WO2005003750A1

WO2005003750A1 - ピロリン酸検出センサ、核酸の検出方法、および塩基種判別方法

Info

Publication number: WO2005003750A1
Application number: PCT/JP2004/009787
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Yukimasa; Hidenobu Yaku; Hiroaki Oka; Shin Ikeda; Takahiro Nakaminami
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2003-07-02
Filing date: 2004-07-02
Publication date: 2005-01-13
Also published as: JPWO2005003750A1; CN100453651C; CN1705878A; US20060269915A1; JP3761569B2

Abstract

本発明は、試料液中のピロリン酸を検出するピロリン酸検出センサであって、前記試料液を受容する試料液受容部と、Ｈ＋−ピロホスファターゼを有するＨ＋難透過性膜と、前記Ｈ＋難透過性膜を固定する固定層と、前記固定層の水素イオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する測定手段と、を備える構成であり、前記Ｈ＋−ピロホスファターゼは、前記試料液中のピロリン酸を加水分解し、これに伴って固定層の水素イオン濃度に変化をもたらすように配されている。

Description

ピロリン酸検出センサ、核酸の検出方法、および塩基種判別方法

〔技術分野〕

本発明は、試料中のピロリン酸を簡便かつ高感度で検出するセンサ、ならびにこれを用いた核酸明の検出方法および塩基種判別方法に関する。

〔技術背景〕

田

ピロリン酸は、細胞内における酵素反応に深く関与していることが知られている。例えば、タンパク質の合成過程において、アミノ酸がアミノアシルアデ二ル酸を経由してアミノアシル t RN Aを形成する反応においてピロリン酸が生成される。また、例えば、植物などに見られるデンプン合成の過程では、グルコース— 1一リン酸と AT Pとの反応によつて AD P—グルコースが生成される際に、ピロリン酸が生成される。これら以外にも、種々の酵素反応においてピロリン酸が関与しているこ έτ^ Πられている。従って、ピロリン酸を定量的に検出する技術は、細胞状態、あるいは上記の酵素反応等を解析する上で重要な技術である。従来のピロリン酸測定方法として、 G r i n d 1 e yらの化学的方法 (G. B . G r i n d l e y a n d C.A. N i c h e l , A n a 1. B i o c h e m, vol 3 3. l 1 4 ( 1 9 7 0 ) 参照）が知られている。しかし、この方法では濃硫酸を用いるので、非常に危険が伴う。特開昭 6 1 - 1 2 3 0 0号公報では、濃硫酸などの危険な薬品を用いずに、酵素を利用した三種類のピロリン酸測定方法が開示されている。それらに関して以下に説明する。

第 1の方法は、ピロリン酸をホスホェノールピルビン酸およびアデノシン一リン酸の存在下で、ピルべ一トオルソホスフエ一トジキナーゼを作用させる方法である。この反応によつてピルビン酸が生成されるので、ピルビン酸の量を測定することによってピロリン酸の量を算出することができる。なお、ピルビン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。 1つは、ラクテートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してピルビン酸を NAD Hで還元する際に、 N ADHの減少を比色定量する方法である。もう 1つは、生成したピルビン酸にピルべ一トォキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導くことによって比色定量する方法である。

第 2の方法は、ピロリン酸をシチジンニリングリセロールの存在下でグリセロール一 3—ホスフエ一トシチジルトランスフエラーゼに作用させる方法である。この反応によってグリセロール三リン酸が生成される。従って、グリセロ一ル三リン酸の生成量を測定することでピロリン酸の量を算出することができる。グリセロール三リン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。 1つは、グリセロール— 3—ホスフエートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してグリセ口一ル三リン酸を NAD (P ) で酸化する際に、 NAD ( P ) Hの増加を比色定量する方法である。もう 1つは、生成したグリセロール三リン酸にグリセ口一ル — 3—ホスフエ一トォキシダ一ゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導きこれを比色定量する方法である。

第 3の方法は、ピロリン酸をシチジン二リン酸リビトールの存在下でリビトールー 5一ホスフェートシチジルトランスフェラ一ゼを作用させる方法である。この反応によって D—リビ卜一ルー 5—リン酸が生成されるため、その生成量を測定することでピロリン酸量を測定することができる。 D—リビトール— 5—リン酸を測定する方法は、 NAD (または NAD P ) の存在下でリビトール— 5—ホスフエ一トデヒドロゲナ一ゼを作用させて NADH (または NAD P H) の増加を比色定量する方法が提案されている。

その他にも特開 2 0 0 2— 3 6 9 6 9 8号公報には、ピロホスファターゼによりピロリン酸をリン酸に加水分解した後、プリンヌクレオシドホスホリラ一ゼによりリン酸をイノシンまたはキサントシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンォキシダーゼにより酸化してキサンチンとし、さらに酸化して尿酸を生成させ、このキサンチンォキシダーゼによる酸化過程で生じる過酸化水素をペルォキシダーゼを用いて発色剤を発色させる方法が示されている。

一方、核酸の伸長反応もピロリン酸が関与する重要な生体反応の一種である。

近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラ一メード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。

これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の 1 %以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなく、様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。

この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されているのが S N P ( S i n g 1 e n u c l e o t i d e p o l ym o r p h i s m である。 S N Pは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。 S N Pはヒトゲノム DNA内に 2〜 3百万あると言われており、遺伝子多型のマーカ一として利用しやすく、臨床への応用が期待されている。現在では、 S N P関連技術として、ゲノム中の S N Pの位置同定および S N Pと疾患との関連性等の研究とともに、 S N P部位の塩基を判別する S N Pタイビング技術の開発が行われている。

S N Pタイピングの技術は、ハイブリダィズを利用したもの、制限酵素を利用したもの、リガーゼ等の酵素を利用したもの等様々な種類のものがある。それらの技術のうち、最も簡便な技術としてプライマー伸長反応を利用するものがある。この技術では、プライマ一伸長反応が起こるか否かを判定することによって、 S NPタイピングを行なう。

プライマー伸長反応を利用した S N Pタイビング技術の検出には、実際の D N Aの増幅産物を蛍光色素を用いて検出する方法や、固定化プローブを用いる方法の他に、 DNAポリメラ一ゼによる核酸合成の副産物であるピロリン酸を検出する方法も考案されている。この方法では、伸長反応の進行の差を検出するために、プライマー伸長反応の進行に伴つて生成されるピロリン酸を AT Pに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用してピロリン酸の量を測定する方法を用いている（ J . I mm u n o 1 o g i c a 1 M e t h o d , 1 5 6 , 5 5 - 6 0 , 1 9 9 2参照）。しかしながら上述した方法よるピロリン酸の測定方法においては、プライマー伸長反応において d AT Pを用いる場合、 d AT Pは AT Pと同様にルシフェラ一ゼ反応の基質になる。このため、正確な S N P部位の塩基種の判別ができない。従って、 d AT Pの代わりに DN Aポリメラーゼの基質として作用し、且つルシフェラ一ゼ反応の基質としては作用しない特殊な d AT Pアナログを用いる必要があるという課題があつ 7こ

また、他のピロリン酸の測定技術においても、複数種の酵素、試薬などを必要とし、コストが増大し、工程が複雑化してしまうという不具合がある。また、これらの測定方法においては、上記の理由からキット化および小型センサとしてのデバイス化が困難であるという課題があつた。

さらにこれらの方法のほとんどは光学式検出法であるため、測定装置が大型化してしまうという問題点もあった。〔発明の開示〕

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、試料液中のピロリン酸を簡便かつ高感度でピロリン酸を検出し、かつ構成が簡便なピロリン酸検出センサ、ならびにこれを用いた核酸の検出方法および塩基種判別方法を提供することを目的とする。

