JP2008233050A - Dna分析方法および分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】dATP溶液容器106,dTTP溶液容器107,dGTP溶液容器108,dCTP溶液容器109のいずれかから供給されるdATPもしくはdTTPもしくはdGTPもしくはdCTPにより引き起こされるビーズ118表面に固定された二本鎖DNAの伸長反応を,二本鎖DNAの伸長反応により生成するピロリン酸を反応溶液容器105内の反応溶液に含まれている試薬と酵素によって酸化還元物質に変換し,生成した酸化還元物質が絶縁性分子を介して電気化学活性物質が固定された測定電極119の表面電位の変化を引き起こすことによって,測定電極119と電気的に接続された電界効果トランジスタ120のドレイン電流値の変化として計測する。
【選択図】図1
Description
生成したピロリン酸は,ピルビン酸に変換される。本反応は,PPDKにより触媒される。
生成したピルビン酸は,NADに変換される。本反応は,乳酸脱水素酵素により触媒される。
生成したNADは,電極表面に固定化されたPQQを酸化する。
この反応は平衡反応であり,PQQの酸化還元状態はNADとNADHの比に応じたものとなる。
そのため,次式が成立する。
[フェロセン(酸化)]:酸化型フェロセン濃度
[フェロセン(還元)]:還元型フェロセン濃度
[NAD]:NAD濃度
[NADH]:NADH濃度
電極の表面電位Eは,理論的には次のネルンストの式によって,電極表面に固定化された電気化学活性物質の酸化還元状態の比から求まる。
E0:標準酸化還元電位
R:気体定数
T:絶対温度
n:交換される電子数
F:ファラデー定数
[Red]:還元型電気化学活性物質濃度
[Ox]:酸化型電気化学活性物質濃度
式(2)に式(1)を代入すると,
となり,NADおよびNADH濃度に対するスロープ感度は,25℃において30mVと求まる。測定されたスロープ感度が理論値よりも小さかったのは,フェロセンとNADおよびNADHの間での酸化還元反応の反応速度が遅く,平衡状態に達していなかったためと考えられる。
そのため,次式が成立する。
となり,NADおよびNADH濃度に対するスロープ感度は,25℃において59mVと求まる。測定されたスロープ感度と理論値はほぼ等しく,PQQとNADおよびNADHの間での酸化還元反応の反応速度が十分に速く,電圧測定時には平衡状態に達していたと考えられる。このように,酸化還元物質に合せて電極表面に固定化する電気化学活性物質を選択することで,感度を向上させることができる。ピロリン酸を電気的に検出するための好適な組み合わせを以下に示す。
プライマーDNA: 3'- CACAC TCACA GTTTT CACTT -5'
サンプルDNA : 3'- GCATA CACTA AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
とした。dTTPの添加により,DNAポリメラーゼの働きによって一塩基の伸長反応が行われた。これは,サンプルDNAの3’末端から10番目の塩基がAであることによる。伸長反応に伴い生成されたピロリン酸は,
ピロリン酸 + フルクトシル6リン酸 → フルクトシル1,6ジリン酸 + リン酸
フルクトシル1,6ジリン酸 → グリセロアルデヒドリン酸 + ジヒドロキシアセトン
グリセロアルデヒドリン酸 + NAD + リン酸 → グリセレート1,3ジリン酸 + NADH
NADH + 2フェリシアニド → NAD + 2フェロシアニド
の反応によってフェリシアニドの還元によるフェロシアニドの生成を引き起こした。このフェロシアニドの生成は,電極の表面電位の変化を引き起こした。結果,図に示すように16.7mVの電圧の低下が観測された。次のdATPの添加により,一塩基の伸長反応が行われた。これは,サンプルDNAの3’末端から9番目の塩基がTであることによる。この伸長反応により,同様にして,15.1mVの電圧の低下が観測された。dGTPの添加により,溶液中に存在するdNTPはdATP,dTTP,dGTPとなり,サンプルDNAの3’末端の塩基Gを除く2番目から8番目の塩基配列CATACACの相補配列であるGTGTATGの伸長反応が行われた。この7塩基の伸長反応により,同様にして,23.8mVの電圧の低下が観測された。
伸長反応前:c0
dTTP添加後:c0+Δx
dATP添加後:c0+2×Δx
dGTP添加後:c0+9×Δx
である。そのため,それぞれの時点での電極表面に発生する電位は,
伸長反応前:E0−59 log(c0)
dTTP添加後:E0−59log(c0+Δx)
dATP添加後:E0−59log(c0+2×Δx)
dGTP添加後:E0−59log(c0+9×Δx)
である。従って,電位変化は,
dTTP添加:59log(c0+Δx)−59log(c0)
dATP添加:59log(c0+2×Δx)−59log(c0+Δx)
dGTP添加:59log(c0+9×Δx)−59log(c0+2×Δx)
である。フィッティングを行うと,Δx=0.83cのときに最適解が求まり,図11のようになった。実験結果をよく再現しており,それぞれのdNTPの添加時の二本鎖DNA伸長反応によって生成されたピロリン酸が,電位変化として検出されたことが分かる。
プライマーDNA: 3'- CACAC TCACA GTTTT CACTT -5'
サンプルDNA(野生型): 3'- GCATA CACTA AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
サンプルDNA(変異型): 3'- GCATA CACTG AAGTG AAAAC TGTGA GTGTG -5'
とし,プライマーDNAとサンプルDNA(野生型)もしくはプライマーDNAとサンプルDNA(変異型)の組み合わせで測定を行った。図12に示すように,プライマーDNAとサンプルDNA(野生型)の組み合わせでは,dCTPの添加では電圧の変化は1mV以下で,dTTPの添加で19.5mVの電圧減少が観測された。一方,プライマーDNAとサンプルDNA(変異型)の組み合わせでは,dCTPの添加で20.2mVの電圧減少が観測され,dTTPの添加では電圧の変化は1mV以下であった。この結果は,プライマーDNAとサンプルDNA(野生型)の組み合わせでは,dCTPの添加では伸長反応が起こらないが,dTTPの添加では伸長反応が起こること,そして,プライマーDNAとサンプルDNA(変異型)の組み合わせでは,dCTPの添加では伸長反応が起こるが,dTTPの添加では伸長反応が起こらないことを反映したものであり,このことを利用し,SNPsを検出することができる。
