WO2005073399A1 - リン酸イオンの定性・定量法およびリン酸イオンセンサ - Google Patents

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WO2005073399A1
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glucose
reaction
phosphate ion
ion
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Hideaki Nakamura
Masao Gotoh
Isao Karube
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors

Definitions

  • the present invention relates to a method for qualitatively determining phosphate ions and a phosphate ion sensor. More specifically, qualitative or quantitative qualitative or quantitative phosphate ion quantification using a mediator that utilizes electron transfer to electrochemically detect phosphate ions in a sample solution, and the phosphate used in the method It relates to an ion sensor.
  • a method for quantifying phosphate ions measurement methods such as an absorption spectrophotometry, a volumetric method, an atomic absorption method, a gravimetric method, and a biosensor method are known.
  • the spectrophotometric methods there are a molybdolinic acid method, a molybdenum blue method, a vanadomolybdophosphoric acid method and the like.
  • each reagent is reacted with phosphoric acid, and each reaction substance is irradiated with absorption light having a specific wavelength to measure the absorbance, and the phosphate ion content is measured from the results. is there.
  • the volumetric method is a method for measuring the content of phosphate ions by measuring the volume of a base having a known concentration up to the end point of the reaction, and includes neutralization titration and chelate titration.
  • the atomic absorption method is a method of precipitating phosphoric acid as ammonium molybdate, filtering this, dissolving it again, and quantifying molybdenum by atomic absorption.
  • the gravimetric method is a method in which magnesium is mixed in a magnesium mixed solution. This is a method in which magnesium and a precipitate are formed, followed by baking and weighing of MgP0.
  • Biosen This is an extremely excellent method for measuring phosphate ions using a bio-material such as bio-recognition elements, which are often used and have little impact on the environment. Therefore, many biosensors have been proposed so far. Research and development has also been conducted on a desktop automatic measuring device for phosphate ion measurement, and the results have been reported.
  • the first report was a phosphate ion sensor that combined alkaline phosphatase and gnorecosoxidase.
  • Glucose-6-phosphate + 3 ⁇ 40 Glucose + Pi (1) Gunorecose + 0,> Gunoreconic acid + 3 ⁇ 40 2 (2)
  • alkaline phosphatase reaction (1) Is done. The degree of this inhibition is determined as the amount of oxygen consumed in the glucose oxidase reaction (2).
  • These enzymes are immobilized on a platinum electrode using a membrane, and the phosphate ion concentration is determined from the oxygen consumption.
  • This sensor used Chlorella ik ⁇ , a kind of green algae, as a recognition element, and measured phosphate ions with a microbial sensor that combined this with an oxygen electrode.
  • This microbial sensor utilizes the fact that Chlorella vulgaris significantly increases the amount of oxygen generated by photosynthesis in the presence of phosphate ions.
  • Chlorella ik ⁇ is adsorbed and fixed on a light-permeable membrane on an oxygen electrode. When this electrode is combined with a reflective lamp and the amount of oxygen increase is measured electrochemically, it is based on the principle.
  • Plant-based methods include Solanum, which is rich in acid phosphatase.
  • phosphate ions are amplified using the alkaline phosphatase reaction to increase the sensitivity.Furthermore, phosphate ions can be highly sensitive by the flow injection analysis (FIA) method or a combination of the FIA method and the chemiluminescence method. Measurement is possible. Many sensors combining the reactions of (3) and (4) have been reported.
  • FIA flow injection analysis
  • a phosphate ion sensor using a pyruvate oxidase reaction, an electrode method, and a chemiluminescence method has also been proposed.
  • the reaction formula of pyruvate oxidase is as follows.
  • this enzyme reaction has the feature that only one type of enzyme contributes to the reaction.
  • an amperometric sensor using the electrode method measures the concentration of oxygen consumed in the pyruvate oxidase reaction (5) to measure the phosphate ion concentration.
  • an FIA-type enzyme sensor was developed, and this sensor was composed of a liquid feed pump and injector, an enzyme-immobilized column, a mixing joint, a chemiluminescence detector, and a recorder. ing.
  • pyruvate oxidase is immobilized on porous glass beads using a covalent bond method with glutaraldehyde, and this is packed in a column.
  • Luminol is used as a luminescent reagent and catalyzes the reaction as a luminescent reagent solution Peroxidase has been used.
  • the acid decreased by the enzymatic reaction. Since the method was limited to measuring the concentration of hydrogen or the concentration of generated hydrogen peroxide, the influence of the concentration of dissolved oxygen was inevitable. Furthermore, when measuring the oxygen concentration or the hydrogen peroxide concentration with electrodes, it is necessary to increase the setting of the applied voltage between the electrodes. There is a problem that the measurement is affected by reducing substances contained in such materials and that accurate measurement is difficult immediately. Similarly, by measuring the concentration of hydrogen peroxide by the chemiluminescence method of luminol, the sensor that measures the concentration of phosphate ions can also reduce the reducibility by using the chemiluminescence method, which has high sensitivity but low specificity. The effects of various contaminants such as the above substances cannot be avoided.
  • the lower limit of phosphate ion detection of this sensor was 10 ⁇ (O.OOlppm), which was sufficient sensitivity for environmental measurement.
  • this method since this method only measures hydrogen peroxide, it has a problem that it is easily affected by interfering substances. Also, using the FIA method made it difficult to carry a sensor.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 08-020401
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 05-093692 (Patent No. 2, 595, 141)
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-220085
  • Patent Document 4 JP-A-11-290096
  • Non-Patent Document l Talanta Vol. 50, 799-807 (1999)
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring a phosphate ion concentration capable of accurately measuring phosphate ions without being affected by the concentration of dissolved oxygen, salts, contaminants, and the like in a test sample solution, and
  • An object of the present invention is to provide a portable disposable type phosphate ion sensor used for the sensor.
  • An object of the present invention is to (1) react a phosphate ion with a substrate that becomes an oxide in the presence of an oxidoreductase that catalyzes a reaction for producing the oxide; To measure the current generated by further oxidizing the reduced mediator generated by the coexistence of the type mediator, or (2) reacting the phosphate ion with the phosphate ion to finally produce ⁇ _D-gnorecos
  • the resulting substrate is reacted in the presence of an enzyme that catalyzes each of the reactions for producing ⁇ _D-gnorecose to produce ⁇ -D-gnorecose, and the resulting ⁇ -D-glucose is
  • a method of measuring the current generated by reacting with an oxidized mediator in the presence of an oxidoreductase and further oxidizing the generated reduced mediator and (3) providing a working electrode and a counter electrode on a substrate.
  • these enzymes Contact and reagent is accomplished the working electrode and / or One by phosphate
  • a large output value can be obtained as compared with, for example, the hydrogen peroxide system, without being affected by contaminants, salt, or dissolved oxygen in the sample solution. It is possible to accurately measure various substances to be measured, including phosphate ions.
  • the method (1) of the present invention uses a simple enzyme reaction system, Since the number of enzymes used is small, it is possible to easily manufacture and use the sensor, which is advantageous in terms of manufacturing and operation costs. Further, it is possible to construct a sensor having high reproducibility.
  • a portable (on-site monitoring) disposable type phosphate ion sensor is provided. Furthermore, in the methods (1) and (2) of the present invention, when a substrate other than a phosphate ion is sufficiently present, the acid phosphatase activity can be measured, and the method can be used for the detection of a prostate tumor marker. .
  • an enzyme-catalyzed reaction occurs in the presence of a phosphate ion, a substrate that produces an oxide, an oxidoreductase, other substances required for the reaction, and an oxidized mediator.
  • Phosphorus ions in the sample solution are measured by generating reduced media from phosphoric acid, oxidizing this, and measuring the resulting oxidation current.
  • Examples of the catalytic reaction system that produces an oxide include those represented by the above formula (5).
  • potassium ferricyanide As the mediator, potassium ferricyanide, phlegmene, parabenzoquinone and the like are used.
  • potassium ferricyanide K Fe (CN) When potassium ferricyanide K Fe (CN) is used as a mediator
  • the reaction with pyruvic acid and the like proceeds as follows.
  • the ferrocyan ion generated at this time is oxidized at the working electrode to generate an oxidation current.
  • hydroquinone is produced by the reaction between pyruvate and parabenzoquinone in the presence of pyruvate oxidase, and hydroquinone produced at this time is produced. Is oxidized at the working electrode, and an oxidation current is generated. Hydroquinone> Parabenzoquinone + 2H + + 2e— (8)
  • Pyruvate is oxidized in the presence of an enzyme such as pyruvate oxidase to produce acetylphosphoric acid, and H0 generated at that time is oxidized on the working electrode, and the oxidation current value at that time is measured.
  • the method of indirectly determining the phosphate ion concentration is as described in the prior art. However, this method cannot accurately measure the concentration of phosphoric acid when the test solution contains interfering substances such as seawater. However, when the media is used together with pyruvate oxidase or the like, it is possible to accurately measure the phosphate concentration without being affected by interfering substances.
  • a sensor for the measurement of phosphate ions, a sensor in which a working electrode and a counter electrode, and a reference electrode as necessary, are provided on a substrate, and enzymes and reagents required for the measurement are arranged on and / or in the vicinity of the working electrode is preferable.
  • sensors include, for example, platinum, gold, and the like by screen printing, vapor deposition, sputtering, etc. on an insulating substrate such as ceramics, glass, plastic, paper, and biodegradable materials (for example, microbial polyester).
  • a biosensor using a ready-made mediator such as glucose oxidase (EC 1.1.3.4 ⁇ ), glucose dehydrogenase (EC 1.1.1.47, 1.1.1.118, 1.1. 1.119, 1.1.99.10.)
  • oxidoreductases and mediators such as quinoline quinone glucose dehydrogenase with pyro-mouth, blood lactate sensor, and gnorecose sensor for food.
  • Gnoretest PRO R using glucose oxidase and potassium ferricyanide
  • Arkray products using glucose dehydrogenase and potassium ferricyanide
  • Gnoretest Neo using glucose dehydrogenase and potassium ferricyanide
  • Araray products and freestyle (pyro-mouth quinoline), products of TheraSense Quinnongoleose Dehydro Genase and osdumium complex
  • a blood lactate sensor Kyoto Daiichi Kagaku's Ratate® Pro (using lactate oxidase and ferricyanide)
  • glucose sensor an N ⁇ K product Darcosometer GM1000 (foodstuff).
  • Glucose oxidase and potassium ferricyanide can be used as it is. That is, qualitative and quantitative determination of phosphate ions can be easily performed by using a mediator, an electrode, and the like provided in a commercially available blood glucose sensor. However, in this case, it is necessary to previously erase glucose in the sample solution using glucose oxidase or glucose dehydrogenase.
  • the blood glucose sensor is intended to measure gnorecose, and in general, each electrode made of platinum, gold, carbon, or the like is formed on the insulating substrate as described above.
  • An oxidoreductase and a mediator such as gnorecos oxidase and glucose dehydrogenase are arranged on and near the extreme.
  • Commercially available blood glucose sensors are easy to carry because the sensor itself is stored in a package free from the effects of moisture, light, etc., and the electrode surface in the reaction detection section of the sensor is protected by a reagent layer. Therefore, when it is used, a new feature of the biosensor is that it can be easily measured without choosing a place.
  • the blood glucose sensor selectively measures dalcos, which is slightly dissolved in blood rich in contaminants (whole blood), and is an enzyme with excellent substrate specificity.
  • the catalytic reaction is advanced using a protease or glucose dehydrogenase, It is a mechanism that transmits generated electrons to the electrode via an electron mediator (Med), and dissolved oxygen that is slightly dissolved in blood compared to conventional dissolved oxygen and glucose sensors that measure hydrogen peroxide. It has excellent characteristics that it is not affected by harmful substances, interfering substances and salt (0.9% NaCl).
  • the normal electrode is used as a biosensor.
  • the power that required some treatment to clean the electrode surface and remove the oxide film is not necessary if a blood glucose sensor sold in recent years is used. And very convenient.
  • a commercially available blood glucose sensor is composed of a combination of a disposable type biosensor (blood glucose sensor) main body and a measuring device for processing an electric signal from the blood glucose sensor.
  • a portable blood glucose sensor is usually a disposable type, in which two or three electrodes patterned with a conductive material are arranged on a flat substrate, and an enzyme is mainly placed on the electrode surface of the part that forms the detection part. And mediators have been deployed.
  • the blood glucose sensor is connected to a measuring instrument, and a blood sample or the like is introduced into the sample inlet detection unit of the blood glucose sensor, so that an enzymatic reaction starts.
  • concentration of gnorecose in the sample solution can be measured.
  • the glucose measurement range of the blood glucose sensor is approximately 2 mM to 30 mM.
  • some blood glucose sensors require a small amount of sample liquid of 0.3 / il, and others require a measurement time of only 5 seconds.
  • phosphate ions can be measured while maintaining the same performance as that of the sensor.
  • the biosensor can be effectively applied to phosphate ion detection, and by using these features, for example, It also enables rapid detection of SNPs in a very limited sample solution, as described below.
  • the presence of a sufficient amount of a substrate such as a phosphate ion enables measurement of pyruvate oxidase activity.
  • Such a blood glucose sensor includes pyruvate oxidase 0.1 desalted as required. 100 L; preferably 0.2 to 20 U, each having a final concentration of sodium pyruvate 1 to 5000 mM, preferably 50 to 1000 mM, magnesium ion 0.1 to 100 mM, preferably 1 to 50 mM, FAD 0 to 1000 ⁇ , preferably 1 Phosphoric acid measurement of 5 ⁇ 1 of 5 ⁇ 1 of a reagent mixed solution dissolved in lOOmM sodium citrate buffer solution so that ⁇ 7.0, 50 ⁇ , ⁇ 1-5000 ⁇ , preferably 100 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇
  • an electrochemical analyzer BAS ALS701
  • electrochemical measurement methods such as cyclic voltammetry, potential step chronoamperometry, and coulo
  • reaction 500 mV / sec, preferably 10 100 mV / sec, initial potential 0 V, maximum negative potential ⁇ 11 V, preferably ⁇ 0.5-0 V, maximum positive potential +0.1 +1 V, preferably +0.15 +0.7 V, reaction ( This is performed by confirming the response of pyruvate oxidase to the reduced mediator generated by the catalytic reaction of the phosphate ion of pyruvate oxidase for a period of 0 to 20 minutes, preferably 0 to 10 minutes.
  • the biosensor is attached to a measurement device, and an electric value generated in the biosensor is measured.
  • This measuring device is provided with a measuring unit for measuring an electric value of the electrode of the biosensor, and a display unit for displaying the measured value.
  • a measuring method in this measuring unit a potential step chronoammeterometry method, a coulometry method, a voltammetry method, or the like can be used as described above.
  • this device may be provided with a memory for storing the measured values.
  • wireless means for transmitting measurement data to the measuring unit of the biosensor preferably a non-contact IC card or short-range wireless communication (for example, Bluetooth; registered trademark) Wireless means can be mounted.