これらの目的を達成するために、本発明は、試料液中のピロリン酸を検出するピロリン酸検出センサであって、前記試料液を受容する試料液受容部と、 H +—ピロホスファターゼを有する H +難透過性膜と、前記 H +難透過性膜を固定する固定層と、前記固定層の水素イオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する測定手段と、を備え、前記 H +—ピロホスファ夕一ゼは、前記試料液中のピロリン酸を加水分解し、これに伴つて固定層の水素イオン濃度に変化をもたらすように配されている。このような構成においては、 H +—ピロホスファターゼにより水素イオンの濃度変化がもたらされる固定層が、 H +難透過性膜を固定する機能をも有するので、ピロリン酸検出センサを簡便に構成することができる。上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記固定層がその上面又はその内部に H +難透過性膜を固定する構成である。

上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記 H +難透過性膜が膜小胞であり、前記固定層は前記 H +難透過性膜をその内部に固定する構成である。

上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記測定手段が、前記固定層に接する水素イオン感受性電極と、前記試料液を受容した状態で前記試料液に接するように配された参照電極とを有する構成である。そして、前記測定手段は、前記水素イオン感受性電極と前記参照電極との電位差の変化を測定するように構成することが好ましい。

上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記固定層が高分子ゲルまたは自己組織化単分子膜（以下、 S A M膜とも称す）からなる構成である。高分子ゲルは、その保持能により前記 H +難透過性膜を固定しうる。上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記固定層が水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じる材料を含み、前記測定手段が前記固定層に接する分極性電極と、前記試料液を受容した状態で前記試料液に接するように配された参照電極とを有する構成である。そして、前記測定手段は、前記分極性電極と前記参照電極との間の電流の変化を測定するように構成することが好ましい。

上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記固定層が水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じるメディエー夕を含む高分子ゲルまたは自己組織化単分子膜からなり、その上面に前記 H +難透過性膜を固定する構成である。

上記ピロリン酸検出センサの一形態は、前記固定層が水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じる電解重合材料からなる構成である。また、本発明は、上記ピロリン酸検出センサを用いる、特定の塩基配列を有する核酸の検出方法であって、試料と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料液を調製する工程（ a ) 、前記試料液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（b ) 、前記ピロリン酸検出センサの前記試料液受容部に前記試料液が受容された状態とする工程（ c ) 、前記ピロリン酸検出センサの前記測定手段により前記固定層の水素イオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する工程（d ) 、工程（d ) の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ e ) 、および工程（ e ) の検出結果に基づいて前記核酸を検出する工程（ f ) を包含する。

また、本発明は、上記ピロリン酸検出センサを用いる、核酸の塩基配列中の塩基種判別方法であって、核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料液を調製する工程（ a ) 、前記試料液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（b ) 、前記ピロリン酸検出センサの前記試料液受容部に前記試料液が受容された状態とする工程（c ) 、前記ピロリン酸検出センサの前記測定手段により前記固定層の水素イオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する工程（d ) 、工程（d ) の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ e ) 、および工程（ e ) の検出結果に基づいて前記核酸の塩基配列中の塩基種を判別する工程（ f ) を包含する。本発明の上記目的、他の目的、特徴、及び利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。

〔図面の簡単な説明〕

図 1は、植物の液胞膜に内在された状態の H +—ピロホスファタ一ゼを模式的に表す図である。

図 2は、第 1の実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。

図 3は、第 2の実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。

図 4は、第 3の実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。

図 5は、第 4の実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。

図 6は、第 5の実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。

図 7は、ピロリン酸検出センサの構成例 1を模式的に示す断面図である。

図 8は、ピロリン酸検出センサの構成例 2を模式的に示す断面図である。

図 9は、ピロリン酸検出センサの構成例 3を模式的に示す断面図である。

図 1 0は、ピロリン酸検出センサの構成例 4を模式的に示す新面図でめる。

図 1 1は、検出を目的とする DNAと DNAプロ一ブとにおいて S N P部位が一致した場合の反応系を示す図である。

図 1 2は、検出を目的とする DNAと DNAプローブとにおいて S N P部位が一致しない場合の反応系を示す図である。

図 1 3 Aは λ D Ν Αの特定の塩基配列に完全にハイプリダイズし得る 2種類のプライマ一 Cおよびプライマ一 Dを表す図、図 1 3 Bは P C R 反応液 Gおよび Hの組成を表す表を示す図、図 1 3 Cは P C R反応を行なった反応温度条件を表すフローチヤ一トである。

図 1 4 Aは野性型 λ D N A、変異型 λ D N Aおよびタイピングプライマーを表す図、図 1 4 Bは P C R反応液 Iおよび Jの組成を表す表を示す図、図 1 4 Cは P C R反応を行なった反応温度条件を表すフローチヤートである。

〔発明を実施するための最良の形態〕

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。まず、図 1を用いて本発明の反応原理を説明する。本発明では、ピロリン酸を定性的又は定量的に検出するために、 H +—ピロホスファターゼを用いる。図 1は、植物の液胞膜に内在された状態の H +—ピロホスファターゼを模式的に表す図である。図 1に示すように、 H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1は通常、植物等の液胞膜 1 3内に存在する膜夕ンパク質であり、 1分子のピ口リン酸 1 0から 2分子のリン酸 1 2を生成する加水分解反応に伴って、水素イオンを通さない、あるいは通しにくい液胞膜 1 3の外側（表面 1 3 a側）から液胞膜 1 3の内側（裏面 1 3 b側）に向けて水素イオンを輸送する性質を有する。このため、 H +—ピロホスファ夕一ゼの酵素反応によって、液胞膜 1 3の内部では水素イオン濃度が増大し、液胞膜 1 3の外部では水素イオン濃度が減少する。

各実施形態にかかるピロリン酸検出センサでは、 H +—ピロホスファターゼの上記性質及び膜タンパク質であるという形態を利用して、ピロリン酸の検出を行う。すなわち、 H +—ピロホスファターゼを保持する膜で領域を分離し、少なくともいずれか一方の水素イオン濃度の変化を測定することにより、 H +—ピロホスファ夕ーゼが加水分解に寄与したピ口リン酸の量を検出することができる。このように、各実施形態にかかるピ口リン酸検出センサでは、 H +—ピロホスファタ一ゼの作用に直接的にかかわった水素イオンの濃度変化を検出することにより、ピロリン酸の検出を行うので、簡便かつ高感度の検出が可能である。また、上述の検出を行うためには、水素イオンの輸送元の領域と、水素イオンの輸送先の領域との分離が必須要件となるが、 H +—ピロホスファ夕ーゼは膜タンパク質であることにより、その形態を領域の分離に利用することができる。このことは、ピロリン酸検出センサの構成の簡素化に寄与する。

各実施形態のピロリン酸検出センサを用いた検出工程においては、ピ口リン酸を含む試料液を、植物細胞等から単離してきた液胞膜 1 3等の H +難透過性膜に内在している状態の H +—ピロホスファターゼに接触させる。

この後、 H +難透過性膜の内側あるいは H +難透過性膜の外側の水素ィオン濃度の変化を測定する。このことによって、試料液中のピロリン酸の有無あるいは量を測定し、ピロリン酸の定性的検出あるいは定量的検出を行う。

(第 1の実施形態）

本実施形態は、ピロリン酸検出センサに係るものである。図 2は、本実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。ピロリン酸検出センサ 3 1は、絶縁基板 2 2と、絶縁基板 2 2上に固定された溶液保持部材 2 5によって形成される溶液保持部 3 2と、測定手段とを有する。溶液保持部 3 2は、基板 2 2上に形成された固定層 5 1 と、前記固定層 5 1上面に固定された H +難透過性膜 2 1 と、これらが構成されていない領域である試料液受容部 3 3 とからなる。測定手段は、固定層 5 1 と接するように基板 2 2直上に配された水素イオン感受性電極 2 3と、試料液受容部 3 3に試料液 2 6が満たされた状態で、試料液 2 6に接するように配された参照電極 2 7 とを有する。