102…信号処理回路
103…データ処理装置
104…洗浄液容器
105…反応溶液容器
106…dATP溶液容器
107…dTTP溶液容器
108…dGTP溶液容器
109…dCTP溶液容器
110…洗浄液供給バルブ
111…反応溶液供給バルブ
112…dATP溶液供給バルブ
113…dTTP溶液供給バルブ
114…dGTP溶液供給バルブ
115…dCTP溶液供給バルブ
116…測定セル
117…セパレータ
118…ビーズ
119…測定電極
120…電界効果トランジスタ
121…参照電極
122…廃液容器
301…Xセレクタ
302…Yセレクタ
401,411,701…電位差計測装置
402,412,702…参照電極
403,413,704…測定セル
414,705…電気化学活性物質
415,706…絶縁性分子
404,416,707…測定溶液
405,417,708…金電極
703…試料溶液注入器
Claims (18)
- プローブとハイブリダイズした試料核酸を用意する工程と,
核酸基質とポリメラーゼを用いて前記プローブの伸長反応を行う工程と,
前記伸長反応で生じるピロリン酸を酸化還元物質に変換する工程と,
前記酸化還元物質を電気的に検出する検出工程と
を有するDNA分析方法。 - 請求項1記載のDNA分析方法において,前記検出工程では,試料核酸を含む液体に接する電極の界面電位の変化を検出することを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項2記載のDNA分析方法において,前記電極とゲート部が電気的に結合されている前記電極と同一基板上の電界効果トランジスタを用いて前記電極の界面電位の変化を検出することを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項2記載のDNA分析方法において,前記核酸基質は,デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)またはイオウを含有するその誘導体であることを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項2記載のDNA分析方法において,前記電極には絶縁性分子に結合した電気化学活性物質が固定されていることを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項5記載のDNA分析方法において,前記絶縁性分子が炭素鎖であることを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項5記載のDNA分析方法において,前記酸化還元物質は酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドであり,前記電気化学活性物質はキノン含有分子であることを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項5記載のDNA分析方法において,前記酸化還元物質は金属錯体であり,前記電気化学活性物質はフェロセン含有物質であることを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項5記載のDNA分析方法において,洗浄液による洗浄工程を有することを特徴とするDNA分析方法。
- 請求項9記載のDNA分析方法において,前記洗浄液は酸化還元物質を含むことを特徴とするDNA分析方法。
- 核酸が固定されており,もしくは核酸が固定された物体が内部に配置されており,液体が導入される容器と,
前記容器中に配置される液体に接触する測定電極と,
前記測定電極の表面に固定される,絶縁性分子に結合した電気化学活性物質と,
前記液体と接触する参照電極と,
前記測定電極の界面電位を測定する電位差計と,
dATPもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第1供給部と,
dGTPもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第2供給部と,
dCTPもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第3供給部と,
dTTPもしくはそのアナログ体を前記容器に供給する第4供給部とを備えることを特徴とするDNA分析システム。 - 請求項11記載のDNA分析システムにおいて,前記核酸が固定された物体が半径r比表面積Rのビーズであり,前記核酸は間隔dで固定化されていて,前記電位差計の酸化還元物質の測定下限濃度をClim,アボガドロ数をNAとしたときに,
r≦3RClim/{(6−π)d2NA}
の関係が成り立つことを特徴とするDNA分析システム。 - 請求項11記載のDNA分析システムにおいて,前記電位差計が電界効果トランジスタであることを特徴とするDNA分析システム。
- 請求項13記載のDNA分析システムにおいて,前記測定電極が複数あり,前記電界効果トランジスタが複数あり,前記測定電極と前記電界効果トランジスタが同一の基板に形成されていることを特徴とするDNA分析システム。
- 請求項11記載のDNA分析システムにおいて,前記電気化学活性物質はキノン含有分子であることを特徴とするDNA分析システム。
- 請求項11記載のDNA分析システムにおいて,前記電気化学活性物質はフェロセン含有物質であることを特徴とするDNA分析システム。
- 請求項11記載のDNA分析システムにおいて,前記容器中に洗浄液を供給する洗浄部を備えることを特徴とするDNA分析システム。
- 請求項17記載のDNA分析システムにおいて,前記洗浄液は酸化還元物質を含むことを特徴とするDNA分析システム。
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