製造，包装，輸
送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によ
っては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収め
て用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用い
たり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いた
り、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなども
できる。
述の諸特許明細書に記載の公知の方法により調整するこ
とができる。ピロ燐酸定量用乾式分析素子は一辺約５ｍ
ｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等
の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対
応米国特許４,１６９,７５１）、実開昭５６−１４２４
５４号公報（対応米国特許４,３８７,９９０）、特開昭
５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公
報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:Ｗ
Ｏ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて
化学分析スライドとして用いることが製造，包装，輸
送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によ
っては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収め
て用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用い
たり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いた
り、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなども
できる。
【００３１】本発明のピロ燐酸定量用乾式分析素子は前
述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液
体試料中の被検物であるピロ燐酸の定量検出ができる。
例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４〜１５μＬ
の範囲の水性液体試料液を試薬層に点着する。点着した
分析素子を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好
ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜
１０分間インキュベーションする。分析素子内の発色又
は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成し
た検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のピロ
燐酸の量を求めることができる。点着する液体試料の
量、インキュベーション時間及び温度を一定にすること
により定量分析を高精度に実施できる。
述の諸特許明細書等に記載の操作と同様の操作により液
体試料中の被検物であるピロ燐酸の定量検出ができる。
例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４〜１５μＬ
の範囲の水性液体試料液を試薬層に点着する。点着した
分析素子を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好
ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜
１０分間インキュベーションする。分析素子内の発色又
は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成し
た検量線を用いて比色測定法の原理により検体中のピロ
燐酸の量を求めることができる。点着する液体試料の
量、インキュベーション時間及び温度を一定にすること
により定量分析を高精度に実施できる。
【００３２】測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公
報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２
９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報
（対応米国特許４,４２４,１９１）などに記載の化学分
析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実
施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により
発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよ
い。
報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２
９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報
（対応米国特許４,４２４,１９１）などに記載の化学分
析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実
施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により
発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよ
い。
【００３３】
【実施例】実施例１ ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平滑フイル
ムシート（支持体）上に表１記載の組成（ａ）の水溶液
が、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層
を設けた。
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平滑フイル
ムシート（支持体）上に表１記載の組成（ａ）の水溶液
が、以下の被覆率となるように塗布し、乾燥して試薬層
を設けた。
【００３４】
【表１】
【００３５】この試薬層の上に下記の表２記載の組成
（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布
し、乾燥して接着層を設けた。
（ｂ）の接着層水溶液を以下の被覆率となるように塗布
し、乾燥して接着層を設けた。
【００３６】
【表２】
【００３７】ついで接着層の上に３０ｇ／ｍ2の割合で
水を全面に供給して潤滑させてゼラチン層を膨潤させ、
その上に純ポリエステル製のブロード織物布地をほぼ一
様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設
けた。
水を全面に供給して潤滑させてゼラチン層を膨潤させ、
その上に純ポリエステル製のブロード織物布地をほぼ一
様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設
けた。
【００３８】次にこの展開層の上から下記の表３記載の
組成（ｃ）の水溶液を以下の被履率となるようにほぼ均
一塗布し、乾燥させ、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作
成した。
組成（ｃ）の水溶液を以下の被履率となるようにほぼ均
一塗布し、乾燥させ、ピロ燐酸定量用乾式分析素子を作
成した。
【００３９】
【表３】
【００４０】測定例１ 実施例１で作製した乾式分析素子を用いて以下の試験を
実施した。純度を確認したピロ燐酸（和光純薬）を用い
て、０；０．２５；０．５；１．０；２．０ｍｇ／ｄＬ
の各濃度のピロ燐酸水溶液を調整し、実施例１で作製し
た乾式多層分析素子に１０μＬを点着した。乾式分析素
子を３７℃にて６分間インクベーション後、波長６５０
ｎｍにて支持体側から反射濃度（ＯＤR）を測定した。
結果を表４に示す。これから、本乾式分析素子を用いて
試料液中のピロ燐酸を定量的に測定できることが判る。
実施した。純度を確認したピロ燐酸（和光純薬）を用い
て、０；０．２５；０．５；１．０；２．０ｍｇ／ｄＬ
の各濃度のピロ燐酸水溶液を調整し、実施例１で作製し
た乾式多層分析素子に１０μＬを点着した。乾式分析素
子を３７℃にて６分間インクベーション後、波長６５０
ｎｍにて支持体側から反射濃度（ＯＤR）を測定した。
結果を表４に示す。これから、本乾式分析素子を用いて
試料液中のピロ燐酸を定量的に測定できることが判る。
【００４１】
【表４】
【００４２】
【発明の効果】本発明のピロ燐酸定量用試薬を適応した
ピロ燐酸定量用乾式分析素子を使用することで、簡便か
つ迅速に、比色測定を行う簡単な装置で、ピロ燐酸を定
量することが可能である。