H +難透過性膜 2 1は、 H +—ピロホスファターゼ 1 1を有する。 H + 難透過性膜 2 1は、 H +—ピロホスファターゼ 1 1の部分を除いて水素イオンを透過させにくい膜からなり、例えば天然の液胞膜、もしくは人ェの脂質二重膜等が利用できる。 H +難透過性膜 2 1において、 H +—ピ口ホスファターゼ 1 1のピロリン酸を加水分解する活性部位は、試料液受容部 3 3側に露出している。

固定層 5 1は、水素イオンを十分透過させ水分を保持し得る材料で形成されている。また、固定層 5 1は、その上面に H +難透過性膜 2 1 を固定可能な材料で形成されている。固定層 5 1は、その保持能を利用して H +難透過性膜 2 1を上面に固定するゲルや、架橋反応を利用して H + 難透過性膜 2 1を上面に固定する S A M膜で形成することができる。このような材料として、ァガロースゲル等の高分子ゲル、フラーレン様化合物を含む材料、等を用いることができる。

水素イオン感受性電極 2 3としては、通常の p Hセンサとして機能できるものであればよく、ガラス電極、 I S F E T電極（ i o n s e n s i t i v e F E T、ゲートにイオン感受性膜を使用したイオン感受性 F ET) 、 LAP S (L i g h t -A d d r e s s a b l e P o t e n t i om e t r i c S e n s o r ) 等が利用できる。

参照電極 2 7には、標準水素電極、銀 Z塩化銀電極、飽和カロメル電極等が利用できる。

絶縁基板 2 2と溶液保持部材 2 5は、ピロリン酸の加水分解反応に影響しない材料で形成されていればよく、ガラス、シリコン、プラスチック等で形成され得る。

ピロリン酸検出センサ 3 1を用いて、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸を検出する方法及びその原理について説明する。まず、試料液 2 6 を試料液受容部 3 3に満たす。試料液 2 6にピロリン酸が含まれる場合、 H ⁺—ピロホスファタ一ゼ 1 1の活性により、ピロリン酸がリン酸へと加水分解され、それに伴って固定層 5 1内の水素イオン濃度が上昇する。それを、水素イオン感受性電極 2 3を用いて測定することによって、測定液 2 6中のピロリン酸濃度を検出することができる。具体的には、水素イオン感受性電極 2 3と参照電極 2 7 との電位差の変化を測定することによって、固定層 5 1内の水素イオン濃度変化を測定し、かかる測定結果に基づいて測定液 2 6中のピロリン酸濃度を検出する。

なお、 H +難透過性膜 2 1は、ピロリン酸を加水分解する活性部位が固定層 5 1側（内部）に露出している H +—ピロホスファタ一ゼを含んでいても良い。ただし、ピロリン酸を加水分解する活性部位が内部に露出している H +—ピロホスファターゼを有する H+難透過性膜 2 1 を用いる場合、固定層 5 1のピロリン酸の濃度は、試料液 2 6のピロリン酸の濃度よりも低くしておくことが好ましく、固定層 5 1にはピロリン酸を含まないことが最も好ましい。このことによって、固定層 5 1から試料液 2 6への水素イオン輸送が減少あるいは停止し、試料液 2 6から固定層 5 1への水素イオンの輸送が優勢となって、固定層 5 1の水素ィォン濃度の変化が、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸によるものにほぼ限定される。したがって、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸の量を正確に見積もることができる。

ピロリン酸検出センサ 3 1は、固定層 5 1の試料液受容部 3 3との境界面全てが H +難透過性膜 2 1で被覆されている構成ではないので、 H + 難透過性膜 2 1で被覆されていない境界部分から試料液 2 6と固定層 5 1 との間の水素イオンの移動が可能であり、平衡状態を保つべくこの部分から水素イオンが拡散するが、拡散による水素イオンの移動は、 H + 一ピロホスファタ一ゼ 1 1の活性による水素イオンの移動と比較して遅いので、水素イオン感受性電極 2 3によって測定される水素イオンの濃度変化はほぼ H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1の活性によるものとすることができる。

(第 2の実施形態）

本実施形態は、ピロリン酸検出センサに係るものである。図 3は、本実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。本実施形態のピロリン酸検出センサ 3 4は、第 1の実施形態のピロリン酸検出センサ 3 1 とは、固定層 5 1が絶縁基板 2 2直上の全領域に形成されており、固定層 5 1 と試料液受容部 3 3 との全境界領域に H +難透過性膜 2 1が配されている点が異なるのみである。その他の構成は、第 1の実施形態のピロリン酸検出センサ 3 1 と同じなので、説明を省略する。

(第 3の実施形態）

本実施形態は、ピロリン酸検出センサに係るものである。図 4は、本実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。第 1の実施形態と異なる点は、 H +難透過性膜が膜小胞 7 1で形成されている点と、膜小胞 7 1である H +難透過性膜の固定されている位置である。以下、第 1の実施形態と異なる点のみ説明する。

膜小胞 7 1は H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1を有し、固定層 5 1内に固定されている。固定層 5 1は、例えばゲルの保持能によって膜小胞 7 1 を内部に固定し得る材料からなる。膜小胞 7 1 としては、細胞から単離された液胞から調製されたものを用いることができる。また、膜小胞 7 1 としては、人工的に形成した脂質二重層膜や L B膜などの水素イオンを通さない、あるいは通しにくい膜内に単離および精製した H +—ピロホスファターゼを内在するように再構築することによって形成されたものを用いてもよい。

膜小胞 7 1の膜には、 H +—ピロホスファタ一ゼ以外のタンパク質が含まれていてもよい。但し、これらのタンパク質は、ピロリン酸と反応しない、あるいは反応性の低いタンパク質であることが好ましい。すなわち、ピロリン酸が膜小胞 7 1の膜中にある H +—ピロホスファタ一ゼ以外のタンパク質と反応する場合、 H +—ピロホスファターゼと反応するピ口リン酸の量が減少し、それに伴って H +の輸送量が減少するからである。また、ピロリン酸とは反応せず、且つピロリン酸以外の物質との反応によって水素イオンを輸送するタンパク質が膜小胞 7 1の膜に含まれている場合、そのタンパク質が反応する物質が試料液 2 6中にほとんど含まれていないことが好ましい。例えば、具体的には、膜小胞 7 1の膜には、ピロリン酸とほとんど反応せず、且つ A T Pとの反応によって水素ィォンを輸送するタンパク質である A T P a s eが含まれている場合、試料液 2 6中に A T Pをほとんど含まないようにすることが好ましい。

ピ口リン酸検出センサ 3 5を用いて、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸を検出する方法及びその原理について説明する。まず、試料液 2 6 を試料液受容部 3 3に満たす。試料液 2 6中にピロリン酸が存在する場合、ピロリン酸は固定層 5 1に拡散される。そして、固定層 5 1に拡散されたピロリン酸は、 H +—ピロホスファ夕一ゼ 1 1の活性により、リン酸へと加水分解され、それに伴って膜小胞 7 1の内部液 2 4の水素ィォン濃度が上昇し、 H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1の周辺では、それに伴つて水素イオン濃度が減少する。 H +—ピロホスファターゼが水素イオン感受性電極 2 3のごく近傍に存在したとき、水素イオン濃度の減少が水素イオン感受性電極 2 3により測定され、試料液 2 6中のピロリン酸濃度を測定することができる。

(第 4の実施形態）

本実施形態は、ピロリン酸検出センサに係るものである。図 5は、本実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。ピロリン酸検出センサ 3 6は、第 2の実施形態とは、固定層の構成と、測定電極の構成が異なるのみである。以下、この点について説明する。測定電極は、絶縁基板 2 2上に形成された分極性電極 8 1からなる。分極性電極 8 1は、金、白金、カーボン等の通常の電気化学測定に使用できる電極で構成することができる。分極性電極 8 1には、非常に簡便な構成の電極を利用することができる。このことは、ピロリン酸検出センサの全体構成の簡便化に寄与する。さらに、本実施形態の場合、参照電極 2 7としては、標準水素電極、銀 Z塩化銀電極、飽和カロメル電極等に加え、金、白金、力一ボン等の電極も利用することができ、さらなるピロリン酸検出センサの全体構成の簡便化に寄与しうる。