  • the concentration of phosphate ions in environmental waters such as freshwater and seawater is extremely low as compared with urine (about 20 mM) and food ( ⁇ 20 mM), etc. 0.06—0.6 a M Pi, even in the case of eutrophic lake waters, more than 20 ⁇ M Pi.
  • a pyruvate oxidase system and a (2) substrate amplification reaction system shown below highly sensitive measurement of a target substance can be performed.
  • reaction (5) in the presence of Pi and magnesium ion, flavin adenine dinucleotide, thiamine pyrophosphate, pyruvate and oxidized media, the action of pyruvate oxidase causes one of the products to produce A certain acetylphosphoric acid is produced, and acetic acid and Pi are produced by reaction (9).
  • the phosphate ion to be measured is phosphorylated by the first-stage reaction to a decomposed product of one of the substrates, and then regenerated by the next reaction, and the original first-stage reaction It becomes a substrate for the reaction. Since this reaction is repeated, it is also called a cycling reaction.
  • pyrophosphate ions can be detected by combining the catalytic reactions of the following (1) and (2) with the catalytic reactions of the phosphate ion detection system.
  • DNA ligase (EC6.5.1.1.6.5.1.2) system; ATP + TTT III> IIIIII ⁇ + PPi + AMP (11)
  • the single-stranded DNA on the long chain side is the target of SNP detection, and the SNP (mutant And Hata) are included.
  • Adenosine 5 which is a donor of energy necessary for ligation was obtained by forming two types of complementary single-stranded DNA (primers) on the sequence as shown on the left side.
  • ATP '-triphosphate
  • DNA ligase known as a ligation enzyme, causes the reaction to proceed to the right-hand side.
  • the two primers hybridize complementarily to the ⁇ -end of the single-stranded DNA on the long side so that the 5'-end and the 3'-end are linked on the base sequence to be measured.
  • the 5 / -end of the primer must be phosphorylated.
  • SNP can be detected by measuring the pyrophosphate ion generated by this reaction by the above method.
  • the DNA ligase reaction does not proceed in this case.
  • the method is opposite to the above method by changing the base sequence complementary to one SNP portion of the two primers, that is, the type of 3'-terminal base.
  • a DNA ligase reaction can be allowed to proceed in the case of a wild type.
  • T4 DNA ligase or Escherichia coli ligase is suitable as the DNA ligase used in the SNP detection reaction.
  • the single-stranded DNA on the long chain side is the target of SNP detection, and SNP (mutant and Yes; Hata) is included.
  • SNP mutant and Yes; Hata
  • a single-stranded DNA primer complementary to the sequence from the 5'-end of the long chain to one base before the base sequence of the SNP was hybridized with the long chain as shown on the left side, and the deoxy substrate was used.
  • dNTP ribonucleotide 5'-triphosphate
  • the reaction proceeds to the right side.
  • SNP can be detected by measuring the pyrophosphate ion generated by this reaction by the above method.
  • the DNA polymerase reaction will not proceed in this case.
  • the base sequence complementary to the SNP portion of the primer that is, the type of the base at the ⁇ -terminal is changed, so that the DNA polymerase can be The reaction can also proceed.
  • the DNA polymerase used in the SNP detection reaction includes Klenow DNA polymerase (DNA polymerase I large fragment) and T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, preferably Klenow DNA polymerase that has lost 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity. Is preferred.
  • the single-stranded DNA on the long side is the target of SNP detection, and the SNP (mutant and Yes; Hata) is included.
  • SNP mutant and Yes; Hata
  • DNA polymerase is allowed to act in the presence of the substrate dNTPs.
  • the reaction proceeds to the right side.
  • SNP can be detected by measuring the pyrophosphate ion generated by this reaction according to the method described above.
  • the DNA polymerase reaction does not proceed in this case.
  • the nucleotide sequence complementary to the SNP portion of the primer i.e., by changing the type of the base at the ⁇ -terminal, as opposed to the above method, in the case of wild type
  • the DNA polymerase reaction can proceed.
  • the amount of measurement is smaller than that of the reaction system (12) by increasing the length of the base sequence between the SNP site and the 3'-end of the single-stranded DNA on the long side, which is the measurement target
  • the feature is that many pyrophosphate ions can be generated from the target DNA.
  • Klenow DNA polymerase and T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, preferably 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity were removed as in the case of reaction system (12). Clenot DNA polymerase is preferred.
  • the DNA polymerase reaction does not proceed in this case.
  • SNP SNP is detected by this method
  • the nucleotide sequence complementary to the SNP portion of the primer that is, by changing the type of the base at the ⁇ -terminal, conversely to the above method
  • the DNA can be detected in the case of the wild type.
  • the polymerase reaction can also proceed.
  • the base sequence between the SNP site and the 3'-end of the single-stranded DNA on the long strand side to be measured is lengthened, so that the amount of the measurement target is smaller than in the reaction system (12). It has the characteristic that many pyrophosphate ions can be generated from DNA.
  • Klenow DNA polymerase and T4 DNA polymerase, T7 DNA polymerase, preferably endonuclease activity and 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity are used as in the case of the reaction system (12). Removed Klenow DNA polymerase is preferred.
  • DNA polymerase system random primer method
  • random primer + i l l
  • reaction equation (15) is a reaction in which a plurality of primers each having a random base sequence are hybridized with a single-stranded DNA to be measured.
  • reaction formula (16) a completely double-stranded DNA is synthesized by ligating a primer partially hybridized to the single-stranded genome to be measured with a DNA polymerase. At this time, dNTPs are incorporated as a constituent material of the DNA chain, and pyrophosphate ions are generated.
  • Suitable DNA polymerases used in this reaction system include E.
  • this method can detect viruses with single-stranded RNA in the genome, including the use of reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) and DNA random primers, dNTPs, or RNA polymerase (EC 2.7.7.6 ⁇ ). This is possible by using RNA random primers and NTPs.
  • reverse transcriptase RNA-dependent DNA polymerase
  • dNTPs DNA random primers
  • RNA polymerase EC 2.7.7.6 ⁇
  • DNA polymerase (exonuclease 814)
  • the above reaction system (17)-(19) is suitable for detecting viruses and bacteria having double-stranded DNA in the genome.
  • countless cuts (nicks) are formed on the double-stranded DNA by the use of DNase.
  • DNase I the nick is entered only in the single-stranded portion of the double-stranded DNA, so that the double-strand is not cut.
  • the reaction formula (18) the nick entered on the double-stranded DNA is recognized by the DNA polymerase, and the exonuclease activity of the DNA polymerase causes several tens of bases around the nick to be recognized. Is deleted.
  • the double-stranded DNA is restored to its original state by the polymerase activity of the enzyme.
  • DNase I EC 3.1.21.1
  • DNA polymerase I derived from Escherichia coli is preferred as the DNA polymerase.
  • the double-stranded genome can be detected by the random primer method by forming a single strand by heat denaturation or alkali denaturation. According to this method, it is possible to detect a virus having a double-stranded RNA in the genome.
  • phosphate ion reaction system pyrophosphate ion reaction system
  • these reaction systems are applied to the biosensor of the present invention as a series of biologically-related reactions involving phosphate ions such as nucleic acids and pyrophosphate ions. It is possible to do.
  • nucleic acid sequences (pi-mouth sequence method, etc.), nucleic acid amplification reaction (PCR), rolling circle amplification (RAC), SDA, standard displacement amplification, NASBA (nucleic acid sequence base amplification) ) Method
  • monitoring the behavior of the receptor such as the behavior of G protein that generates pyrophosphate ions by consuming GTP
  • the activity of enzymes in which phosphate and pyrophosphate ions participate in the catalytic reaction are also possible.
  • the enzyme used is crudely purified or dissolved in a suspension containing phosphate, pretreatment such as desalting by ultrafiltration and purification by column chromatography is performed. It is desirable.
  • phosphate is not present in the reaction detection part of a commercially available blood glucose sensor.
  • an enzyme-catalyzed reaction is caused by the presence of a phosphate ion, and a substrate and an enzyme, an oxidized mediator and a gnorecosoxidase, which finally generate ⁇ _D-gnorecose Measurement of phosphate ions in a sample solution by generating a reduced mediator from phosphoric acid, oxidizing this, and measuring the resulting oxidation current. You can also. If glucose is present in the sample solution, it is necessary to erase gnorecosse in the sample solution in advance by using glucose oxidase or the like. The following are examples of the group of catalytic reaction systems that finally produce ⁇ -D-gnorecose.
  • sucrose phosphorylase EC 2.4.1.7.
  • gnorecose isomerase EC 5.3.1.18.
  • hydroquinone is generated by the reaction of glucose and parabenzoquinone in the presence of GOD, and the hydroquinone generated at this time is generated at the working electrode. It is oxidized and generates an oxidation current, and its value is measured.
  • ⁇ _D-glucose is oxidized in the presence of an enzyme by the action of glucose oxidase or the like to produce dalconolatatone, and the H0 generated at that time is oxidized on the working electrode.
  • the method of indirectly obtaining the glucose concentration by measuring the oxidation current value of the oxidized gas is as described in the prior art.
  • the mediator is used together with glucose oxidase or the like, it becomes possible to accurately measure the phosphate concentration without being affected by interfering substances.
  • a sensor in which a working electrode and a counter electrode, a reference electrode is further provided as necessary, and an enzyme and a reagent required for the measurement are arranged on the working electrode is preferably used.
  • the above-described sensor is used.
  • an off-the-shelf blood glucose sensor or a food-grade glucose sensor can be used, and a commercially available one can be used as such.
  • the blood glucose sensor and the glucose sensor the above-mentioned commercial products and the like can be used as they are.
  • a blood glucose sensor is connected to a measuring instrument, and a blood sample or the like is introduced from the sample introduction port of the blood glucose sensor into the inside of the detection unit.
  • the enzyme reaction is started, and after a predetermined time, the glucose concentration in the sample solution can be measured by electrochemical measurement.
  • phosphate ions in the same concentration range as this sensor can be measured.
  • phosphoric acid contained in blood, urine, food, etc. can be used for ON measurement.
  • maltose phosphorylase ⁇ and mutarotase or sucrose phosphorylase and glucose isomerase are dissolved in a buffer at 0.01 to 100U, preferably 0.1 to 20U, respectively.
  • a buffer at 0.01 to 100U, preferably 0.1 to 20U, respectively.
  • This is mixed well with a phosphoric acid measurement sample solution and a substrate solution other than phosphoric acid of 25 nmole or more, preferably 125 nmole 5 ⁇ mol, that is, maltose or scroll solution, and then introduced into a blood glucose sensor, and accurately mixed with 0 to 20 nm.
  • an electrochemical measurement method such as a cyclic voltammetry method and a potential step
  • a cyclic voltammetry method Sweep speed 1 500 mV / sec, preferably 10 100 mV / sec, initial potential 0 V, maximum negative potential -11 0 V, preferably -0.5 0 V, maximum positive potential +0.1-+1 V, preferably +0.15 It is performed by confirming the response to glucose in +0.7 V, reaction (standby) time 20 minutes, preferably 0 to 10 minutes.
  • the above-described biosensor is attached to a measurement device, and an electric value generated in the biosensor is measured.
  • the method is as described above.
  • maltose phosphorylase-phosphatase [acid phosphatase (EC 3.1.3.2.) or alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1.)] system;
  • the amplification reaction can proceed even with the presence of a very small amount of phosphate ions, and highly sensitive detection of phosphate ions can be achieved. It becomes possible.
  • the presence of a substrate other than phosphate ions at a concentration of 10 mM or more, preferably 50 2000 mM enables measurement of blood acid phosphatase activity, which is a tumor marker for prostate.
  • Sucrose phosphorylase-phosphatase (acid phosphatase or alkaline phosphatase) mutarotase system;
  • maltose phosphorylase-phosphatase (acid phosphatase or alkaline phosphatase) -mutalotase system; Pi + maltose>
  • sucrose phosphorylase-phosphatase (acid phosphatase or alkaline phosphatase) -mutalota-zegnorecose isomerase system;
  • reaction system Two types of reaction system in the complex reaction system (i) One (ii) reaction system is a combination of (7) simple reaction system and (8) substrate amplification reaction system, It is possible to detect phosphate ions with higher sensitivity than the substrate amplification reaction system.
  • pyrophosphate ions can be detected by combining the catalytic reaction of the phosphate ion detection system of the above (7)-(9) with the catalytic reaction of the following expression (10).
  • Two platinum foils of lmm width are arranged in parallel on an insulating plastic substrate (7mm x 22mm) with a 0.5mm interval, and glucose oxidase and A glucose-containing sample solution (pH 7.0, 100 mM sodium citrate buffer solution) is caused to reach the working electrode by capillary action on a biosensor provided with potassium ferricyanide, and an electrical signal for glucose in the sample solution is converted to a biosensor.
  • Detection was performed using an electrochemical analyzer (ALS701 manufactured by BAS) controlled by a PC via a dedicated connector connected to the sensor terminal.
  • Cyclic voltammetry was used as the electrochemical measurement method, and the response to glucose was confirmed at a sweep rate of 50 mV / sec, an initial potential of 0 V, a maximum potential of +0.7 V, and a reaction (standby) time of 60 seconds.
  • a current value peak peculiar to the mediator appeared around +0.2 V.
  • the peak value is almost proportional to the glucose concentration as shown in FIG. 1, indicating that this biosensor is suitable for the practice according to the present invention in which the measurement range for glucose is wide.
  • reaction reagent I 200 units of pyruvate oxidase (from Aerococcus pyridans) are 250 ⁇ l of reaction reagent I in ice-cooled, pH 7.0, lOOmM sodium citrate buffer solution containing 40 mM magnesium ion and 48 ⁇ FAD was dissolved.
  • reaction reagent solution a solution prepared by dissolving 800 mM sodium pyruvate and 0.96 mM TPP in a 250 / i 1 pH 7.0, 100 mM sodium citrate buffer solution under ice-cooling was used.
  • a pH 7.0, 100 mM sodium citrate buffer solution containing 400 mM potassium dihydrogen phosphate was prepared and used.
  • the measurement was performed by thoroughly mixing 2.5 ⁇ L of Reaction Reagent I containing 2 units of pyruvate oxidase, 2.5 ⁇ L of Reaction Reagent II, and 5 ⁇ l of the measurement sample solution. This was introduced into a blood glucose sensor and reacted for exactly 3 minutes, and then phosphate ions were measured by cyclic voltammetry under the same conditions as when measuring glucose.
  • Example 1 no TPP was used.
  • Example 1 FAD was not used.
  • Example 1 the force that magnesium ions were not used was used.
  • Example 1 as a measurement sample solution, a 100 mM sodium citrate buffer solution having a pH of 7.0 and containing no 100 mM potassium dihydrogen phosphate was used.
  • the response of this biosensor to phosphate ion was not obtained except for the case where FAD was not included as a component of the reaction reagent solution.