ピロ燐酸定量用乾式分析素子を使用することで、簡便か
つ迅速に、比色測定を行う簡単な装置で、ピロ燐酸を定
量することが可能である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/22 １２２ Ｇ０１Ｎ 31/22 １２２ 33/52 33/52 Ｂ Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BB16 CA10 CB03 DA03 DA08 FA07 FA11 FA17 FB07 FC03 GA05 HA07 2G045 FA11 FB19 GC10 4B063 QA01 QQ89 QR02 QR06 QR10 QR66 QS02 QX02
Claims (2)
- 【請求項１】 キサントシンまたはイノシン、ピロホス
ファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含
有するピロ燐酸定量用試薬 - 【請求項２】 キサントシンまたはイノシン、ピロホス
ファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び発色剤を含
有する試薬層を有する乾式分析素子
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001180131A JP2002369698A (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | ピロ燐酸定量用試薬及び乾式分析素子 |
| US10/318,081 US20040018502A1 (en) | 2001-06-14 | 2002-12-13 | Method for analyzing a target nucleic acid fragment and a kit for analyzing a target nucleic acid fragment |
| US11/106,612 US20050266450A1 (en) | 2001-06-14 | 2005-04-15 | Method for analyzing a target nucleic acid fragment and a kit for analyzing a target nucleic acid fragment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001180131A JP2002369698A (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | ピロ燐酸定量用試薬及び乾式分析素子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002369698A true JP2002369698A (ja) | 2002-12-24 |
Family
ID=19020593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001180131A Pending JP2002369698A (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | ピロ燐酸定量用試薬及び乾式分析素子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002369698A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1435393A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-07 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for analyzing gene expression levels by quantification of pyrophosphoric acid |
| WO2005003750A1 (ja) * | 2003-07-02 | 2005-01-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | ピロリン酸検出センサ、核酸の検出方法、および塩基種判別方法 |
| WO2006092980A1 (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Fujifilm Corporation | 乾式分析要素 |
| KR100643192B1 (ko) | 2003-12-02 | 2006-11-10 | 홍종인 | 신규 이핵 금속 착물 및 이를 이용한 파이로포스페이트의분석방법 |
| US7632392B2 (en) | 2006-01-23 | 2009-12-15 | Panasonic Corporation | Sensor of pyrophosphate and SNP typing sensor using the same |
| WO2012169108A1 (ja) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | パナソニック株式会社 | ピロリン酸の測定方法およびｓｎｐタイピング方法 |
| JP2016152783A (ja) * | 2015-02-20 | 2016-08-25 | 旭化成ファーマ株式会社 | プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた、オルトリン酸、アルカリホスファターゼ、及びピロリン酸等の新規な測定方法、並びに組成物 |
| CN106884034A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定、抗干扰能力强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂及检测方法 |
-
2001
- 2001-06-14 JP JP2001180131A patent/JP2002369698A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1435393A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-07 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method for analyzing gene expression levels by quantification of pyrophosphoric acid |
| WO2005003750A1 (ja) * | 2003-07-02 | 2005-01-13 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | ピロリン酸検出センサ、核酸の検出方法、および塩基種判別方法 |
| CN100453651C (zh) * | 2003-07-02 | 2009-01-21 | 松下电器产业株式会社 | 焦磷酸检测传感器、核酸检测方法以及碱基种类判断方法 |
| KR100643192B1 (ko) | 2003-12-02 | 2006-11-10 | 홍종인 | 신규 이핵 금속 착물 및 이를 이용한 파이로포스페이트의분석방법 |
| WO2006092980A1 (ja) * | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Fujifilm Corporation | 乾式分析要素 |
| JP4866839B2 (ja) * | 2005-02-28 | 2012-02-01 | 富士フイルム株式会社 | 乾式分析要素 |
| US7632392B2 (en) | 2006-01-23 | 2009-12-15 | Panasonic Corporation | Sensor of pyrophosphate and SNP typing sensor using the same |
| WO2012169108A1 (ja) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | パナソニック株式会社 | ピロリン酸の測定方法およびｓｎｐタイピング方法 |
| JP2016152783A (ja) * | 2015-02-20 | 2016-08-25 | 旭化成ファーマ株式会社 | プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた、オルトリン酸、アルカリホスファターゼ、及びピロリン酸等の新規な測定方法、並びに組成物 |
| CN106884034A (zh) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定、抗干扰能力强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂及检测方法 |
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