分極性電極 8 1表面には、メデイエ一夕 8 2を含む固定層 8 3が形成されている。固定層 8 3としては、例えば一端にチオール基を持つ直鎖状炭素を利用した S A M膜 ( s e 1 f — a s s e m b 1 e d m o n o l a y e r ) などが利用できる。ただし、固定層 8 3は H +難透過性膜 2 1を固定可能な材質で形成されていればこれに限定されることなく、その保持能により H +難透過性膜 2 1 を固定するゲルで形成されていても良い。メデイエ一夕 8 2としては、水素イオン感受性物質の酸化体を使用することができる。このように形成された固定層 8 3上に H +—ピロホスファ夕一ゼを含む H +難透過性膜 2 1 を固定する。固定層 8 3に上述した S A M膜を利用した場合、チオール基の架橋反応により H +難透過性膜 2 1 を固定層 8 3上面に固定することができる。 H +難透過性膜 2 1が、脂質膜である場合、固定層 8 3および脂質膜の疎水性部分が対向し、脂質膜の親水性部分が膜表面を形成する。 H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1は固定層 8 3および脂質膜の疎水性部分が形成する膜の内部に固定されるが、このとき、 H +—ピロホスファターゼ 1 1のピロリン酸を加水分解する活性部位は、 H +難透過性膜 2 1の外部に露出している。

ピロリン酸検出センサ 3 6を用いて、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸を検出する方法及びその原理について説明する。まず、試料液 2 6 を試料液受容部 3 3に満たす。試料液 2 6中にピロリン酸が存在する場合、 H +—ピロホスファターゼ 1 1の活性により、ピロリン酸がリン酸へと加水分解され、それに伴って固定層 8 3内の水素イオン濃度が上昇する。このとき水素イオン感受性のメディェ一夕 8 2の酸化体が存在した場合、酸化還元反応によりメデイエ一夕 8 2の還元体が生成される。分極性電極 8 1にメデイエ一夕 8 2の酸化還元電位より十分に高い電位を加えておくことにより、メデイエ一夕 8 2の還元物質の濃度に応じた電流を測定することができる。よって、試料液 2 6中のピロリン酸の濃度を検出することが可能である。

(第 5の実施形態）

本実施形態は、ピロリン酸検出センサに係るものである。図 6は、本実施形態のピロリン酸検出センサの構成を模式的に示す断面図である。本実施形態のピロリン酸検出センサ 3 7の第 4の実施形態と異なる点は、 H +難透過性膜が膜小胞 7 1で形成されている点と、膜小胞 7 1である H +難透過性膜の固定されている位置と、固定層の構成である。以下、第 4の実施形態と異なる点のみ説明する。

膜小胞 7 1は H + —ピロホスファターゼ 1 1 を有し、固定層 9 1内に固定されている。固定層 9 1は、電解重合膜からなる。電解重合膜によつて膜小胞を固定する方法は、例えば重合前のモノマーと膜小胞 7 1を混合しておき、所定の電圧を加えることで形成できる。電解重合膜を形成する電解重合材料としては電気化学的に活性なものが選択でき、例えばポリ（ァニリン）、ポリ ( 0—フエ二レンジァミン) 、ポリ（N —メチルァ二リン）、ポリ（ピロール）、ポリ（N —メチルピロ一ル）、ポリ（チォフェン）等が使用できる。

ピロリン酸検出センサ 3 7を用いて、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸を検出する方法及びその原理について説明する。まず、試料液 2 6 を試料液受容部 3 3に満たす。試料液 2 6中にピロリン酸が存在する場合、ピロリン酸が固定層 9 1に拡散され、 H +—ピロホスファタ一ゼ 1 1 の活性により、ピロリン酸がリン酸へと加水分解される。ピロリン酸の加水分解に伴って内部液 2 4の水素イオン濃度が上昇し、 H + _ピロホスファターゼ 1 1の周辺では水素イオン濃度が減少する。この水素イオン濃度の変化により、固定層 9 1である電解重合膜の酸化還元反応が起こり、その電子移動を分極性電極 8 1で測定することによって、試料液 2 6中のピロリン酸濃度を検出することができる。

本発明にかかるピロリン酸検出センサにおいては、図 1を用いて説明した反応原理からわかるように、 H +—ピロホスファターゼを含む H +難透過性膜と測定電極（水素イオン感受性電極 2 3、分極性電極 8 1 ) との間に、水素イオンもしくは水素イオン感受性メディェ一夕の酸化体が、イオンの状態で存在しうる場が必要である。このような場として、バルクの水溶液を用いることも可能である。しかしながら、 H +難透過性膜と測定電極との間に、バルクの水溶液を存在させるためには、例えば特開平 6— 9 0 7 3 6号公報に示されているような、非常に複雑な工程を経て、センサを作製する必要がある。さらに、このように作製したセンサでは、一旦作製してしまうと水溶液中でしか保存することができず、例えばピロリン酸検出センサを D N A検出センサとして用いた場合、その取扱方法や保存方法も極めて特殊なものとなり、作製方法の複雑さも考慮すると、例えばディスポ一ザブル形式の臨床検査等の使用には適さない。一方、第 1〜第 5の実施形態のピロリン酸検出センサにおいては、上述した水素イオンもしくは水素イオン感受性メディェ一夕の酸化体が、イオンの状態で存在しうる場は、固定層からなる。かかる固定層は、例えば S A M膜や電解重合膜で形成することができ、比較的簡便な方法でセンサを作製することができる。また、高分子ゲルを固定層としたセンサでは、水分子を保持したまま保存することが可能であるので、取扱や保存が極めて簡便となる。その他の材料で固定層を形成する場合であつても、バルクの水溶液で前記場を構成する場合と比較して、取扱や保存が非常に簡便である。したがって、例えばデイスポーザブル形式の臨床検査等の使用にも適したものを構成することができる。さらに、固定層の厚さをできる限り薄くすることによって、水素イオン濃度の変化率を上げ、感度を向上させることも可能である。

以下、 H +—ピロホスファタ一ゼを用いたピロリン酸検出センサの他の構成例を示す。

<ピロリン酸検出センサの構成例 1 >

図 7は、ピロリン酸検出センサの一構成例を模式的に示す断面図である。第 1の実施形態とは、水素イオン感受性電極 2 3の周囲が内部液 2 4で満たされている点と、 H +難透過性膜 2 1が水素イオン感受性電極 2 3を覆うように絶縁基板 2 2上に固定されている点のみが異なる。以下、第 1の実施形態と異なる点のみ説明する。

H +難透過性膜 2 1の固定方法は、 H +難透過性膜 2 1が水素イオン感受性電極 2 3の表面をすベて覆っていればどのような方法でもよく、例えばリボソームを利用して S A M膜に転写する方法や、 L B法を用いることができる。 H +難透過性膜 2 1によって分離された溶液保持部 3 2 内の領域のうちの水素イオン感受性電極 2 3が含まれた領域には、内部液 2 4が満たされているようにする。

ピロリン酸検出センサ 3 8を用いて、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸を検出する方法及びその原理について説明する。まず、試料液 2 6 を試料液受容部 3 3に満たす。試料液 2 6にピロリン酸が含まれる場合、 H +—ピロホスファ夕一ゼ 1 1の活性により、ピロリン酸がリン酸へと加水分解され、それに伴って内部液 2 4内の水素イオン濃度が上昇する。それを、水素イオン感受性電極 2 3を用いて測定することによって、測定液 2 6中のピロリン酸濃度を検出することができる。