  • FAD was omitted
  • the response was approximately half that of the response to phosphate ions obtained with the normal reagent composition. This is considered to be because pyruvate oxidase originally had FAD, and the pyruvate oxidase used during the purification process contained FAD that was released during the purification process. From the above, it was confirmed that the pyruvate oxidase system requires magnesium ion, FAD, and TPP.
  • a reaction reagent solution containing 400 mM potassium dihydrogen phosphate, 400 mM sodium pyruvate and a predetermined concentration of TPP was added to 250 ⁇ l of a 100 mM lOOmM sodium citrate buffer solution in ice-cooled pH 7.0, respectively. Mix well in 2.5 ⁇ increments, introduce this mixture into the blood glucose sensor, After reacting for 10 minutes, the current value was measured by cyclic voltammetry under the same conditions as in the measurement of
  • reaction reagent solution I used in Example 2 pH 7.0, 100 mM lOOmM sodium citrate buffer solution in ice cold, 400 mM potassium dihydrogen phosphate, 0.48 mM TPP and sodium pyruvate at a predetermined concentration
  • reaction reagent solution I pH 7.0, 100 mM lOOmM sodium citrate buffer solution in ice cold, 400 mM potassium dihydrogen phosphate, 0.48 mM TPP and sodium pyruvate at a predetermined concentration
  • cyclic voltammetry was performed under the same conditions as when measuring glucose. The current value was measured by one method.
  • a phosphate ion dissolved in environmental water was measured using a pyruvate oxidase reaction system.
  • the reaction reagent solution I and the reaction reagent solution II used in Example 1 were used, and the measurement sample solution was adjusted so that the concentration of potassium dihydrogen phosphate added was 5, 10, 15, and 20 mM.
  • the one dissolved in water was used.
  • Environmental water was collected from Japanese gardens, cascades and reservoirs on the Tokyo Institute of Technology site.
  • the pH of the environmental water was 7.65, 7.64, 7.93, respectively, and the phosphate ion concentration was 0.073 ⁇ , 0.67 ⁇ , 5.4 ⁇ M (based on JISJIS0102: molybdenum blue absorption spectrophotometry by reduction of ascorbic acid).
  • the sensor response to a pH 7.0, 100 mM sodium citrate buffer solution and a solution obtained by adding 25 mM phosphate ion thereto was determined as a value of a calibration curve.
  • Response of each added environmental water was applied to the calibration curve to determine the phosphate ion concentration in each environmental water.
  • the phosphate ion concentration in each environmental water was determined, and the value was used as the value determined by the conventional method.
  • Two platinum foils of lmm width are arranged in parallel on an insulating plastic substrate (7mm x 22mm) with a spacing of 0.5mm, and glucose oxidase and A biosensor provided with potassium ferricyanide is supplied with 2.5 ⁇ l of a 20 mM sodium citrate buffer solution (pH 6.5, containing a predetermined concentration of dulcose) by capillary action to reach the top of the working electrode.
  • the signal was detected using a PC controlled electrochemical analyzer (ALS701) via a dedicated connector connected to the terminal of the biosensor.
  • Cyclic voltammetry was used as the electrochemical measurement method, and the response to glucose was confirmed at a sweep rate of 50 mV / sec, an initial potential of 0 V, a maximum potential of +0.7 V, and a reaction (standby) time of 60 seconds.
  • a current value peculiar to the mediator appeared at around +0.2 V.
  • the peak value is almost proportional to the glucose concentration as shown in FIG. 9, and this biosensor is suitable for the practice according to the present invention in which the measurement range for glucose is wide. I got it.
  • maltose phosphorylase zymotarotase system was applied to the biosensor used in Reference Example 2, and the response to phosphate ion concentration was examined.
  • Maltose phosphorylase derived from ratatobacillus brevis
  • mutarotase derived from pig kidney
  • glucose oxidase derived from Aspergillus niger
  • glucose oxidase is pre-arranged in the biosensor as described in Reference Example 2, since the biosensor used varies depending on the lot, this glucose oxidase is used to ensure reproducibility. It was decided to use it after the examples.
  • As a substrate solution the strength of a buffer solution containing 400 mM maltose at pH 6.5 and 20 mM sodium citrate was used. A 20 mM sodium citrate buffer, pH 6.5, containing potassium dihydrogenate was used. Next, a mixture of 2.5 ⁇ 1 of the solution containing each enzyme, 2.5 ⁇ l of the substrate solution, and 5 ⁇ 1 of the test sample solution was introduced into the biosensor and allowed to react for exactly 3 minutes. The current was measured by cyclic voltammetry under the same conditions.
  • Example 8 acid phosphatase (derived from potato) was used in place of mutarotase in the same amount of activity, and the reaction time was changed to 10 minutes, and the current value was measured. The response of the system to phosphate ion concentration in the (i) maltose phosphorylase-acid phosphatase system was examined.
  • acid phosphatase was used instead of alkaline phosphatase because glucose oxidase is optimal under weakly acidic conditions.
  • Example 9 no acid phosphatase was used. As a result, the response of this biosensor to various concentrations of phosphate ions was about 15 ⁇ A. Since this value is equal to the sensor response value in the absence of phosphate ions, it was confirmed that the glucose oxidase reaction did not proceed with maltose phosphorylase alone, even if a sufficient amount of substrate was present for the reaction. Was.
  • the (9) complex reaction system (i) maltose phosphorylase-acid phosphatase-mutalotase system was applied to a blood glucose sensor, and the relationship between pH and sensor response was examined with the phosphate ion concentration kept constant.
  • the maltose phosphorylase, mutarotase, and glucose used in Example 8 were used.
  • Lucose oxidase and the acid phosphatase used in Example 9 were subjected to desalting using an ultrafiltration filter with a molecular weight cut off of 10,000, followed by ice-cold pH 6.5, 20 mM quencher. It was dissolved in a sodium acid buffer solution to have a concentration of 0.4 ⁇ 3 ⁇ 4 / ⁇ 1.
  • a pH 6.5, 20 mM sodium citrate buffer solution containing 400 mM maltose was used as a substrate solution.
  • a pH 4.0 phthalate buffer solution containing ImM potassium dihydrogen phosphate and each ⁇ were used as a measurement sample solution.
  • 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 0.2 M Tris-maleate buffer solutions were used, respectively.
  • a well-mixed solution of 2.5 ⁇ l of the solution containing each enzyme, 2.5 ⁇ l of the substrate solution, and 5 ⁇ l of the measurement sample solution was introduced into the biosensor, allowed to react for 10 minutes, and then subjected to cyclic voltammetry. The current value was measured.
  • Example 10 a ⁇ 6.5, 20 mM sodium citrate buffer solution containing 2 mM potassium dihydrogen phosphate was used as a measurement sample solution, and a current value was measured when the reaction was performed for a predetermined time. The relationship between the reaction time and the sensor response in the experiment was investigated.
  • Example 10 the substrate solution was a pH 6.5, 20 mM sodium citrate buffer containing 400 mM potassium dihydrogen phosphate.
  • Example 8 the acid phosphatase used in Example 9 was used in addition to maltose phosphorylase, mutarotase, and glucose oxidase, and the current value was measured by changing the reaction time to 10 minutes.
  • sucrose phosphorylase derived from Luconostock mescentroides
  • Example 14 pH 6.5, 20 mM sodium citrate buffer containing 400 mM potassium dihydrogen phosphate was used as the substrate solution.
  • the measurement sample solution was pH 6.5, 20 mM sodium citrate buffer containing sucrose at a predetermined concentration. was used to examine the response to sucrose concentration.
  • Example 13 a solution in which the following substances were dissolved in ultrapure water was used as a measurement sample liquid.
  • Example 16 a biosensor in which a reagent layer containing a mediator on the biosensor was washed away with water was used.
  • Example 13 a solution in which the following substances were dissolved in ultrapure water was used as a measurement sample liquid, and the influence of contaminants contained in environmental water, foods, body fluids, and the like on the sensor response was measured. I checked the sound.
  • the aforementioned (8) substrate amplification reaction system (i) maltose phosphorylase-acid phosphatase system was applied to the biosensor used in Reference Example 2, and the substrates maltose and phosphorus The relationship between the acid phosphatase activity and the sensor response value was examined under the condition that the acid ion was sufficiently present.
  • Maltose phosphorylase and glucose oxidase that had been desalted in the same manner as in Example 8 were dissolved in a 20 mM sodium citrate buffer solution (pH 6.5, ice-cooled) at a concentration of 0.4 unit // l.
  • a buffer solution containing 400 mM maltose and 400 mM potassium dihydrogen phosphate, pH 6.5, 20 mM sodium citrate was used.
  • An acidic solution subjected to desalting treatment in the same manner as in Example 9 was used.
  • Phosphatase dissolved in a 20 mM sodium citrate buffer solution (pH 6.5, ice-cooled) to a predetermined concentration was used.
  • Example 8 a measurement sample solution containing 2.5 ⁇ l of a 20 mM sodium citrate buffer solution containing a predetermined concentration of pyrophosphate ion at a pH of 6.5 and a desalted inorganic pyrophosphatase (derived from Pan yeast) was used as a measurement sample solution. A mixture of 2.5 ⁇ L dissolved in 20 mM sodium citrate buffer solution at pH 6.5 to give a unit / ⁇ and reacted for 5 minutes is used. The above (10) inorganic pyrophosphatase-based The response to pyrophosphate ion concentration was examined.
  • Example 19 as a measurement sample solution, pH 6.5 containing 10 mM pyrophosphate ion, 10 mM ATP or 10 mM dNTPs, 2.5 ⁇ l of 20 mM sodium citrate buffer solution, and 0.4 unit // il of desalted inorganic pyrophosphatase were used. As described above, 2.5 / 1 dissolved in 20 mM sodium citrate buffer solution with ⁇ 6.5 was mixed and reacted for 5 minutes.
  • Phosphate ions can be measured without being affected by interfering substances, and can be effectively used in various fields such as environmental measurement, medicine, and food.
  • a sensor for measuring phosphate ions in environmental water can be manufactured.
  • portable SNP diagnosis and ultra-high sensitivity virus can be performed. It can be used effectively for detection.
  • the activity of acid phosphatase can be measured, and application to diagnosis by detecting a tumor marker in the prostate is also possible.
  • FIG. 1 is a graph showing the response of a blood glucose sensor to gnorecose.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the necessity of TPP, FAD and magnesium ions in a pyruvate oxidase system.
  • FIG. 3 is a graph showing the responsiveness of the present biosensor to TPP in a pyruvate oxidase system.
  • FIG. 4 is a graph showing the response of the present biosensor to pyruvate in a pyruvate oxidase system.
  • FIG. 5 is a graph showing the response of the present biosensor to pyruvate oxidase activity in a pyruvate oxidase system.
  • FIG. 6 is a graph showing the response of the present biosensor to phosphate ions in a pyruvate oxidase system.
  • FIG. 7 Graphs showing the comparison of this biosensor with the conventional method in the pyruvate oxidase system (a) Japanese garden, b) Cascade reservoir)
  • FIG. 8 is a graph showing the response of the present biosensor to pH in a pyruvate oxidase monoacid phosphatase system, which is a substrate amplification reaction system.
  • FIG. 9 is a graph showing the responsiveness of a blood glucose sensor to gnorecose.
  • FIG. 10 is a graph showing the responsiveness of the present biosensor to phosphate ions in a simple reaction (maltose phosphorylase mutarotase) system.
  • FIG. 11 is a graph showing the response to phosphate ions in a substrate amplification reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase) system.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of the biosensor pH on the complex reaction (maltose phosphorylase acid phosphatase mutarotase) system.
  • FIG. 13 is a graph showing the relationship between the reaction time in a complex reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase mutarotase) system and the responsiveness of the present biosensor.
  • FIG. 14 is a graph showing the responsiveness of the present biosensor to maltose in a complex reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase-mutalotase) system.
  • FIG. 15 is a graph showing the responsiveness of the present biosensor to phosphate ions in a complex reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase-mutarotase) system.
  • FIG. 16 is a graph showing the response of the present biosensor to phosphate ions in a substrate amplification reaction (sucrose phosphorylase-acid phosphatase-mutarotase) system.
  • FIG. 17 is a graph showing the response of the present biosensor to sucrose in a substrate amplification reaction (sucrose phosphorylase-acid phosphatase-mutarotase) system.
  • FIG. 18 is a graph showing the effect of acetaminophen of the present biosensor on a complex reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase mutarotase) system.
  • FIG. 20 is a graph showing the influence of various contaminants of the present biosensor on the complex reaction (maltose phosphorylase-acid phosphatase mutarotase) system.
  • FIG. 23 is a graph showing the responsiveness of the present biosensor to ATP and dNTP in an inorganic pyrophosphatase system.