内部液 2 4は特に限定されないが、 H +難透過性膜 2 1において、ピ口リン酸の活性部位が水素イオン感受性電極 2 3側（内側）の領域に露出している H +—ピロホスファタ一ゼを含む場合、内部液 2 4のピロリン酸の濃度は、試料液 2 6のピロリン酸の濃度よりも低くしておくことが好ましく、内部液 2 4にはピロリン酸を含まないことが最も好ましい。このことによって、内部液 2 4から試料液 2 6への水素イオン輸送が減少あるいは停止し、試料液 2 6から内部液 2 4への水素イオンの輸送が優勢となって、内部液 2 4の水素イオンの濃度の変化が、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸によるものにほぼ限定される。従って、試料液 2 6中に含まれるピロリン酸の量を正確に見積もることができる。

くピロリン酸検出センサの構成例 2 >

図 8は、ピロリン酸検出センサの一構成例を模式的に示す断面図である。上述の構成例 1 とは、 H +難透過性膜 2 1の固定方法のみが異なる。以下、構成例 1 と異なる点のみ説明する。

本構成例のピロリン酸検出センサ 3 9の H +難透過性膜 2 1は、直鎖状炭素化合物 3 1を介して絶縁基板 2 2上に固定されている。

くピロリン酸検出センサの構成例 3 >

図 9は、ピロリン酸検出センサの一構成例を模式的に示す断面図である。上述の構成例 1 とは、 H ⁺難透過性膜 2 1の固定方法のみが異なる。以下、構成例 1 と異なる点のみ説明する。

本構成例のピロリン酸検出センサ 4 0の H +難透過性膜 2 1は、溶液保持部材 2 5に両端が固定されている。

くピロリン酸検出センサの構成例 4 >

図 1 0は、ピロリン酸検出センサの一構成例を模式的に示す断面図である。本構成例のピロリン酸検出センサ 4 1において、 H +難透過性膜 2 1は、絶縁基板 2 2に形成された貫通孔に固定されている。 H +難透過性膜 2 1の内側には水素イオン感受性電極 2 3が備えられ、外側には参照電極 2 7が備えられている。水素イオン感受性電極 2 3および参照電極 2 7は、絶縁基板 2 2上に形成されていてもよい。内部液 2 4および試料液 2 6は、それぞれ水素イオン感受性電極 2 3および参照電極 2 7に接しかつ H +難透過性膜 2 1に接し得る。 H +—ピロホスファターゼの方向性については、第 1の実施形態と同様である。貫通孔への H +難透過性膜 2 1の固定方法は、例えば、 L a n g m u i r— B 1 o d g e t t e法を応用した公知の方法によって行うことが可能である（吉岡書店、岡田泰伸編「新パッチクランプ実験技術法」 P . 2 1 4参照）。また、絶縁基板 2 2上への貫通孔およびゥエルの形成および絶縁基板 2 2 上への電極の形成方法は、例えばシリコン基板のエッチング等により行うことが可能である（特開 2 0 0 4— 1 2 2 1 5号公報参照）。

試料液 2 6中のピロリン酸の検出方法及びその原理は構成例 1 と同様であるので、説明を省略する。

(第 6の実施形態）

第 6の実施形態は、本発明に係るピロリン酸センサを用いて特定配列を持つ D N Aを検出する方法である。

本実施形態においては、まず、目的とする D N Aの配列に相補的な配列を持つ D N Aプローブ、 D N Aポリメラーゼ、デォキシヌクレオチドを含む反応系に試料が供せられる。ここで「反応系」とは、以下に説明するような一連の核酸伸長反応およびこのような反応が実施される場をいう。「反応系」には、一連の反応が実施されるのに必要な成分が存在する。「反応系」は、通常、上記成分が適切な溶媒（例えば、 T r i s 一 HC 1緩衝液、核酸伸長反応または核酸増幅反応で通常使用され得るいずれもの緩衝液（市販による入手可能なキット中の緩衝液を含む））中に溶解された溶液の形態で提供され得る。 DNAポリメラーゼは、市販により入手可能な、または当業者により調製可能な、任意の DNAポリメラ一ゼであり得る。好ましくは、 T a qポリメラ一ゼが使用され得るが、これに限定されない。デォキシヌクレオチドは、各デォキシヌクレオシド三リン酸（d NT Pとも称される：デォキシシトシン三リン酸、デォキシグァニン三リン酸、デォキシアデニン三リン酸、およびデォキシチミジン三リン酸を含む）であり得、通常、 DNA合成の直接の前駆物質として使用され得る物質である。これにより、 DNAプローブを伸長させ、ここでピロリン酸がこの DNAプローブの伸長反応に伴って生成される。この反応について、化学反応式 1を用いて説明する。

この DN Aプローブは目的の DN Aとハイブリダイズすると、反応系中に存在する D N Aポリメラーゼによって、反応系中の 1つのデォキシヌクレオチド（化学反応式 1中、 d NT P) を取り込んで伸長され、ピ口リン酸が 1つ生成される。

[化学反応式 1 ]

DNA _(n) + d NT P DNA _{(n + 1)} + P P i 化学反応式 1中、添え字の n + 1は、 nベースの D N Aプローブが n + 1ベースに伸長したことを示す。このようにして生成されたピロリン酸を、上述の各実施形態のピロリン酸検出センサを用いて検出することにより、試料液中の特定配列を持つ D N Aを検出することが可能である。具体的には、上述のいずれかのピロリン酸検出センサの試料液受容部 3 3にピロリン酸を含む前記試料液を満たす工程（ c ) 、ピロリン酸検出センサの測定手段により固定層の水素イオン濃度の変化を馕気化学的に測定する工程（d) 、工程（d) の測定結果に基づいて D N Aの伸長反応を検出する工程（ e) 、および工程（ e ) の検出結果に基づいて前記 DNAを検出する工程（ f ) を経て、特定配列を持つ D N Aを検出することができる。

本実施の形態で使用される DNAプローブは、検出を目的とされる D N Aの配列に対して相補的な配列を有するように設計される。この DN Aプロ一ブは、検出を目的とされる D N Aの配列とハイブリダィズした場合に、当該 D N Aプローブの伸長のためのプライマ一として働く。したがって、 DN Aプローブの長さは、伸長反応のためのプライマ一として働くのに十分な長さである。例えば、少なくとも 1 0塩基、少なくとも 1 2塩基、少なくとも 1 5塩基、少なくとも 2 0塩基、少なくとも 3 0塩基の長さであり得る。ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を十分に行い得、かつその調製の容易さを考慮すると、 2 0〜 2 5塩基の長さが好ましい。本発明の方法で使用される DNAプローブは、検出を目的とされる DN Aに特異的にハイブリダィズし、かつ当該 DNA プローブの伸長のためのプライマ一として働く限り、いずれの長さでもあり得る。

DN Aプローブは、試料液中の目的の D N Aと特異的にハイブリダイズし、かつプライマ一として働くため、検出しょうとする配列が既知である場合、この配列に対して完全に相補的である、すなわち、配列中の塩基に対して正確に対応する（A— Tまたは C一 Gペア）配列を有するように設計され得る。試料液中に目的の特定配列を有する DN Aが存在しない場合、当然のことながら D N Aプローブとのハイブリダィズは起こらない。したがって、本反応系を使用することにより、検出しようとする配列が既知または未知であるに関わらず、この D N Aプローブに完全に相補的である配列の存在を検出し得る。

ハィブリダイゼ一ションおよび伸長反応は、 D N Aのハイブリダイゼーシヨン、ならびに DN Aポリメラーゼの作用によるプライマーおよびデォキシヌクレオチドによる D N Aの伸長反応が行われる任意の条件下で実施され得る。 DNAプローブと目的 DNAとのハイブリダイゼーシヨンは、例えば、 S amb r o o kら（ 1 9 8 9) M o l e c u l a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y M a n u a l、第 2版、第 1〜 3巻、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r yなどの実験書に記載される方法によって行なわれ、本方法は当業者に公知である。

反応系中に含み得る DN Aプローブ、ポリメラ一ゼ、デォキシヌクレォチドの量は、当業者によって適宜決定され得る。

また、化学反応式 1に示すように、デォキシヌクレオチドが 1つ伸長する度にピロリン酸が 1つ生成されるので、目的の特定配列を持つ DN Aおよび D N Aプローブの両方の長さ（ベース）が既知であれば、目的の特定配列を持つ DN Aを定量的に検出することが可能である。

さらに、化学反応式 1の反応を P C R等の核酸増幅反応と置き換えることにより、試料中の目的の特定配列を持つ D N Aの量を飛躍的に増加させることができる。 P C R増幅の方法は、当該分野で周知である（P C R T e c h n o l o g y : P r i n c i l e s a n d A p p l i c a t i o n s f o r DNA Amp l i f i c a t i o n、 HA E r l i c h編、 F r e e m a n P r e s s、N e wY o r k、 NY( 1 9 9 2 ) ; P C R P r o t o c o l s ： A G u i d e t o M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s、 I n n i s、 G e l f l a n d、 S n i s k y、および Wh i t e編、 A c a d e m i c P r e s s、 S a n D i e g o , CA ( 1 9 9 0 ) ； M a t t i l aら（ 1 9 9 1 ) Nu c l e i c A c i d s R e s . 1 9 : 4 9 6 7 ； E c k e r t、 K. A. および Ku n k e l、 T. A. ( 1 9 9 1 ) P C R M e t h o d s a n d A p p l i c a t i o n s 1 : 1 7 ; P C R、 M c P h e r s o n、 Q u i r k e s、および T a y l o r、 I R L P r e s s、 O x f o r d) 。 P C R等の核酸増幅反応を用いることにより、極微量の D N Aの検出も可能である。

(第 7の実施形態）

本発明の第 7の実施形態は、本発明に係るピロリン酸検出センサを用いて測定系の D N Aの塩基種を判別する方法、より具体的には S NPを高速にタイピングする方法である。

第 7の実施形態について図 1 1および図 1 2を用いて説明する。図 1 1は、検出を目的とする DNAと D NAプロ一ブとにおいて S N P部位がー致した場合の反応系を示し、図 1 2は、検出を目的とする DNAと DN Aプローブとにおいて S N P部位が一致しない場合の反応系を示す。図 1 1および図 1 2中、 1は DNAプローブ、 2は目的の特定配列を持つ DNA、 3 aは一致した S NP部位、 3 bは一致しない S N P部位、 4は DNAポリメラーゼ、そして 5は d N T Pを表す。

本実施形態においては、まず、目的とする DNAの配列に相補的な配列を持ち、かつ 3 ' 末端が S N P部位である DNAプロ一ブ 1、 DNA ポリメラ一ゼ 4、デォキシヌクレオチド 5を含む反応系に試料が供せられる。これにより、 DNAプローブ 1が伸長され、ここでピロリン酸が、この DNAプロ一ブ 1の伸長反応に伴って生成される。

本実施形態で使用される D N Aプローブ 1は、目的の配列に相補的であり、かつ 3 ' 末端が S NP部位であるように設計され得る。本実施形態において、 DNAプローブ 1は、 3 ' 末端が S N P部位であることを除いては、上述の第 6の実施形態と同様に設計され得る。本実施形態において使用される D N Aポリメラーゼ 4およびデォキシヌクレオチド 5 は、上述の第 6の実施形態と同様であり得る。本実施の形態におけるハィプリダイゼ一ションおよび伸長の条件もまた、上述の第 6の実施形態と同様であり得る。なお、本実施の形態における D N Aプローブは、 S N P部位における塩基種のタイビングが可能であればどのようなものでもよく、上記により設計されたプロ一ブに限られるものではない。

試料液中の目的の DNA 2および DNAプロ一ブ 1の塩基配列が、 S N P部位も含めて完全に相補する場合、当該 DN Aプローブ 1は目的の D N A 2にハイブリダィズし、かつ当該プローブ 1のさらなる伸長のためのプライマーとして働く。この場合、図 1 1に示されるように、反応系中に存在する DNAポリメラ一ゼ 4によって、 DNAプローブ 1にデォキシヌクレオチド 5が 1つ伸長されて、ピロリン酸が 1つ生成される。一方、試料液中の目的の D N A 2および D N Aプローブ 1の塩基配列が、 S N P部位において相補的でない場合（たとえ他の部分において相補的であったとしても）、 DNAプローブ 1は、目的の DNA 2とハイブリダイズは行い得るが、 DNAプローブ 1の 3 ' 末端がミスマツチとなるため、当該プロ一ブ 1の伸長のためのプライマ一として働かない。この場合、図 1 2に示されるように、反応系中に DN Aポリメラ一ゼ 4および必要なデォキシヌクレオチド 5が存在しても、化学反応式 1の反応は起こらず、ピロリン酸は生成されない。

よって、 DNAの伸長反応後の試料液中のピロリン酸を、上述の各実施形態のピロリン酸検出センサを用いて検出することにより、試料液中の目的の特定配列を持つ D N A 2および D N Aプローブ 1は、 S N P部位も含め完全に一致していると判別できる。 S N P部位における多くとも 4種類のプローブ 1を用いれば、試料中の特定配列を持つ D N A 2の S N Pを 4種類の塩基についてタイビングすることが可能である。

なお、 S N P部位における塩基の種類が既知の場合、そのタイピングに必ずしも 4種類のプローブが必要でないことは言うまでもない。

D N Aの伸長反応後の試料液中のピロリン酸を、上述の各実施形態のピロリン酸検出センサを用いて検出することにより S N Pをタイピングする方法は、より具体的には、上述のいずれかのピロリン酸検出センサの試料液受容部 3 3にピロリン酸を含む前記試料液を満たす工程（ c )、ピロリン酸検出センサの測定手段により固定層の水素イオン濃度の変化を電気化学的に測定する工程（d ) 、工程（d ) の測定結果に基づいて D N Aの前記伸長反応を検出する工程（ e ) 、および工程（ e ) の検出結果に基づいて D N Aの塩基配列中の S N P部位の塩基種を判別するェ程（ f ) を有する。

本発明で使用される「試料液」とは、ピロリン酸を含み得るいずれの試料液をもいう。第 6及び第 7の実施形態においては、伸長反応によりピロリン酸が生成される D N Aを含み得る試料液である。特に D N Aの検出に関する方法（第 6又は第 7の実施形態）においては、「試料液」は、目的とする D N Aを含み得る任意の被分析物に由来し得る。このような被分析物は、目的とする D N Aが疾患と関連し得る場合、疾患によつて罹患された細胞、組織、器官、または血液であり得る。もちろん、本発明の方法は、臨床用途に限定されることなく、あらゆる分野において使用され得、従って、このような被分析物は、目的とする D N Aが発現しているかまたはその存在が確認されている細胞、組織、器官、または血液であり得る。 D N Aは、このような被分析物から、フエノ一ル抽出法およびアルコール沈殿のような常法を用いて抽出され得る。 D N A の純度は反応の効率に影響を与え得、 D N Aの精製の手順もまた当業者に公知である。

以上説明したように、本発明によれば、ピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が可能となるピロリン酸検出センサならびにこれを用いた拡散の検出方法および塩基種判別方法を提供する。また、本発明によれば、 DNAの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、試料中の目的 D N Aを標識することなく、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の S NPのタイピングを、高感度かつ高速に測定することが出来る。

(実施例 1 )

本実施例は、第 4の実施形態に係るピロリン酸検出センサを作製するものである。

まず、 S h i z u o Y o s h i d a等の方法（M a s a y o s h i M a e s h i m a a n d S h i z u o Y o s h i d a . ^ 1 9 8 9 ) J .B i o l .C h e m.2 6 4 ( 3 3 ) ,2 0 0 6 8— 2 0 0 7 3 ) に準じて、ヤエナリ由来の液胞膜 1 3からなる膜小胞を T r i s /M e s バッファー（濃度 5 mM、 p H 7. 0 ) 、 s o r b i t o l (濃度 0. 2 5 M) 、 D TT (濃度 2 mM) からなる溶液中に溶かし、 H +—ピロホスファターゼを含む液胞膜 1 3からなる膜小胞の懸濁液とした。