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Abstract

　(1)リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、酸化物を生成するような基質と酸化還元酵素、その他反応に必要とされる物質および酸化型メディエーターを用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンを測定する方法または(2)リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して最終的にβ-D-グルコースを生成する基質と、このβ-D-グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素の存在下で反応させてβ-D-グルコースを生成させ、さらに生成したβ-D-グルコースを、酸化還元酵素の存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定する方法および(3)基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、これらの酵素および試薬が作用極上および／またはその付近に配置されたリン酸イオンセンサ。

Description

明 細 書
リン酸イオンの定性 ·定量法およびリン酸イオンセンサ
技術分野
[0001] 本発明は、リン酸イオンの定性'定量法およびリン酸イオンセンサに関する。さらに 詳しくは、電子伝達を利用するメディエーターを使用し、試料液中のリン酸イオンを電 気化学的に検出し、定性または定量可能なリン酸イオンの定性'定量法およびそれ に用いられるリン酸イオンセンサに関する。
背景技術
[0002] 従来、リン酸イオンの定量法としては、吸光光度法、容量法、原子吸光法、重量法 、バイオセンサ法等の測定方法が知られている。吸光光度法の中には、モリブドリン 酸法、モリブデンブルー法、バナドモリブドリン酸法等がある。これらの測定法は、各 試薬をリン酸に反応させた後、それぞれの反応物質に特有な波長の吸収光を照射し て吸光度を測り、その結果からリン酸イオンの含有量を測定する方法である。また、 容量法は、反応の終点まで濃度既知の塩基をカ卩えその容量を測定することにより、リ ン酸イオンの含有量を測定する方法であって、中和滴定ゃキレート滴定等がある。さ らに、原子吸光法は、ー且リン酸をモリブデン酸アンモニゥムとして沈澱させ、これを ろ過し、再び溶解させてモリブデンを原子吸光で定量する方法であり、重量法は、マ グネシァ混液中でマグネシウムと沈澱を生じさせた後、焼成して Mg P 0を秤量する 方法である。
[0003] しかしながら、上記吸光光度法では、測定物質の固有波長に近似した波長を有す る他の物質の影響を受けるため、正確な測定値を得られ難いという不具合がある。一 方、容量法、原子吸光法、重量法などは正確な定量を行えるが、操作に熟練を要す るため使用者の制限があり、さらに携帯ができないため、オンサイトモニタリング (現場 測定)など、現場での簡便かつ迅速な測定が不可能であるという不具合がある。さら に、上記のいずれの方法も、リン酸イオンを測定するための化学反応に重金属イオン など、環境に負荷を与える物質を使用するという問題点があった。
[0004] こうした問題を解決するために、ノくィォセンサが注目されるようになった。バイオセン サを使用するリン酸イオンの測定には、材料として生体認識素子など、生体由来の材 料が多く使用され、環境への影響が少ないため、極めて優れた方法であるといえる。 そのために、これまで多くのバイオセンサが提案されている。そして、リン酸イオン計 測用の卓上型自動計測装置も研究開発され、その成果が報告されている。
[0005] バイオセンサ法によるリン酸イオンの定量法には、これまでに多くの報告がある。ま ず、最初に報告されたのはアルカリホスファタ ゼとグノレコースォキシダーゼを組み 合わせたリン酸イオンセンサである。
^" ti
グルコース- 6-リン酸 + ¾0 グルコース + Pi (1) グノレコース + 0, > グノレコン酸 + ¾02 (2) この酵素反応系では、試料液中のリン酸イオンによってアルカリホスファターゼ反応 (1)力 S阻害される。この阻害の度合レ、が、グルコースォキシダーゼ反応 (2)で消費され る酸素量として求められる。これらの酵素は、白金電極上に膜を使用して固定化され ており、酸素消費量からリン酸イオン濃度が求められる。
[0006] その後、微細藻類や植物を用レ、るリン酸イオン計測用バイオセンサが提案された。
このセンサは、緑藻類の一種である Chlorella ik ^を認識素子として用レ、、これと 酸素電極を組み合わせた微生物センサによりリン酸イオン計測を行った。この微生物 センサは、 Chlorella vulgarisがリン酸イオンの存在下で、光合成による酸素発生量が 著しく増加することを利用したものであり、 Chlorella ik ^を酸素電極上の光透過 性膜に吸着固定し、この電極と反射ランプとを組み合わせ、酸素増加量を電気化学 的に測定するとレ、う原理に基づレヽてレ、る。
[0007] また、植物を利用した方法としては、酸件ホスファターゼを多く含む Solanum
tuberosumの組織切片にグルコースォキシダーゼを加え、リン酸イオンによる阻害作 用の原理を利用してリン酸イオン濃度を電気化学的に計測するセンサシステムとした ものがある。さらに、同じ原理で酸性ホスファターゼ反応の阻害を利用した方法力 ジ ャガイモの組織切片を用いて行われてレ、る。
[0008] 一方、ヌクレオシドホスフオリラーゼとキサンチンォキシダーゼ反応を組み合わせた 酵素センサの開発も広く行われている。
Pi + イノシン リボース- i -リン酸 + ヒポキサンチン （3) ヒポキサンチン + 202 > 尿酸 + 2¾02 (4) これらの酵素反応系を用いた最初のセンサは、 2つの酵素反応 (3)、（4)によって生成 した過酸化水素を電極で測定して、リン酸イオン濃度を計測するものである。
[0009] 尿酸と過酸化水素の 2つの反応生成物を同時に測定するセンサも提案され、高感 度化に成功した。さらに、アルカリホスファターゼ反応を用いて、リン酸イオンを増幅し て高感度化を図り、またフローインジェクション分析 (FIA)法によって、あるいは FIA法 と化学発光法を組み合わせて、それぞれリン酸イオンを高感度に計測可能としている 。このように (3)と (4)の反応を組み合わせた多くのセンサが報告されている。
[0010] ピルビン酸ォキシダーゼ反応と電極法、化学発光法を利用したリン酸イオンセンサ も提案されており、ピルビン酸ォキシダーゼの反応式は以下の如くである。
Pi + ピルビン酸 + ¾0 + 02 > ァセチルリン酸 + C02 + H202 (5)
FAD, TPP, Mg2* この酵素反応ではこれまで開発されたセンサとは異なり、 1種類の酵素のみが反応に 寄与する特徴を有している。しかし、電極法を用いた電流測定型センサは、ピルビン 酸ォキシダーゼ反応 (5)で消費された酸素の濃度を測定して、リン酸イオン濃度を計 測している。
[0011] 次に化学発光法に着目し、 FIA型酵素センサの開発が行われ、このセンサは送液 ポンプとインジェクター、酵素固定化カラム、ミキシングジョイント、化学発光検出部、 レコーダ一力ら構成されている。このセンサでは、ピルビン酸ォキシダーゼをグルタル アルデヒドによる共有結合法を用いて多孔性ガラスビーズに固定化し、これをカラム に充填しており、発光試薬液としては発光体としてルミノールと、その反応を触媒する ペルォキシダーゼとが使用されている。
[0012] し力しながら、リン酸イオン測定用バイオセンサでは、酵素反応によって減少する酸 素濃度または生成する過酸化水素濃度を測定する方式に限られていたため、溶存 酸素濃度の影響が避けられない。さらに、酸素濃度または過酸化水素濃度を電極で 計る場合には、電極間の印加電圧の設定を高くする必要があり、印加電圧を上げる ことは、例えば夾雑物質を多く含む環境水や食品、体液などに含まれる還元性の物 質の影響を受けやすぐ正確な測定を困難にするという問題がみられる。同様に、過 酸化水素濃度をルミノールの化学発光法により測定することで、リン酸イオン濃度を 測定するセンサにおいても、高感度ではあるが特異性に劣る化学発光法を用いるこ とにより、還元性の物質などを始めとする種々の夾雑物質の影響を避けることができ ない。
[0013] さらに、測定感度および得られる信号の再現性を向上させるために、使用する酵素 をカラム内に充填したビーズに多量に固定化する必要があり、その固定化に煩雑な 操作と酵素の扱いについての熟練を要するなどの問題があった。
[0014] 以上で述べたリン酸イオンの測定法およびリン酸イオンセンサは全て、試料液中の 夾雑物質および溶存酸素の影響が避けられず、さらに測定には家庭用の電源を要 すること、装置が持ち運びできないこと、使い捨て型でないために、カラムや電極表 面に固定化した酵素は繰り返しの使用に耐え得る程度の安定性が要求されていたこ となど、共通した多くの問題点を有している。
[0015] 最近になって、新しい酵素反応系を用いる化学発光と FIAシステムを組み合わせた リン酸イオン計測用バイオセンサが提案された。この反応系では、マルトースとリン酸 イオンを基質とするマルトースホスフオリラーゼ反応から始まり、その生成物である α -D-グルコースはムタロターゼによって β -D-グルコースになり、グルコースォキシダ ーゼ反応によって過酸化水素を生成するので、過酸化水素を含む接触液にペルォ キシダーゼ/ルミノール系検出試薬を混合して生ずる化学発光の発光量を測定して 、リン酸イオン濃度を測定している。このセンサのリン酸イオンの検出下限は 10ηΜ ( O.OOlppm)であり、環境計測には十分な感度であった。しかるに、あくまで過酸化水 素を測定するものであるため、妨害物質の影響を受けやすいといった問題点があつ た。また、 FIA法を用いているため、センサを携帯することは難しかった。
[0016] 特許文献 1 :特公平 08 - 020401号公報 特許文献 2 :特開平 05— 093692号公報 (特許第 2, 595, 141号公報） 特許文献 3：特開平 09 - 220085号公報
特許文献 4：特開平 11 - 290096号公報
非特許文献 l : Talanta第 50卷，第 799— 807頁（1999年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0017] 本発明の目的は、被検査試料液中の溶存酸素濃度や塩分、夾雑物質等の影響を 受けることなぐリン酸イオンを正確に測定することが可能なリン酸イオン濃度の測定 法およびそれに用いられる携帯可能な使い捨てタイプのリン酸イオンセンサを提供 することにある。
課題を解決するための手段
[0018] かかる本発明の目的は、（1)リン酸イオンと反応して酸化物となる基質とこの酸化物 を生成するための反応を触媒する酸化還元酵素の存在下で反応させるに際し、酸化 型メディエーターを共存させることにより生じた還元型メディエーターをさらに酸化す ることにより生じた電流を測定する方法または (2)リン酸イオンを、リン酸イオンと反応し て最終的に β _D-グノレコースを生成する基質と、この β _D-グノレコースを生成するた めの各反応を触媒する酵素の存在下で反応させて β -D-グノレコースを生成させ、さ らに生成した β -D-グルコースを、酸化還元酵素の存在下で酸化型メディエーターと 反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定 する方法および (3)基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、これらの酵素お よび試薬が作用極上および/またはその付近に配置されたリン酸イオンセンサよつ て達成される。
発明の効果
[0019] 本発明方法により、メディエーターを用いることで、試料液中の夾雑物質、塩分や 溶存酸素の影響を受けず、例えば前記過酸化水素系に比べて大きな出力値を得る ことができるので、リン酸イオンを始めとする種々の測定対象物質を正確に測定する ことが可能となる。また、本発明方法 (1)では単純な酵素反応系を用いているため、使 用する酵素の数が少なぐ簡便にセンサを製造'使用することが可能であり、製造 ·操 作コスト的にも有利である。さらに繰り返し再現性の高いセンサの構築も可能となる。
[0020] また、オンサイトモニタリングを実現する使い捨てバイオセンサに本発明方法を応用 することにより、携帯可能 (on-site monitoring)な使い捨てタイプのリン酸イオンセンサ が提供される。さらに、本発明方法 (1)および (2)において、リン酸イオン以外の基質を 十分に存在させた場合には、酸性ホスファターゼ活性が測定可能であり、前立腺の 腫瘍マーカーの検出に用いることもできる。 発明を実施するための最良の形態
[0021] 本発明方法 (1)においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、酸 化物を生成するような基質と酸化還元酵素、その他反応に必要とされる物質および 酸化型メディ ターを用い、リン酸から還元型メディ ターを発生させ、さらにこ れを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンが測定さ れる。
[0022] 酸化物を生成するような触媒反応系としては、例えば前記式 (5)に示されるようなも のが挙げられる。
(1)ピルビン酸ォキシダーゼ系
Pi + ピルビン酸 + ¾0 + 02 > ァセチルリン酸 + C02 + ¾02 (5)
FAD, TPP, Mg2+ この反応は、リン酸イオンを酸化還元酵素であるピルビン酸ォキシダーゼと基質であ るピルビン酸、補酵素としてのフラビンアデニンジヌクレオチド (FAD)、チアミンピロリン 酸 (TPP)および活性化剤としてのマグネシウムイオンの存在下で反応させるものであ る。ここで反応に際し、電子伝達体としての酸化型メディ ターを共存させると、還 元型メディ ターが発生するため、この還元型メディ ターをさらに酸化すること により生じた電流を測定することで基質であるリン酸イオンの定性 ·定量が可能となる
[0023] メディ ターとしては、フェリシアン化カリウム、フエ口セン、パラべンゾキノンなどが 用いられる。メディ ターとして、フェリシアン化カリウム K Fe(CN)を用いた場合に は、ピルビン酸等との反応は次のように進行する。
" if
Pi +ピルビン酸 + 2Fe (CN) 6 + H20 >
FAD, TPP, Mg2*
ァセチルリン酸 + 2Fe (CN) 6 + 2H+ + C02 (6) この際発生したフエロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。
2Fe (CN) 6 > 2Fe (CN) —— + 2e" (7)
[0024] また、メディ ターとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラべンゾキノンを用い た場合には、ピルビン酸ォキシダーゼ存在下でのピルビン酸とパラべンゾキノンとの 反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化 電流を生ずるのでその値が測定される。 ヒドロキノン > パラべンゾキノン + 2H+ + 2e— (8)
[0025] ピルビン酸がピルビン酸ォキシダーゼ等の酵素の存在下で酸化されてァセチルリン 酸を生成させ、そのとき発生する H 0を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を 測定することにより、リン酸イオン濃度を間接的に求める方法は従来技術で述べた如 くである。し力しながら、かかる方法では、測定液が海水など妨害物質を含む場合に は正確なリン酸濃度を測定することができない。しかるに、メディ ターをピルビン 酸ォキシダーゼ等と共に用いると、妨害物質に影響を受けることなくリン酸濃度を正 確に測定することが可能となる。
[0026] リン酸イオンの測定には、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極 を設け、作用極上および/またはその付近に測定に必要な酵素および試薬を配した センサが好んで用いられる。このようなセンサとしては、例えばセラミックス、ガラス、プ ラスチック、紙、生分解性材料 (例えば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基 板にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等 から形成された各電極が形成され、作用極上および/またはその付近に架橋法、共 有結合法、イオン結合法等により酵素および試薬を固定化したものなどが用レ、られる [0027] 力かるリン酸濃度の測定に際しては、既製のメディエーターを使用しているバイオセ ンサ、例えばグルコースォキシダーゼ (EC 1.1.3.4·)、グルコースデヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.47、 1.1.1.118、 1.1.1.119、 1.1.99.10.)またはピロ口キノリンキノングルコースデヒ ドロゲナーゼなどの酸化還元酵素およびメディエーターを使用する血糖センサ、血中 乳酸センサおよび食品用のグノレコースセンサ等を用いることができ、これらとしては巿 販のもの、例えば血糖センサとしては、アークレイ製品グノレテスト PRO R (グルコースォ キシダーゼおよびフェリシアン化カリウム使用)、同社製品グノレテスト Neo (グルコース デヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化カリウム使用)、 TheraSense社製品フリースタイ ル (ピロ口キノリンキノングノレコースデヒドロゲナーゼおよびォスゥミゥム複合体使用)等 を、血中乳酸センサとしては、京都第一科学製品ラタテート'プロ (乳酸ォキシダーゼ とフェリシアンィ匕カリウムを使用)およびグルコースセンサとしては、 N〇K製品ダルコ ースメーター GM1000 (食品用、グルコースォキシダーゼとフェリシアン化カリウムを使 用)等をそのまま用いることもできる。すなわち、市販の血糖センサに配されているメデ イエ一ターおよび電極等を使用することにより、簡便にリン酸イオンの定性 ·定量が可 能となる。ただしこの場合には、予めグルコースォキシダーゼまたはグルコースデヒド ロゲナーゼなどを使用して、試料液中のグルコースを消去しておく必要がある。