一方、金電極（分極性電極 8 1 ) を I mM n—オクタンチオール/ エタノール溶液中に浸漬し、室温で 4時間放置して、金電極表面にォクタンチオールの S AM膜（固定層 8 3 ) を形成した。次に、オクタンチオール修飾電極を 1 0 mMチォニン水溶液中に浸漬し、室温で 1時間静置して、 S AM膜間にチォニン（メディエー夕 8 2 ) を固定化した。

こうして作製したチォニン/ォクタンチオール修飾電極に、 H +—ピロホスファタ一ゼを含む膜小胞の懸濁液を滴下することによって、 H +—ピ口ホスファターゼを固定層 8 3表面に固定し、 H +—ピロホスファタ一ゼ電極を構成した。ピロリン酸ナトリウムの各終濃度がそれぞれ 2 0 μ Μ、 4 0 μΜ、 6 0 μΜ、 8 Ο μΜおよび 1 0 0 μ Μとなるようにピロリン酸ナトリウム溶液を Η +—ピロホスファターゼに接触させ、 Η +—ピ口ホスファタ一ゼによるピロリン酸の加水分解反応を開始した。

サンプル液中のピ口リン酸ナトリゥムの濃度と、参照電極 2 7 として銀/塩化銀電極を用い、 2 0 OmVの電位をかけたときの金電極の示した電流値は、ほぼ直線関係であるという結果が得られた。このことから、本方法によりピロリン酸の量を測定できることがわかった。

(実施例 2 )

本実施例は、第 1の実施形態にかかるピロリン酸検出センサを作製するものである。

まず、 M a s a s u k e Y o s h i d a等の方法（M a s a H.S a t o, M a s a h i k o K a s a h a r a, N o r i y u k i I s h i i , H a r u o H om a r e d a, H i d e o M a t s u i a n d M a s a s u k e Y o s h i d a. ( 1 9 9 4) J . B i o l . C h e m.2 6 9 ( 9 ) , 6 7 2 5— 6 7 2 8 ) に準じ、カポチヤの種から液胞膜 H +—ピロホスファターゼの精製を行なった。

一方、 0. 1 gポリビニルプチラル樹脂と 1 gへキサメチレンジアミンをジクロロメタンに溶解し、室温で 3 0分間撹拌した溶液を、 I S F ETのゲート電極（水素イオン感受性電極 2 3 ) に滴下した後、 5 %グルタルアルデヒドに浸漬し、室温で 2 4時間放置した。このようにして I S F E T電極上に固定層 5 1を形成した。そして、固定層 5 1が形成された I S F E T電極（修飾 I S F E T電極）を、 5 m g/m l の H + —ピロホスファターゼ溶液に浸漬し、 4°Cで 2 4時間静置し、 H +—ピロホスファタ一ゼを I S F E Tのゲート電極に固定した。この H +—ピロホスファ夕ーゼ固定 I S F E T電極に対してピロリン酸ナトリゥムの各終濃度がそれぞれ 2 0 μ Μ、 4 0 μΜ、 6 0 μ Μ、 8 0 μ Μおよび 1 0 0 μΜとなるようにピロリン酸ナトリゥム溶液を添加し、ピロリン酸の Η + 一ピロホスファタ一ゼによる加水分解反応を開始した。

サンプル液中のピロリン酸ナトリウムの濃度と、参照電極 2 7 として銀 Ζ塩化銀電極を用い、 Η +—ピロホスファタ一ゼ固定 I S F Ε Τ電極のソース一ドレイン間に 4. 0 Vの電圧をかけ、ソース一ドレイン間の電流値を 40 0 μ Aに保ったときのゲート電圧値は、ほぼ直線関係であるという結果が得られた。このことから、本方法によりピロリン酸の量を測定できることがわかった。

(実施例 3 )

本実施例は、第 5の実施形態のピロリン酸検出センサを作製するものである。

まず、上記実施例 2 と同様にカポチヤの種由来の液胞膜 H +—ピロホスファターゼを精製した。

次に、上述した液胞膜 H +—ピロホスファタ一ゼ 5 0 m g /m 1 と、 0. 1 Mのピロールと、 1 Mの塩化カリウムとを混合し、電解重合用混合液を得た。この電解重合用混合液に、分極性電極 8 1である白金電極と、参照電極 2 7として銀ノ塩化銀電極を浸漬し、白金電極に + 1 Vの定電圧を 6分間印加し、電解重合により H +—ピロホスファターゼ固定化ポリピロール膜修飾電極を得た。このようにして得られた H +—ピロホスファ夕ーゼ固定化ポリピロ一ル膜修飾電極に対してピロリン酸ナトリゥムの各終濃度がそれぞれ 2 Ο μ Μ、 4 0 μΜ、 6 0 μ Μ、 8 0 μΜおよび 1 0 0 μΜとなるようにピロリン酸ナトリウム溶液を添加し、ピロリン酸の Η +—ピロホスファ夕ーゼによる加水分解反応を開始した。

ピロリン酸ナトリゥムの濃度と、参照電極 2 7 として銀/塩化銀電極を用い、 3 0 O mVの電位をかけたときの Η +—ピロホスファタ一ゼ固定化ポリピロール膜修飾電極の示した電流は、ほぼ直線関係であるという結果が得られた。このことから、本方法によってピロリン酸の量を測定できることがわかった。

(実施例 4)

本実施例では、試料中における X DNA (λ D N Aの全塩基配列は、 G e n B a n kデ一夕ベースの A c c e s s i o n N o . V 0 0 6 3 6、 J 0 2 4 5 9 , M l 7 2 3 3、 X 0 0 9 0 6を参照）の検出を行なつた

まず、 λ D N Α (宝酒造（株）製）が 1 0 n g /μ Lの濃度で蒸留水中に溶解されている試料液 2 6 A、および蒸留水のみからなる試料液 2 6 Bを用意した。また、図 1 3 Aに示すように、 λ D NAの特定の塩基配列に完全にハイブリダィズし得る 2種類のプライマ一 C (配列番号： 1 ) およびプライマー D (配列番号： 2 ) をそれぞれ蒸留水に溶かしたプライマ一溶液 Εおよび F (いずれも 2 0 μ Μ) を用意した。

上記試料液 2 6 Αおよび 2 6 Βそれぞれに、 T a K a R a L a T a q ( 5 U/μ L、宝酒造（株）製）、 T a K a R a L a T a qの専用バッファーである 2 xG C b u f f e r I (宝酒造（株）製）、 d N T P m i x t u r e (各濃度 2. 5 mM、宝酒造（株）製）、ならびにプライマー溶液 Eおよび Fを添加して、図 1 3 Bに示す組成の P C R反応液 Gおよび Hを調製した。

次に、 P C R反応液 Gおよび Hのそれぞれについて、図 1 3 Cに示す反応温度条件で P C R反応を行なった。

P C R反応終了後、 P C R反応液 Gおよび Hのそれぞれを、上記実施例 1に記載の H +—ピロホスファターゼ電極を用いて、実施例 1 と同様に参照電極として銀/塩化銀電極を用い、 2 0 O mVの電位を印加して電流を測定したところ、じ 1 反応液0の方が、？〇反応液11ょりも明らかに電流値が大きかった。つまり、 01^反応液0では、プライマ一伸長反応が進行したことがわかる。従って、本方法により標的核酸の検出ができることがわかった。

(実施例 5 )

本実施例では、 λ D NAの塩基配列内におけるある塩基を人為的に他の塩基に置換した変異型 X D NAを作製し、通常の X D NAと変異 X D N Aとを判別できるか否かについて検討した。

まず、 λ D NA (宝酒造（株）製）（配列番号： 3 ) を用いて変異型 λ DNA (配列番号： 4) を作製した。変異型 λ DNAは、 λ DNA (以下、通常の λ D Ν Αのことを野性型 λ D Ν Αと記す）の二本鎖 DN A配列内に存在する G C塩基対（図中の領域 R ！) を当業者に周知の方法で人為的に AT塩基対（図中の領域 R ₂) に置換した。

次に、野性型 λ D N Aおよび変異型 λ D N Aのそれぞれを最終濃度 1

0 n g/μ Lとなるように蒸留水に溶解したものをそれぞれ野性型 λ D

Ν Α液および変異型 λ D Ν Α液とした。

次に、上記の塩基の違いを判別するために、図 1 4 Aに示すタイピンダプライマ一（配列番号： 5 ) を用意した。続いて、タイピングプライマーを最終濃度 2 0 μΜとなるように蒸留水に溶解したタイピンダプライマ一溶液を調製した。

なお、図 1 4 Αに示すタイピングプライマ一は、野性型 X DNAの下の段に記した一本鎖 DN Aに完全にハイブリダィズする。しかし、このタイピングプライマ一の 3 ' 末端の Gは、変異 λ D N Aの下の段に記した一本鎖 DN Aにハイブリダィズできない。従って、このタイピングプライマーを用いてプライマ一伸長反応を行なうと、野性型 λ DNAの場合は良好に反応が進行するが、変異 λ D Ν Αの場合は反応があまり進行しない。

また、上記実施例 4で用いたプライマー溶液 Fも用意した。

次に、野性型 λ D Ν Α液および変異型 λ D Ν Α液のそれぞれについて、 T a K a R a T a q ( 5 U/μ L 宝酒造（株）製）、および T a K a R a T a q専用の l O xP C R u f f e r (宝酒造（株）製）、および d NT P m i t u r e (各濃度 2. 5 mM、宝酒造（株）製）、およびタイピングプライマー溶液およびプライマー溶液 Fを用いて、図 1 4 Bに示す組成の P C R反応液 Iおよび Jを調製した。

そして、 P C R反応液 Iおよび Jにおいて、それぞれ図 1 4 Cに示す反応温度条件で P C R反応を行なった。 P C R反応終了後、各 P C R反応液を H +—ピロホスファタ一ゼを固定した修飾 I S F E T電極に導入した。修飾 I S F E T電極は、上記実施例 2で用いたものと同様である。

この修飾 I S F E T電極を用いて、実施例 2 と同様に参照電極として銀塩化銀電極を用い、 H +—ピロホスファターゼ固定 I S F E T電極のソース一ドレイン間に 4 . 0 Vの電圧をかけ、ソース一ドレイン間の電流値を 4 0 0 μ Aに保ったときのゲート電圧を測定したところ、 P C R 反応液 I の方が、 P C R反応液 Jよりも明らかに電圧値が大きかった。つまり、？じ反応液 1では、プライマ一伸長反応が進行したことがわかる。これは、反応液 Jでは伸長反応が起きなかったが、変異型 X D N Aを含む伸長反応液 Iでは d A T Pによる 1塩基伸長反応が起こり、その結果、生成されるピロリン酸が修飾 I S F E T電極上の H +—ピロホスファターゼと反応し、水素イオンが修飾 I S F E T電極側に輸送されたためと考えられる。

従って、本実施例によれば、 D N Aの特定の塩基配列中の 1塩基対の違いを判別できることがわかった。すなわち、本実施例は、本発明の方法が、 S N P部位の塩基種の判別、突然変異による 1塩基対の変異など、特定の塩基配列を判別するために非常に有効であることを示すものである。

上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び Z 又は機能の詳細を実質的に変更できる。

〔産業上の利用の可能性〕

本発明に係るピ口リン酸検出センサは、例えば S N P部位の塩基種の判別に利用することができ、従って S N Pタイピングに基づいた薬の投与といったテーラーメード医療に有用である。また、本発明に係るピロリン酸検出センサは、 D N Aの塩基配列中の突然変異の解析に有用であり、かかる解析結果を創薬や臨床に利用することができる。

さらに、本発明に係るピロリン酸検出センサは、特定の塩基配列を有する核酸の検出に利用することができ、核酸の検出は、遺伝病の診断、細菌およびウィルス等による食品の汚染検査、人体への感染検査に有用である。 [配列表のフリ一テキスト]

配列番号 1のく 223〉：プライマー

配列番号 2のく 223>：プライマー

配列番号 3のく 223〉：二本鎖 D N A

配列番号 4の〈223>：二本鎖 D N A

配列番号 5のく Π 3>：プライマー

Claims

請求の範囲

1 . 試料液中のピロリン酸を検出するピロリン酸検出センサであって、前記試料液を受容する試料液受容部と、

H +—ピロホスファタ一ゼを有する H +難透過性膜と、

前記 H +難透過性膜を固定する固定層と、

前記固定層の水素イオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する測定手段と、を備え、

前記 H +—ピホスファタ一ゼは、前記試料液中のピ口リン酸を加水分解し、これに伴って固定層の水素イオン濃度に変化をもたらすように配されている、ピロリン酸検出センサ。

2 . 前記固定層は、その上面又はその内部に H +難透過性膜を固定する、請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサ。

3 . 前記 H +難透過性膜は膜小胞であり、前記固定層は前記 H ⁺難透過性膜をその内部に固定する、請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサ。

4 . 前記測定手段は、前記固定層に接する水素イオン感受性電極と、前記試料液を受容した状態で前記試料液に接するように配された参照電極とを有する、請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサ。

5 . 前記測定手段は、前記水素イオン感受性電極と前記参照電極との電位差の変化を測定する、請求の範囲第 4項に記載のピロリン酸検出センサ。

6 . 前記固定層は高分子ゲルまたは自己組織化単分子膜からなる、請求の範囲第 4項に記載のピロリン酸検出センサ。

7 . 前記固定層は、水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じる材料を含み、

前記測定手段は、前記固定層に接する分極性電極と、前記試料液を受容した状態で前記試料液に接するように配された参照電極とを有する、請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサ。

8 . 前記測定手段は、前記分極性電極と前記参照電極との間の電流の変化を測定する、請求の範囲第 7項に記載のピロリン酸検出センサ。

9 . 前記固定層は、水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じるメディェ一タを含む高分子ゲルまたは自己組織化単分子膜からなり、その上面に前記 H +難透過性膜を固定する、請求の範囲第 7項に記載のピロリン酸検出センサ。

1 0 . 前記固定層は、水素イオン濃度の変化により酸化還元反応が生じる電解重合材料からなる、請求の範囲第 7項に記載のピロリン酸検出センサ。

1 1 . 請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサを用いる、特定の塩基配列を有する核酸の検出方法であって、該方法は以下の工程を包含する；

試料と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマ一と、ヌクレオチドとを含む試料液を調製する工程（ a )、前記試料液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（b) 、前記ピロリン酸検出センサの前記試料液受容部に前記試料液が受容された状態とする工程（c ) 、

前記ピロリン酸検出センサの前記測定手段により前記固定層の水素ィオン濃度変化に伴う電気化学的変化を測定する工程（d) 、

工程（d) の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ e ) 、および

工程（ e ) の検出結果に基づいて前記核酸を検出する工程（ f ) 。

1 2. 請求の範囲第 1項に記載のピロリン酸検出センサを用いる、核酸の塩基配列中の塩基種判別方法であって、該方法は以下の工程を包含する；

核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料液を調製する工程（ a )、前記試料液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（b) 、

前記ピロリン酸検出センサの前記試料液受容部に前記試料液が受容された状態とする工程（ c ) 、

工程（d) の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ e；) 、および

工程（ e ) の検出結果に基づいて前記核酸の塩基配列中の塩基種を判別する工程（ f ) 。