[0028] 血糖センサは、グノレコースを測定することを目的とするものであって、一般には、上 記の如き絶縁性基板に白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作 用極上および/またはその付近にグノレコースォキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナ ーゼなどの酸化還元酵素およびメディエーターを配置したものである。市販の血糖セ ンサは、センサ自身は包装により湿気や光などの影響を絶った状態で保存されてい るため持ち運びに便利であり、センサの反応検出部における電極表面は試薬層によ り保護されているため、それを用いた場合には、場所を選ぶことがなく手軽に測定が 可能であるというバイオセンサの新しい特徴が発揮される。このような血糖センサは、 近年の開発競争の激化によって、測定の精度や再現性などが年々向上している。ま た、血糖センサは、夾雑物質に富んだ血液 (全血)中にわずかに溶けているダルコ一 スを選択的に測定するために、基質特異性に優れた酵素であるグノレコースォキシダ ーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを使用して触媒反応を進行させ、その際に生 成する電子を電子伝達体 (メディエーター； Med)を介して電極に伝える仕組みとなつ ており、従来の溶存酸素および過酸化水素測定型のグルコースセンサと比べて血液 中に僅かに溶けている溶存酸素や妨害物質、塩分 (0.9% NaCl)の影響を受けないと レ、う極めて優れた特徴を有している。さらに、市販の血糖センサを使用することによつ て、通常の電極チップを測定に用いる場合とは異なり、電極表面を使用前に処理す る必要がなレ、、すなわち通常の電極をバイオセンサに応用する場合には、電極表面 の洗浄および酸化皮膜を除去するための何らかの処理が必要であった力 近年巿 販されている血糖センサを使用すればその必要はないという、実際の操作上におい て非常に優れた利便性を兼ね備えている。
[0029] 市販の血糖センサは、使い捨てタイプのバイオセンサ (血糖センサ)本体と血糖セン サからの電気信号を処理する測定器の 2つの組み合わせで構成されてレ、る。携帯用 の血糖センサは通常は使い捨てタイプであり、平面基板上に導電性材料でパターン 化された 2本ないし 3本の電極が配置され、検出部を成す部分の電極表面上には主 に酵素とメディエーターが展開されている。
[0030] この血糖センサを測定器に接続し、血液試料などをこの血糖センサの試料導入口 力 検出部内部へ導入させることにより、酵素反応が開始し、所定の時間を置いた後 に電気化学的に測定することで、試料液中のグノレコース濃度の測定ができる。市販 の血糖センサの場合、人体における血中グノレコース濃度の範囲の測定が可能であ れば良ぐそのため血糖センサにおけるグルコースの測定範囲はおよそ 2mMから 30mMである。他方、血糖センサの中には試料液の必要量が僅力 0.3 /i lであるものや 、測定時間が僅力 5秒間であるものもある。
[0031] このような血糖センサを本発明の反応系に応用すれば、かかるセンサと同様の性能 を維持した状態で、リン酸イオンを測定できる。また、高性能あるいは小型化されたバ ィォセンサが今後巿販されれば、そのバイオセンサのリン酸イオン検出への応用も効 果的に行うことができ、これらの特徴を利用することで、例えば後述するような極く限ら れた試料液中の SNPsの迅速な検出も可能となる。また逆に、リン酸イオン等の基質を 十分に存在させることで、ピルビン酸ォキシダーゼ活性の測定も可能となる。
[0032] このような血糖センサには、必要に応じて脱塩処理したピルビン酸ォキシダーゼ 0.1 一 100L；、好ましくは 0.2— 20Uを、最終濃度がそれぞれピルビン酸ナトリウム 1一 5000mM、好ましくは 50— 1000mM、マグネシウムイオン 0.1— 100mM、好ましくは 1一 50mM、 FAD 0— 1000 β Μ、好ましくは 1一 50 β Μ、 ΤΡΡ 1— 5000 μ Μ、好ましくは 100 一 ΙΟΟΟ μ Μとなるように ρΗ 7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解した試薬 混合溶液 5 μ 1を、 5 μ 1のリン酸測定試料液とよく混合した後、血糖センサに導入し、 正確に 0 20分間、好ましくは 1一 10分間反応させた後、例えば PCで制御されている 電気化学アナライザー (BAS社製品 ALS701)を使用し、電気化学測定法、例えばサイ クリックボルタンメトリー法、ポテンシャルステップクロノアンぺロメトリー法、クーロメトリ 一法などを用い、例えばサイクリックボルタンメトリー法の場合、掃引速度 1一
500mV/sec、好ましくは 10 100mV/sec、初期電位 0V、最大負電位- 1一 0V、好ましく は、 -0.5-0V,最大正電位 +0.1 +1V、好ましくは、 +0.15 +0.7V、反応 (待機)時間 0 一 20分間、好ましくは 0 10分間でピルビン酸ォキシダーゼのリン酸イオンの触媒反 応で生じる還元型メディエーターに対する応答を確認することにより行われる。
[0033] 上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセン サを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、バ ィォセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示す る表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くポテン シャルステップクロノアンべロメトリー法またはクーロメトリー法またはボルタンメトリー法 などを用いることができる。
[0034] また、この装置には計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、 測定値を遠隔的に管理する場合には、バイオセンサの計測部に計測データを送信 する無線手段、好ましくは非接触型 ICカードまたは短距離無線通信 (例えば、ブルー トゥース;登録商標)などの無線手段を搭載することもできる。
[0035] 一方、淡水及び海水などの環境水中に含まれるリン酸イオン濃度は、尿 (約 20 mM )や食品（< 20 mM)などと比較すると極めて低い値でぁリ、貧栄養湖の場合 0.06— 0.6 a M Pi、富栄養化が進んだ湖沼の水の場合でも 20 μ M Piを超える程度である。 この場合、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系と共に、以下に示す (2)基質増幅反応系を用 レ、ることで測定対象物質の高感度測定が可能となる。 [0036] (2)基質増幅反応系：
(i)ピルビン酸ォキシダーゼ—ホスファターゼ〔酸性ホスファターゼ (EC 3.1.3.2.)また はアルカリ性ホスファターゼ (EC 3.1.3.1·)〕系；
Pi + ピルビン酸 + H20 + 02 > ァセチルリン酸 + C02 + ¾02 (5)
FAD, TPP, Mg2+ 一 s
ァセチルリン酸 > 酢酸 + Pi (9)
[0037] 上記反応 (5)では、 Piとマグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミ ンピロリン酸、ピルビン酸および酸化型メディ ターの存在下、ピルビン酸ォキシダ ーゼの作用により、生成物の一つであるァセチルリン酸が生成し、これからは反応 (9) により酢酸と Piを生成する。ここで言う基質増幅反応系では、測定対象であるリン酸ィ オンが一段目の反応により一方の基質の分解物にリン酸化された後、次の反応によ つて再生され、元の一段目の反応の基質となる。この反応は繰り返されることからサイ クリング反応とも呼ばれる。この反応系を利用する場合、一方の基質であるピルビン 酸が十分に存在すれば、極わず力、なリン酸イオンの存在によっても増幅反応が進行 することができ、高感度なリン酸イオンの検出が可能となる。また逆に、リン酸イオン以 外の基質を十分に存在させることで、前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスフ ァターゼ活性の測定も可能となる。
[0038] 他方、上記 (1) (2)のリン酸イオン検出系の触媒反応に下記の (10)式の触媒反応を 組み合わせることよって、ピロリン酸イオンの検出が可能となる。
(3)無機ピロホスファターゼ (EC 3.6.1.1.)系：
→f
PPi > 2Pi (10)
[0039] 上記 (10)式のリン酸イオン検出反応系への応用によって、種々の核酸（DNAや RNA )の検出が可能となる。その例を、以下に示す。
[0040] (4) SNP検出反応系：
(i) DNAリガーゼ (EC6.5.1.1. 6.5.1.2·)系; ATP + TTT I I I > I I I I I I Γ + PPi + AMP (11) 上記反応系 (11)では、長鎖側の 1本鎖 DNAが SNPの検出対象であり、その塩基配 列の中心部分に SNP (変異型とする；秦)が含まれている。その配列に、相補的な 2種 類の 1本鎖 DNA (プライマー)を左辺に示すように二本鎖形成 (ノヽイブリダィズ)させたも のに、連結に必要なエネルギーの供与体であるアデノシン 5' -三リン酸 (ATP)の存 在下で、連結酵素として知られる DNAリガーゼを作用させると、その反応は右辺に進 む。この場合、 2種のプライマーが測定対象の塩基配列上で 5' -末端と 3' -末端が 連結されるには、長鎖側の 1本鎖 DNAの^ -末端側に相補的にハイブリダィズする プライマーの 5/ -末端がリン酸化されている必要がある。この反応により生成したピロ リン酸イオンを、上記の方法により測定することで、 SNPの検出ができる。一方、測定 対象である長鎖側の 1本鎖 DNAが野生型であれば、この場合 DNAリガーゼ反応は進 行しない。この方法で SNPを検出する場合、 2種のプライマーの内、一方の SNP部分 に相補的な塩基配歹' J、すなわち 3' -末端の塩基の種類を変えることによって、上記 の方法とは反対に、野生型の場合に DNAリガーゼ反応を進行させることもできる。こ の SNP検出反応に使用する DNAリガーゼとしては、 T4 DNAリガーゼまたは大腸菌リ ガーゼが好適である。
(ii) DNAポリメラーゼ (EC 2.7.7.7.)系 A;
DNAポリメラーゼ (ボリメラ一ゼ St©
i I I 1 I I I + PPi (12) 上記 1塩基対伸長反応系 (12)においても、長鎖側の 1本鎖 DNAが SNPの検出対象 であり、その塩基配列の中心部分に SNP (変異型とする；秦)が含まれている。その長 鎖の 5' -末端から SNPの塩基配列の 1塩基手前までの配列に、相補的な 1本鎖 DNA プライマーを左辺に示すように長鎖とハイブリダィズさせたものに、基質であるデォキ シリボヌクレオチド 5' -三リン酸 (dNTP)の存在下で、 DNAポリメラーゼを作用させると 、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを、上記の方法 により測定することで、 SNPの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の 1本鎖 DNAが野生型であれば、この場合には DNAポリメラーゼ反応は進行しなレ、。この方 法で SNPを検出する場合、プライマーの SNP部分に相補的な塩基配歹 U、すなわち^ -末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合に DNAポリメラーゼ反応を進行させることもできる。この SNP検出反応に使用する DNAポ リメラーゼとしては、クレノー DNAポリメラーゼ（DNAポリメラーゼ Iラージフラグメント） および T4 DNAポリメラーゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、好ましくは 3'→5 'ェキソヌクレア一 ゼ活性を喪失させたクレノー DNAポリメラーゼが好適である。
[0042] (iii) DNAポリメラーゼ系 B ;
-― D ポリメラ一ゼ (ポリメラーゼ腦
dNTPs + I I I I I >
I I I I 1 I i I I I I I I I + PPis (13) 上記多塩基対伸長反応系 (13)において、長鎖側の 1本鎖 DNAが SNPの検出対象で あり、その塩基配列の中心部分に SNP (変異型とする；秦）が含まれている。その長鎖 の 5' -末端から SNPの塩基配列までが相補的な DNAプライマーを左辺に示すように 長鎖とハイブリダィズさせたものに、基質である dNTPsの存在下で DNAポリメラーゼを 作用させると、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを上 記の方法により測定することで、 SNPの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側 の 1本鎖 DNAが野生型であれば、この場合は DNAポリメラーゼ反応は進行しなレ、。こ の方法で SNPを検出する場合、プライマーの SNP部分に相補的な塩基配歹 IJ、すなわ ち^ -末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の 場合に DNAポリメラーゼ反応を進行させることもできる。この反応系の場合、測定対 象である長鎖側の 1本鎖 DNAの SNP部位から 3' -末端の間の塩基配列を長くするこ とで、反応系 (12)よりも少ない量の測定対象 DNAから、多くのピロリン酸イオンを生成 することができるという特徴がある。この SNP検出反応に使用する DNAポリメラーゼとし ては、反応系 (12)の場合と同様にクレノー DNAポリメラーゼおよび T4 DNAポリメラー ゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、好ましくは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性を除去してあるク レノー DNAポリメラーゼが好適である。
[0043] (iv) DNAポリメラーゼ系 C ; 上記多塩基対伸長反応系 (14)において、長鎖側の 1本鎖 DNAが SNPの検出対象で あり、その塩基配列の中心部分に SNP (変異型とする；拿）が含まれている。その長鎖 の 5' -末端から SNPの塩基配列までが相補的で、続く 1塩基または 2塩基が長鎖側 の塩基配列に対して相補的でない DNAプライマーを左辺に示すように長鎖とハイブ リダィズさせたものに、基質である dNTPsの存在下で DNAポリメラーゼを作用させると 、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを上記の方法に より測定することで、 SNPの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の 1本鎖 DNAが野生型であれば、この場合は DNAポリメラーゼ反応は進行しない。この方法で SNPを検出する場合、プライマーの SNP部分に相補的な塩基配歹 lj、すなわち^ -末 端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合に DNAポリメラーゼ反応を進行させることもできる。この反応系の場合、測定対象である 長鎖側の 1本鎖 DNAの SNP部位から 3' -末端の間の塩基配列を長くすることで、反 応系 (12)よりも少ない量の測定対象 DNAから、多くのピロリン酸イオンを生成すること ができるとレ、う特徴がある。この SNP検出反応に使用する DNAポリメラーゼとしては、 反応系 (12)の場合と同様にクレノー DNAポリメラーゼおよび T4 DNAポリメラーゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性および 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ 活性を除去してあるクレノー DNAポリメラーゼが好適である。
(5)—本鎖ゲノム検出反応系：
DNAポリメラーゼ系（ランダムプライマー法）； ランダムプライマー + i l l
(一本鎖ゲノム）
DNAポリメラーゼ (ポリメラーゼ細
> 上記反応系 (15)、（16)は、 1本鎖のゲノムを持つウィルスや細菌などの検出に好適で ある。反応式 (15)は、ランダムな塩基配列からなる複数のプライマーを測定対象であ る一本鎖 DNAとハイブリダィズさせる反応である。反応式 (16)では、測定対象の 1本 鎖ゲノムと部分的にハイブリダィズしたプライマー同士を DNAポリメラーゼによって連 結することで、完全な 2本鎖 DNAが合成される。このとき、 dNTPsが DNA鎖の構成材 料として取り込まれ、ピロリン酸イオンが生成される。この反応系で使用する DNAポリ メラーゼとしては、大腸菌由来の DNAポリメラーゼほたはクレノー DNAポリメラーゼ、 T4 DNAポリメラーゼ、 T7 DNAポリメラーゼ、好ましくはクレノー DNAポリメラーゼなど が好適である。さらに、この方法では、ゲノムに 1本鎖 RNAをもつウィルスなどの検出も 逆転写酵素（RNA依存性 DNAポリメラーゼ）と DNAのランダムプライマー、 dNTPsの使 用、または RNAポリメラーゼ (EC 2.7.7.6·)、 RNAのランダムプライマー、 NTPsの使用に より可能である。
(6)二本鎖ゲノム検出反応系：
DNAポリメラーゼ -DNァーゼ系（ニックトランスレーション法）；
DNァーゼ ―
1 1 I I > π en) ゲノム核酸
DNAポリメラ一ゼ (ェキソヌクレア一ゼ 814)
>
ΤΤ ι I I I ιΤΤ + dNMPs (18)
I»IAポリメラーゼ (ポリメラーゼ ffiffi)
dNTPs + TT IT >
+ PPis (19) 上記の反応系 (17)— (19)は、ゲノムに二本鎖 DNAを持つウィルスや細菌などの検出 に好適である。反応式 (17)では、デォキシリボヌクレアーゼ (DNァーゼ)により、二本鎖 DNA上に無数の切れ目 (ニック)が入る。この場合、 DNァーゼ Iを使用することにより、 二本鎖 DNAの 1本鎖部分のみにニックが入るため、二本鎖が切断されることはなレ、。 続いて、反応式 (18)では、二本鎖 DNA上に入ったニックを DNAポリメラーゼが認識し 、 DNAポリメラーゼが持つェキソヌクレアーゼ活性によって、ニックの周囲の数十塩基 を削除する。さらに、反応式 (19)では、同酵素のポリメラーゼ活性によって、二本鎖 DNAは元の状態に修復される。この場合の DNァーゼとしては DNァーゼ I(EC 3.1.21.1)力 また DNAポリメラーゼとしては大腸菌由来の DNAポリメラーゼ Iが好適で ある。この反応系では、例えば 1個のウィルス由来のゲノムでも存在すれば、その反 応系の一方の基質である dNTPsが消費されるまでこの反応は進むため、原理的にゥ ィルスの検出は可能である。さらに、二本鎖ゲノムは熱変性またはアルカリ変性など により、 1本鎖を形成させることで、前記ランダムプライマー法による検出も可能である 。この方法によればゲノムに二本鎖 RNAをもつウィルスなどの検出も可能である。
[0046] 上記リン酸イオン反応系、ピロリン酸イオン反応系およびこれらの反応系は、核酸な どのリン酸イオンおよびピロリン酸イオンが関与する一連の生体関連の反応として、 本発明のバイオセンサに応用することが可能である。前記応用例のほかにも、核酸 のシークェンス（パイ口シークェンス法など）、核酸増幅反応 (PCR)法、 RAC(rolling circle amplification)法、 SDA、standard displacement amplification)法、 NASBA (nucleic acid sequence base amplification)法など)および受容体の挙動 (GTPを消費し てピロリン酸イオン生成する Gプロテインの挙動など)のモニタリング、その他リン酸ィ オンおよびピロリン酸イオンが触媒反応に関与する酵素の活性測定への応用も可能 である。この場合、使用する酵素が粗精製であったり、リン酸塩を含む懸濁液に溶解 している状態であれば、限外ろ過による脱塩およびカラムクロマトグラフィーによる精 製などの前処理を行うことが望ましい。特にリン酸イオンを基質サイクルとする増幅反 応系では、市販の血糖センサの反応検出部分にもリン酸塩が存在しないことが望ま しい。
[0047] 本発明方法 (2)においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、最 終的に β _D-グノレコースを生成するような基質と酵素、酸化型メディエーターおよび グノレコースォキシダーゼによって代表される酸化還元酵素を用レ、、リン酸から還元型 メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することによ り、試料液中のリン酸イオンを測定することもできる。なお、試料液中にグルコースが 存在する場合は、予めダルコースォキシダーゼなどを使用して試料液中のグノレコ一 スを消去しておく必要がある。 最終的に β -D-グノレコースを生成するような触媒反応系群としては次のものが挙げ られる。
(7)単純反応系：
(i)マルトースホスホリラーゼ (EC 2.4.1.8·)—ムタロターゼ (EC 5.1.3.3.)系； Pi +マルトース >
a-D~グルコース + 3 -EHグルコース- 1-リン酸 （20) α-D "グルコース > jS -D "グルコース （21)
(ii)スクロースホスホリラーゼ (EC 2.4.1.7.)—グノレコースイソメラーゼ (EC 5.3.1.18.)系;
Pi + スクロース >
フルクト一ス + α -D"グルコース- 1-リン酸 tf
フルクトース > j3 -D"グルコース （23) i3 -D-グルコースは、以下の反応等により還元型メディエーターを発生させる。
!8 -D"グルコース +酸化型メデイエ一ター >
ダルコン酸 +還元型メディエーター （24) - D~グルコース +酸化型メディエーター >
ダルコン酸 +還元型メデイエ一ター （25) 酸化還元酵素としては、グルコースォキシダーゼ (EC 1.1.3.4.)のほかグルコースデ ヒドロゲナーゼ (EC 1.1.1.47 1.1.1.118 1.1.1.119 1.1.99.10·)、ピロ口キノリンキノン' グルコースデヒドロゲナーゼなどが用いられ、メディエーターとしては、フェリシアンィ匕 カリウム、フエ口セン、パラべンゾキノンなどが用いられる。メディエーターとして、フェリ シアン化カリウム K Fe(CN)を用いた場合には、グルコース等との反応は次のように進 行する
J3 -EHグルコース + 2Fe (CN) 6 + ¾0 >
ダルコン酸 + 2H+ + 2Fe (CN) 6 (26) この際発生したフエロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。
2Fe (CN) 6 > 2Fe (CN) 6——— + 2e— (27)
[0051] また、メディエーターとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラべンゾキノンを用い た場合には、 GOD存在下でのグルコースとパラべンゾキノンとの反応でヒドロキノンが 生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでそ の値が測定される。 ヒドロキノン > パラべンゾキノン + 2H+ + 2e_ (28)
[0052] β _D-グルコースがグルコースォキシダーゼ等の作用により酵素の存在下で酸化さ れてダルコノラタトンを生成させ、そのとき発生する H 0を作用極上で酸化し、その際
2 2
の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は従来 技術で述べた如くである。し力、しながら、係る方法では、測定液が海水など妨害物質 を含む場合には正確なリン酸濃度を測定することができなレ、。しかるに、メディエータ 一をグルコースォキシダーゼ等と共に用いると、妨害物質に影響を受けることなくリン 酸濃度を正確に測定することが可能となる。
[0053] リン酸イオンの測定は、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を 設け、作用極上に測定に必要な酵素および試薬を配したセンサが好んで用いられる
。このようなセンサとしては、前述の如きものなどが用いられる。
[0054] 力かるリン酸濃度の測定に際しては、既製の血糖センサまたは食品用のグルコース センサ等を用いることができ、これらとしては市販のものをそのまま用いることができる
。例えば、血糖センサ、グルコースセンサとしては、前述の如き巿販品等をそのまま 用レ、ることもできる。
[0055] 本発明方法 (1)と同様に、本発明方法 (2)においても、血糖センサを測定器に接続し 、血液試料などをこの血糖センサの試料導入口から検出部内部へ導入させることに より、酵素反応が開始し、所定の時間を置レ、た後に電気化学的に測定することで、試 料液中のグルコース濃度の測定ができる。このような血糖センサを本発明方法 (2)の 上記 (7)単純反応系に応用すれば、このセンサと同じ濃度範囲のリン酸イオンを測定 できる。また、このような測定範囲内であれば、血液、尿、食品などに含まれるリン酸ィ オンの測定に使用できる。
[0056] このような血糖センサには、必要に応じて脱塩処理したマルトースホスホリラーゼぉ よびムタロターゼまたはスクロースホスホリラーゼおよびグルコースイソメラーゼを、そ れぞれ 0.01 100U、好ましくは 0.1 20Uを緩衝液に溶解し、これとリン酸測定試料 液および 25nmole以上、好ましくは 125nmole 5 μ moleのリン酸以外の基質液、すな わちマルトースまたはスクロール溶液をよく混合した後、血糖センサに導入し、正確に 0— 20分間、好ましくは 1一 10分間反応させた後、例えば PCで制御されている電気化 学アナライザー (BAS社製品 ALS701)を使用し、電気化学測定法、例えばサイクリック ボルタンメトリー法、ポテンシャルステップクロノアンぺロメトリー法、クーロメトリー法な どを用レ、、例えばサイクリックボルタンメトリー法の場合、掃引速度 1一 500mV/sec、好 ましくは 10 100mV/sec、初期電位 0V、最大負電位- 1一 0V、好ましくは、 -0.5 0V、 最大正電位 +0.1— +1V、好ましくは、 +0.15 +0.7V、反応 (待機)時間 0 20分間、好 ましくは 0— 10分間でグルコースに対する応答を確認することにより行われる。
[0057] 上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセン サを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定すること、用いられる測定装 置の詳細および測定方法は、前述の通りである。
[0058] 一方、淡水及び海水などの環境水中に含まれるリン酸イオン濃度は、食品（<
20mM)や尿（約 20mM)などと比較すると極めて低い値でぁリ、貧栄養湖の場合 0.06 →.6 μ Μ Pi、富栄養化が進んだ湖沼の水の場合でも 20 μ M Piを超える程度である 。この場合、（7)単純反応系の代わりに、以下に示す (8)基質増幅反応系および (9)複 合反応系を用いることで測定対象物質の高感度測定が可能となる。
[0059] (8)基質増幅反応系：
(i)マルトースホスホリラーゼ—ホスファターゼ〔酸性ホスファターゼ (EC 3.1.3.2.)また はアルカリ性ホスファターゼ (EC 3.1.3.1.)〕系；
一" e
Pi + マル卜ース >
a- D"グノレコース + - D~グルコース- 1-リン酸 （20)
SSi fcii
)3 -D "グルコース" I-リン酸 >
/3 -D~グルコース + Pi (29) [0060] 上記反応 (20)では、 Piとマルトースの存在下、マルトースホスホリラーゼの作用によ り、生成物の一つである i3 _D-グルコース- 1-リン酸が生成し、これからは反応 (29)に より β -D-グルコースと Piを生成する。ここで言う基質増幅反応系では、測定対象であ るリン酸イオンが一段目の反応により一方の基質の分解物にリン酸化された後、次の 反応によって再生され、元の一段目の反応の基質となる。この反応は繰り返されるこ とから基質リサイクリング反応とも呼ばれる。この反応系を利用する場合、一方の基質 であるマルトースが十分に存在すれば、極わずかなリン酸イオンの存在によっても増 幅反応が進行することができ、高感度なリン酸イオンの検出が可能となる。また逆に、 リン酸イオン以外の基質を 10mM以上、好ましくは 50 2000mMの濃度で存在させるこ とで、前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼ活性の測定も可能となる
[0061] (ii)スクロースホスホリラーゼ—ホスファターゼ (酸性ホスファターゼまたはアルカリ性 ホスファターゼ)ームタロターゼ系；
Pi + スクロース >
フルクトース + α -D "グルコース- 1-リン酸 (22)
«14 ~ΐί
ct-D "グルコース-トリン酸 >
α-D"グルコース + Pi (30) α—D"グルコース > ]3 -D~グルコース （21) 上記反応も、一段目のスクロースホスホリラーゼ反応とそれに続くホスファターゼ反 応との組み合わせによって、（i)のマルトースホスホリラーゼ—ホスファターゼ系と同様 の効果を得ることができる。
[0062] (9)複合反応系
(i)マルトースホスホリラーゼ—ホスファターゼ (酸性ホスファターゼまたはアルカリ性 ホスファターゼ)一ムタロターゼ系； Pi + マルトース >
α-D"グルコース + J3—D—グルコース" I—リン酸 (20) as*
]3 -D~グルコース- 1-リン酸 >
3 -D "グルコース + Pi (29) α-D-グルコース > 13 -EHグルコース （21)
(ii)スクロースホスホリラーゼ—ホスファターゼ (酸性ホスファターゼまたはアルカリ性 ホスファターゼ)一ムタロタ一ゼーグノレコースイソメラーゼ系；
Pi + スクロース ；
フルクト一ス + α-D-グルコース- 1-リン酸 (22) ~e
c -D~グルコース- 1-リン酸 >
α-D-グルコース + Pi (30) a— D"グノレコ―ス > j3 -D "グノレコ' (21) 一
フルクト一ス > ダルコ (23) 上記 (9)複合反応系における 2種 (i)一 (ii)の反応系は (7)単純反応系と (8)基質増幅反 応系を組み合わせたもので、基質増幅反応系よりも高感度なリン酸イオンの検出が 可能である。
他方、上記 (7)— (9)のリン酸イオン検出系の触媒反応に下記の (10)式の触媒反応を 組み合わせることよって、ピロリン酸イオンの検出が可能となる。
(10)無機ピロホスファターゼ (EC 3.6.1.1.)系：
PPi > 2ΡΪ (10) また、（10)無機ピロホスファタ一ゼ系を前述した (4)SNP検出反応系、（5)—本鎖ゲノ ム検出反応系および (6)二本鎖ゲノム検出反応系などのリン酸イオン検出反応系へ 応用することによって、種々の核酸（DNAや RNA)の検出が可能となる。 実施例
[0065] 次に、本発明方法を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超 えない限り以下の実施例に制限されるものではない。
[0066] 参考例 1
絶縁性のプラスチック基板 (7mm X 22mm)上に幅 lmmの白金箔が 0.5mmの間隔を置 いて 2本平行して配列しており、リン酸塩を含まない作用極上にグルコースォキシダ ーゼおよびフェリシアン化カリウムが配されているバイオセンサに、グルコースを含む 試料液 (pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液）を、毛管現象により作用極上に 到達させ、試料液中のグルコースに対する電気信号を、バイオセンサの端子に接続 された専用のコネクターを介して、 PCで制御されている電気化学アナライザー (BAS 社製 ALS701)を用いて検出した。電気化学測定法としてはサイクリックボルタンメトリー 法を用い、掃引速度 50mV/sec、初期電位 0V、最大電位 +0.7V、反応 (待機)時間 60秒 間でグルコースに対する応答を確認した。その結果、 2mMから l OOmMグルコースの 範囲において、 +0.2V付近にメディエーター特有の電流値のピークが現れた。そのピ 一ク値は図 1に示される如くグルコース濃度に対し、ほぼ比例関係を示しており、この バイオセンサはグルコースに対する測定範囲が広ぐ本発明に関わる実施に好適で あることがわかった。
[0067] 実施例 1
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系を用 いてリン酸イオンの測定を行った。ピルビン酸ォキシダーゼ (ァエロコッカスピリダンス 由来) 200unitsは氷冷中の 250 μ 1の反応試薬液 I、すなわち、 40mMマグネシウムィォ ンおよび 48 μ Μ FADを含む pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解した。 反応試薬液 Πとしては、 800mMピルビン酸ナトリウムおよび 0.96mM TPPを、氷冷中に て 250 /i 1の pH7.0、 l OOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解したものが用いられた。 測定試料液としては、 400mMリン酸二水素カリウムを含む pH7.0、 l OOmMクェン酸ナト リウム緩衝溶液を調製して用いた。測定は、 2 unitのピルビン酸ォキシダーゼを含む 反応試薬液 I 2.5 μ Lと反応試薬液 II 2.5 μ L、測定試料液 5 μ 1とを充分に混合したも のを血糖センサに導入し、正確に 3分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件 下、サイクリックボルタンメトリー法でリン酸イオンの測定を行った。
[0068] 比較例 1
実施例 1におレ、て、 TPPが用いられなかった。
[0069] 比較例 2
実施例 1におレ、て、 FADが用いられなかった。
[0070] 比較例 3
実施例 1において、マグネシウムイオンが用いられな力、つた。
[0071] 比較例 4
実施例 1において、測定試料液として、 lOOmMリン酸二水素カリウムを含まない pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられた。
[0072] 以上の実施例 1および比較例 1一 4で得られた結果は、図 2に示される。なお、各数 値は、 n=3の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、反 応試薬液の成分として FADが含まれない場合を除いて、リン酸イオンに対する応答 は得られなかった。一方、 FADを除いた場合では、通常の反応試薬組成で得られた リン酸イオンに対する応答に比べ、およそ半分程度の応答を示した。これは、ピルビ ン酸ォキシダーゼは本来 FADを備えてレ、る力 使用したピルビン酸ォキシダーゼの 中に精製の過程で FADが離脱したものが含まれていたためであると考えられる。以上 より、ピルビン酸ォキシダーゼ系においては、マグネシウムイオン、 FAD、および TPP が必要とされることが確認された。
[0073] 実施例 2
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系にお ける、 TPP濃度とセンサ応答との関係を調べた。氷冷中の pH7.0、 lOOmMクェン酸ナト リウム緩衝溶液 250 μ 1に lOOunitsのピルビン酸ォキシダーゼ (ァエロコッカスピリダン ス由来)と、 20mMマグネシウムイオンおよび 24 μ Μ FADが含まれる反応試薬液 Iと、同 じく氷冷中の pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 250 μ 1に 400mMリン酸二水 素カリウムと、 400mMピルビン酸ナトリウムおよび所定の濃度の TPPを含む反応試薬 液 Πをそれぞれ 2.5 μ ΐずつ充分に混合し、この混合液を血糖センサに導入し、正確に 10分間反応させた後、グノレコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー 法により電流値の測定が行われた。
[0074] 得られた結果は、図 3に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。
TPPに対する本バイオセンサの応答は、 48 240 μ Μの範囲で得られた。以上より、 ΤΡΡの濃度が 48 μ Μよりも低い場合、リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答が 著しく低下することを示された。
[0075] 実施例 3
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系にお けるピルビン酸濃度とセンサ応答との関係を調べた。実施例 2で用いられた反応試薬 液 Iと、氷冷中の pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 250 μ 1に 400mMリン酸二 水素カリウムと、 0.48mM TPPおよび所定の濃度のピルビン酸ナトリウムを含む反応試 薬液 Πをそれぞれ 2.5 μ ΐずつ充分に混合し、この混合液を血糖センサに導入し、正確 に 10分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリ 一法により電流値の測定が行われた。
[0076] 得られた結果は、図 4に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。ピ ルビン酸に対する本バイオセンサの応答は、 4一 400mMの範囲で得られた。以上より 、 4一 400mMの範囲であれば、本センサーがピルビン酸の測定にも応用が可能であ ることが示された。
[0077] 実施例 4
参考例で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系におけ るピルビン酸ォキシダーゼ活性とセンサ応答との関係を調べた。氷冷中の pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 250 μ 1に所定単位のピルビン酸ォキシダーゼ (ァ エロコッカスピリダンス由来)と、 20mMマグネシウムイオンおよび 24 FADが含まれ る反応試薬液 Iと、同じく氷冷中の pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 250 μ 1 に 400mMリン酸二水素カリウムと、 400mMピルビン酸ナトリウムおよび 0.48mM TPPを 含む反応試薬液 Πをそれぞれ 2.5 μ 1ずつ充分に混合し、それを血糖センサに導入し 、正確に 10分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタン メトリー法により電流値の測定が行われた。 [0078] 得られた結果は、図 5に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。ピ ルビン酸ォキシダーゼ活性に対する本バイオセンサの応答は、 6— 200m units/ 1の 範囲で高い相関関係（r=0.9991)が得られた。以上より、 6— 200m units/ μ ΐの範囲で あれば、本センサーがピルビン酸ォキシダーゼ活性の測定にも応用が可能であるこ とが示された。
[0079] 実施例 5
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ系にお ける、リン酸イオンとセンサ応答との関係を調べた。実施例 1で用いられた反応試薬 液 Iおよび反応試薬液 IIを使用し、測定試料液としては、所定の濃度のリン酸二水素 カリウムを含む pH7.0、 lOOmMクェン酸ナトリウム緩衝溶液を調製して用いた。測定は 、 2 unitのピルビン酸ォキシダーゼを含む反応試薬液 I 2.5 μ Lと反応試薬液 II 2.5 μ L 、測定試料液 5 μ ΐとを充分に混合したものを血糖センサに導入し、正確に 10分間反 応させた後、グノレコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電 流値の測定が行われた。
[0080] 得られた結果は、図 6に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。リン 酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、 ImM付近から lOOmMの範囲で得られ、 食品や尿などに含まれているリン酸の測定に好適であることが確認された。
[0081] 実施例 6
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（1)ピルビン酸ォキシダーゼ反応系 を用レ、て環境水中に溶解させたリン酸イオンの測定を行った。実施例 1で用レ、られた 反応試薬液 Iおよび反応試薬液 IIを使用し、測定試料液としては、添加するリン酸二 水素カリウムの濃度が 5、 10、 15、 20mMとなるように環境水中に溶解したものを使用し た。環境水としては、東京工科大学敷地内にある日本庭園、カスケードおよび溜池か ら採取した。環境水の pHはそれぞれ、 7.65， 7.64, 7.93、リン酸イオン濃度はそれぞれ 、 0.073 μ Μ, 0.67 μ Μ, 5.4 μ M(JIS Κ 0102準拠：ァスコルビン酸還元によるモリブデ ン青吸光光度法)であった。本発明のバイオセンサ法ではまず、 pH7.0、 lOOmMクェン 酸ナトリウム緩衝溶液およびこれに 25mMのリン酸イオンを添加した溶液に対するセン サー応答を検量線の値として求めた上で、リン酸イオンを添加した各環境水の応答 を前記検量線に当てはめて各環境水中のリン酸イオン濃度を求めた。ァスコルビン 酸還元によるモリブデン青吸光光度法からもこれと同様に各環境水中のリン酸イオン 濃度を求め、その値を従来法で求めた値とした。
[0082] 得られた結果は、図 7a，b，cに示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している 。このときのバイオセンサの応答の変動係数の平均は日本庭園が 7.6%、カスケードが 9.1%,溜池が 8.8%であった。 日本庭園 a、カスケード bおよび溜池 cの順に、含まれる リン酸イオンの濃度が高レ、環境水ほど、センサー応答値は従来法に比べ高レ、値を示 した。この原因としては、リン酸イオンの濃度が高い環境水ほどその他の夾雑物質を 多く含み、それらがリン酸イオンと相互作用することが考えられる。すなわち、従来法 ではリン'モリブデン錯体を形成させるベぐ溶液を強酸性に調製する必要があるた め、リン酸イオンは夾雑物質との相互作用の影響を受けにくいが、ピルビン酸ォキシ ダーゼが触媒できるのは、真に溶存状態であるリン酸イオンだけであることから、この ような結果に結びついたものと考えられる。
[0083] 実施例 7
参考例 1で用いられたバイオセンサを使用して、（2)増幅反応系の (i)ピルビン酸ォキ シダーゼー酸性ホスファターゼ系における pHとセンサ応答との関係を調べた。氷冷し た所定の pHの緩衝溶液 250 μ 1に lOOunitsのピルビン酸ォキシダーゼ (ァエロコッカス ビリダンス由来)と、 40mMマグネシウムイオンおよび 48 μ M FADが含まれる反応試薬 液 Iと、氷冷した所定の pHの緩衝溶液 250 /i lに 400mMリン酸二水素カリウムと、 400mMピルビン酸ナトリウムおよびの 0.48mM TPPを含む反応試薬液 II、氷冷した所 定の pHの緩衝溶液 50 /i 1に 20unitsの酸性ホスファターゼ (ポテト由来)が含まれる反 応試薬液 ΠΙをそれぞれ 2.5 μ 1、 5 μ 1、 2.5 μ 1ずつ充分に混合し、それを血糖センサに 導入し、正確に 60秒間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリック ボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。
[0084] 得られた結果は、図 8に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。こ の図が示すように、酸性ホスファターゼ活性における最適 pHが存在する酸性側よりも 、ピルビン酸ォキシダーゼ活性における最適 ρΗ (ρΗ 7.0)付近で、リン酸イオンに対 する応答が最も高いことが分かった。また、この結果より、ピルビン酸ォキシダーゼの みの (1)単純反応系と比較して、（2)基質増幅反応系であるピルビン酸ォキシダーゼ一 酸性ホスファターゼ系のほうが、リン酸イオンに対する応答が遥かに良くなることが示 された。
[0085] 参考例 2
絶縁性のプラスチック基板 (7mm X 22mm)上に幅 lmmの白金箔が 0.5mmの間隔を置 いて 2本平行して配列しており、リン酸塩を含まない作用極上にグルコースォキシダ ーゼおよびフェリシアン化カリウムが配されているバイオセンサに、所定濃度のダルコ ースを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 2.5 μ 1を、毛管現象により作用 極上に到達させ、試料液中のグルコースに対する電気信号を、バイオセンサの端子 に接続された専用のコネクターを介して、 PCで制御されている電気化学アナライザー (ALS701)を用いて検出した。電気化学測定法としてはサイクリックボルタンメトリー法 を用レ、、掃引速度 50mV/sec、初期電位 0V、最大電位 +0.7V、反応 (待機)時間 60秒間 でグルコースに対する応答を確認した。その結果、 2mMから lOOmMグルコースの範 囲において、 +0.2V付近にメディエーター特有の電流値のピークが現れた。そのピー ク値は図 9に示される如くグルコース濃度に対し、ほぼ比例関係を示しており、このバ ィォセンサはグルコースに対する測定範囲が広ぐ本発明に関わる実施に好適であ ること力ゎカゝつた。
[0086] 実施例 8
前記 (7)単純反応系の (i)マルトースホスホリラ一ゼームタロタ一ゼ系を参考例 2で用 レ、られたバイオセンサに応用し、リン酸イオン濃度に対する応答を調べた。マルトー スホスホリラーゼ (ラタトバチルスブレビス由来)、ムタロターゼ (豚腎臓由来)およびグ ルコースォキシダーゼ (ァスペルギウス二ガー由来)は、分画分子量 1万の限外ろ過 フィルターを使用して脱塩処理を行った後、氷冷中の PH6.5、 20mMクェン酸ナトリウ ム緩衝溶液に 0.4unit/ x lとなるように溶解した。なお、グルコースォキシダーゼは、参 考例 2に記載される如くバイオセンサに予め配されているものの、使用したバイオセン サがロットによりバラツキが見られることから、再現性を確実なものとするため本実施 例以降追加して使用することとした。また、基質液としては、 400mMマルトースを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液力 測定試料液としては、所定濃度のリン 酸二水素カリウムを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられた。次 に、各酵素を含む溶液 2.5 β 1、基質液 2.5 μ 1および測定試料液 5 β 1とを充分に混合 したものをバイオセンサに導入し、正確に 3分間反応させた後、グノレコースの測定時 と同条件下でサイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。
[0087] 得られた結果は、図 10に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。リ ン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、 0.2mM付近から 20mMの範囲で得られ 、食品や尿などに含まれているリン酸の測定に好適であることが確認された。
[0088] 実施例 9
実施例 8において、ムタロターゼの代わりに酸性ホスファターゼ (ポテト由来)が同活 性量で用いられ、また反応時間が 10分間に変更されて電流値の測定が行われ、前 記 (8)基質増幅反応系の (i)マルトースホスホリラーゼー酸性ホスファターゼ系における リン酸イオン濃度に対する応答を調べた。ここで、アルカリ性ホスファターゼではなく 酸性ホスファターゼを使用したのは、グルコースォキシダーゼが弱酸性条件下で至 適であるためである。
[0089] 得られた結果は、図 11に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。リ ン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は実施例 8に示される単純反応系の結果 と比較して約 10倍の 20 μ Mから 2mMの範囲で応答が得られ、富栄養化が進んだ環境 水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であることが確認された。
[0090] 比較例 5
実施例 9において、酸性ホスファターゼが用いられなかった。その結果、各種濃度 のリン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、いずれも約 15 μ Aであった。この 値はリン酸イオンが存在しない場合のセンサ応答値と等しいことから、反応に十分な 量の基質が存在してレ、たとしても、マルトースホスホリラーゼのみではグルコースォキ シダーゼ反応が進行しないことが確認された。
[0091] 実施例 10
前記 (9)複合反応系の (i)マルトースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロタ一 ゼ系を血糖センサに応用して、リン酸イオンの濃度を一定として、 pHとセンサ応答と の関係を調べた。実施例 8で用いられたマルトースホスホリラーゼ、ムタロターゼ、グ ルコースォキシダーゼおよび実施例 9で用いられた酸性ホスファタ一ゼは分画分子 量 1万の限外ろ過フィルターを使用して脱塩処理を行った後、氷冷中の pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液に 0.4ιιη¾/ μ 1となるように溶解した。また、基質液 としては、 400mMマルトースを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定 試料液としては、 ImMリン酸二水素カリウムを含む pH4.0のフタル酸緩衝溶液および 各 ^^が5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5の 0.2Mトリス—マレイン酸緩衝溶液がそれぞ れ用いられた。次に、各酵素を含む溶液 2.5 μ 1、基質液 2.5 μ ΐおよび測定試料液 5 μ 1とを充分に混合したものをバイオセンサに導入し、 10分間反応させた後、サイクリック ボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。
[0092] 得られた結果は、図 12に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。こ こで、横軸に示している値は、各酵素を含む溶液、マルトース液および測定試料液が 混ざった状態の血糖センサの反応検出部における ρΗで示してある。これにより、 ρΗ の影響を調べたところ、この複合反応系における最適な ρΗは 6.5付近であることが示 された。また、 ρΗが 8付近でセンサの応答が著しく低下した。これは、増幅反応を行う 酸性ホスファターゼの活性の低下が原因として考えられる。
[0093] 実施例 11
実施例 10において、測定試料液として 2mMリン酸二水素カリウムを含む ρΗ6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、所定時間反応させた際の電流値の測 定を行い、この複合反応系における反応時間とセンサ応答との関係を調べた。
[0094] 得られた結果は、図 13に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。リ ン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は反応時間の長さと比例して大きくなつて おり、マルトースが十分に存在する反応条件下であれば、この複合反応系がリン酸ィ オンの存在によって増幅反応を起こすことが示された。
[0095] 実施例 12
実施例 10において、基質液としては、 400mMリン酸二水素カリウムを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液力 測定試料液としては、所定濃度のマルトースを 含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、マルトース濃度に対する 応答を調べた。 [0096] 得られた結果は、図 14に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。マ ルトースに対する本バイオセンサの応答は、 1一 300mMの範囲で得られた。
[0097] 実施例 13
実施例 8において、マルトースホスホリラ一ゼ、ムタロターゼ、グルコースォキシダー ゼに加えて実施例 9で用いられた酸性ホスファターゼが用いられ、また反応時間が 10 分間に変更されて電流値の測定が行われ、前記 (9)複合反応系の (i)マルトースホスホ リラーゼー酸性ホスファターゼームタロターゼ系におけるリン酸イオン濃度に対する応 答を調べた。
[0098] 得られた結果は、図 15に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。リ ン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は実施例 8に示される単純反応系の結果 と比較して約 20倍の 10 μ Μから 2mMの範囲で応答が得られ、また、実施例 9に示され る基質増幅反応系の結果と比較して約 2倍の応答が得られ、富栄養化が進んだ環境 水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であることが確認された。
[0099] 実施例 14
実施例 13において、マルトースホスホリラ一ゼの代わりに、脱塩処理されたスクロー スホスホリラーゼ (ルーコノストックメセントロイデス由来)が同活性量で用いられ、前記 (8)基質増幅反応系の (ii)スクロースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロターゼ 系におけるリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。
[0100] 得られた結果は、図 16に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。リ ン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は 0.1— 30mMの範囲で応答が得られ、富 栄養化が進んだ環境水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であること が確認された。
[0101] 実施例 15
実施例 14において、基質液として、 400mMリン酸二水素カリウムを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液力 測定試料液としては、所定濃度のスクロースを 含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、スクロース濃度に対する 応答を調べた。
[0102] 得られた結果は、図 17に示される。なお、各数値は、 n=3の平均値を示している。ス クロースに対する本バイオセンサの応答は、 0.3— 30mMの範囲で得られた。
[0103] 実施例 16
実施例 13におレ、て、測定試料液として以下の物質を超純水に溶解したものが用レヽ られた。
'コントローノレ： 2mMリン酸ィ才ン
• lOmMァセトァミノフェンおよび 2mMリン酸イオン
[0104] 得られた結果は、次の表 1および図 18に示される。
表 1
Figure imgf000032_0001
[0105] 比較例 6
実施例 16において、バイオセンサとして、バイオセンサ上のメディエーターを含む 試薬層が水で洗い流されたものが用いられた。
[0106] 得られた結果は、次の表 2および図 19に示される。
表 2
Figure imgf000032_0002
[0107] 以上の結果に示されているように、過酸化水素系 (比較例 6)では、メディエーター系
(実施例 16)に比べて著しい応答の減少がみられた。また、フェリシアン化カリウムをメ ディエーターとして使用することにより、試料液中の溶存酸素をメディエーターとする 過酸化水素系に比べて大きな出力値を得ることができ、測定の精度が向上すること が確認された。
[0108] 実施例 17
実施例 13におレ、て、測定試料液として以下の物質を超純水に溶解したものが用レヽ られ、環境水をはじめ食品および体液などに含まれる夾雑物質のセンサ応答への影 響を調べた。
'コントロール： 2mMリン酸ィ才ン
•人工海水： 2.65% NaCl, 0.326% MgCl ， 0.207% MgSO , 0.136%
CaSO , 0.0714% KC1および 2mMリン酸イオン
•0.3mMァスコルビン酸および 2mMリン酸イオン
- lppm尿酸および 2mMリン酸イオン
• lppmアンモニゥムイオンおよび 2mMリン酸イオン
• lppmドデシル硫酸ナトリウムおよび 2mMリン酸イオン
• lppm塩化ベンザルコニゥムおよび 2mMリン酸イオン
• lppmリグニンおよび 2mMリン酸イオン
•4ppm無機陰イオン： lppmF— , lppmNO ", lppmNO— , lppmSO 2お
よび 2mMリン酸イオン
卜 り + 卜
•5ppm直金属： lppmし u , lppmZn , lppmMn , lppmし r ,
lppmFe3+および 2mMリン酸イオン
得られた結果は、次の表 3および図 20に示される。これらの結果に示されているよう に重金属イオンおよび人工海水に含まれるリン酸イオンに対するセンサ応答がコント ロールと比べてやや低レ、応答を示してレ、るものの、それらの応答比は何れも 90%程 度であった。この結果より、従来の溶存酸素および過酸化水素検出系の電気化学的 な方法や化学発光を用いる方法と比べて夾雑物質の影響を確実に低く抑えられるこ とが示された。
表 3
試料液 \応答（ 1回目 2回目 3回目 平均 応答率<½)
=|ントロ ル 102.0 101.1 89.3 97.5土 71 100.0土 7.1 7.3
0.3 mMァスコルビン醇 83.0 92.5 94.3 S9.9 ± 6.0 92.3 ± 6.6 6.7
1 ppm尿酸 98.2 93.2 99.6 98.7土 0.8 101.2 ± 0.8 0.8
1 ppmアンモニゥムイオン 102,0 Θ3.8 94.9 96.9 ± 4.4 99.4土 4.4 4.6
1 pmド'ザ'シル硫 ナ リウム 107.6 93.8 93,2 93.2 ± 2,0 100.7 ± 8.1 8.3
1 ppm塩化ペンザルコニゥム 100.6 92.3 97.2 96.7 ± 4.2 99.2 ± 4.2 4.3
1 pm Uフニン 91.0 97.6 90.2 92.9 ± 4.1 95.3 ± 4.3 4.4
4 ppm無探盡イオン 92.8 87.7 89.9 90.1 土 2.6 92.5 ± 2.8 2.9
5 ppm童金 87.4 82.5 S9.7 86,5土 3.7 S8.7 + 4.1 4.3 人工海水 84.6 81.2 S5.5 83.8土 2,3 85.9 ± 2.7 2.7
[0110] 実施例 18
つづいて、このバイオセンサを使用して、前記 (8)基質増幅反応系の (i)マルトースホ スホリラーゼー酸性ホスファタ一ゼ系を参考例 2で用いられたバイオセンサに応用し、 基質であるマルトースおよびリン酸イオンが十分に存在する条件下、酸性ホスファタ ーゼ活性とセンサ応答値との関係を調べた。実施例 8と同様に脱塩処理されたマルト ースホスホリラーゼおよびグルコースォキシダーゼを、氷冷中の pH6.5、 20mMクェン 酸ナトリウム緩衝溶液に 0.4unit/ / lとなるように溶解した。また、基質液としては、 400mMマルト一スおよび 400mMリン酸二水素カリウムを含む pH6.5、 20mMクェン酸 ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、実施例 9と同様に脱塩処理された酸性 ホスファターゼを所定濃度となるように氷冷中の pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩 衝溶液に溶解したものが用いられた。次に、マルトースホスホリラーゼおよびダルコ一 スォキシダーゼを含む溶液 2.5 μ 1と反応基質液 2·5 β 1とを良く混合した後、測定試料 液 5 μ ΐを混合したものをバイオセンサに導入し、正確に 10分間反応させた後、サイク リックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。
[0111] 得られた結果は、図 21に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。酸 性ホスファターゼ活性とセンサ応答値との関係は試料液中の酵素活性が 0.02 0.2unit/lの範囲で直線的な応答を示した。これらの結果から、本センサでのリン酸ィ オンの定量法を応用することで前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファタ一 ゼ活性の測定に用いることが可能であることが確認された。
[0112] 実施例 19
実施例 8におレ、て、測定試料液として所定濃度のピロリン酸イオンを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 2.5 μ 1および脱塩された無機ピロホスファターゼ (パ ン酵母由来)を 0.4unit / μ ΐとなるように pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液に溶 解したもの 2.5 μ ΐとを混合し、 5分間反応させたものが用いられ、前記 (10)無機ピロホ スファターゼ系のピロリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。
[0113] 得られた結果は、図 22に示される。なお、各数値は、 η=3の平均値を示している。ピ 口リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、 1一 lOOmMの範囲で得られた。
[0114] 実施例 20
実施例 19において、測定試料液として 10mMピロリン酸イオン、 lOmM ATPまたは 10mM dNTPsを含む pH6.5、 20mMクェン酸ナトリウム緩衝溶液 2.5 μ 1および脱塩され た無機ピロホスファターゼを 0.4unit / /i lとなるように ρΗ6·5、 20mMクェン酸ナトリウム 緩衝溶液に溶解したもの 2.5 / 1とを混合し、 5分間反応させたものが用いられた。
[0115] 得られた結果は、表 4および図 23に示される。これより、核酸検出の基質として必要 とされる ATPおよび dNTPには無機ピロホスファターゼが反応しないことが確認された 表 4
Figure imgf000035_0001
産業上の利用可能性
[0116] 本発明に係るリン酸イオン濃度の測定法を用いることにより、例えば海水中に含ま れるリン酸イオンを、妨害物質の影響を受けることなく測定することが可能となり、環 境測定、医療、食品などの各分野において有効に利用することができる。また血糖セ ンサの応用により、環境水中のリン酸イオンの測定を目的としたセンサを製作すること ができ、また、ピロリン酸イオンを測定することにより、携帯型の SNP診断、超高感度ゥ ィルス検出にも有効に利用することができる。さらに、リン酸イオン以外の基質を十分 に存在させた場合には、酸性ホスファターゼの活性の測定が可能となり、前立腺の腫 瘍マーカーの検出による診断への応用も可能である。
図面の簡単な説明
[図 1]血糖センサのグノレコースに対する応答性を示すグラフである
[図 2]ピルビン酸ォキシダーゼ系における、 TPP、 FADおよびマグネシウムイオンの要 否を検討した結果を示すグラフである
[図 3]ピルビン酸ォキシダーゼ系における本バイオセンサの TPPに対する応答性を示 すグラフである
[図 4]ピルビン酸ォキシダーゼ系における本バイオセンサのピルビン酸に対する応答 十生を示すグラフである
[図 5]ピルビン酸ォキシダーゼ系における本バイオセンサのピルビン酸ォキシダーゼ 活性に対する応答性を示すグラフである
[図 6]ピルビン酸ォキシダーゼ系における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応 答性を示すグラフである
[図 7]ピルビン酸ォキシダーゼ系における本バイオセンサと従来法との比較を示すグ ラフである（ a) 日本庭園、 b)カスケード 溜池）
[図 8]基質増幅反応系であるピルビン酸ォキシダーゼ一酸性ホスファターゼ系におけ る本バイオセンサの pHに対する応答性を示すグラフである
[図 9]血糖センサのグノレコースに対する応答性を示すグラフである
[図 10]単純反応 (マルトースホスホリラーゼームタロターゼ)系における本バイオセンサ のリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
[図 11]基質増幅反応 (マルトースホスホリラーゼ-酸性ホスファターゼ)系におけるリン 酸イオンに対する応答性を示すグラフである [図 12]複合反応 (マルトースホスホリラ一ゼー酸性ホスファターゼームタロターゼ)系に おける本バイオセンサの pHの影響を示すグラフである
[図 13]複合反応 (マルトースホスホリラ一ゼー酸性ホスファターゼームタロターゼ)系に おける反応時間と本バイオセンサの応答性との関係を示すグラフである
[図 14]複合反応 (マルトースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロターゼ)系に おける本バイオセンサのマルトースに対する応答性を示すグラフである
[図 15]複合反応 (マルトースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロターゼ)系に おける本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
[図 16]基質増幅反応 (スクロースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロターゼ)系 における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
[図 17]基質増幅反応 (スクロースホスホリラーゼ—酸性ホスファターゼ—ムタロターゼ)系 における本バイオセンサのスクロースに対する応答性を示すグラフである
[図 18]複合反応 (マルトースホスホリラ一ゼー酸性ホスファターゼームタロターゼ)系に おける本バイオセンサのァセトァミノフェンの影響を示すグラフである
園 19]過酸化水素系におけるァセトァミノフェンの影響を示すグラフである
[図 20]複合反応 (マルトースホスホリラ一ゼー酸性ホスファターゼームタロターゼ)系に おける本バイオセンサの各種夾雑物質の影響を示すグラフである
園 21]基質増幅反応 (マルトースホスホリラーゼ-酸性ホスファターゼ)系における酸性 ホスファターゼ活性に対する応答性を示すグラフである
園 22]無機ピロホスファターゼ系における本バイオセンサのピロリン酸イオンに対する 応答性を示すグラフである
[図 23]無機ピロホスファターゼ系における本バイオセンサの ATPおよび dNTPに対す る応答性を示すグラフである

Claims

請求の範囲
[1] リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して酸化物となる基質とこの酸化物を生成する ための反応を触媒する酸化還元酵素の存在下で反応させるに際し、酸化型メデイエ 一ターを共存させることにより生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより 生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性'定量法。
[2] リン酸イオンを、ピルビン酸ォキシダーゼ、マグネシウムイオン、フラビンアデニンジ ヌクレオチド、チアミンピロリン酸および酸化型メディエーターの存在下でピルビン酸 と反応させ、ァセチルリン酸と共に生じた還元型メディエーターをさらに酸化すること により生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性 ·定量法。
[3] ァセチルリン酸に酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを作用させ、リ ン酸を再生することを特徴とする請求項 2記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[4] リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して最終的に β _D-グルコースを生成する基質 と、この β -D-グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素の存在下で反応 させて β -D-グルコースを生成させ、さらに生成した β -D-グルコースを、酸化還元酵 素の存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさら に酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性'定 量法。
[5] リン酸イオンを、マルトースホスホリラ一ゼの存在下でマルトースと反応させて β -D- グノレコース _1_リン酸を生成させ、さらに生成した /3 -D-グノレコース _1_リン酸を酸性ホ スファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、 β -D -グルコースおよびリン 酸を生成させ、得られた β -D-グルコースをグルコースォキシダーゼおよび Ζまたは グノレコースデヒドロゲナーゼの存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還 元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とす るリン酸イオンの定性'定量法。
[6] リン酸イオンを、マルトースホスホリラ一ゼおよびマルトースと共に、またはこれらの 代わりに、スクロースホスホリラーゼの存在下でスクロースと反応させて a -D-ダルコ ース -1-リン酸を生成させ、生成した a -D-グルコース- 1-リン酸を酸性ホスファターゼ またはアルカリ性ホスファターゼを用いて、 α -D-グルコースおよびリン酸を生成させ 、さらに生成した a -D-グルコースにムタロターゼを作用させて β -D-グルコースを生 成させ、得られた β -D-グルコースをグルコースォキシダーゼおよび/またはダルコ 一スデヒドロゲナーゼの存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メ ディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸 イオンの定性 ·定量法。
[7] 酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、 j3 _D-グルコースお よびリン酸を生成させると共に、またはこれの代わりに、 /3 -D -グルコース- 1-リン酸と 共に得られたひ- D -グルコースにムタロターゼを作用させて j3 -D-グルコースを生成 させる請求項 5記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[8] 酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、 ひ -D-グルコースお よびリン酸を生成させると共に、またはこれの代わりに、 ひ- D -グルコース- 1-リン酸と 共に得られたフルクトースにグルコースイソメラーゼを作用させて β _D-グルコースを 生成させる請求項 6記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[9] 酵素反応の基質であるリン酸イオンを、基質のリサイクル反応を起こす組み合わせ によって検出することを特徴とする請求項 3、 5または 6記載のリン酸イオンの検出方 法。
[10] 酸化型メディエーターとして、フェリシアン化カリウム、フエ口センまたはパラべンゾキ ノンが用いられる請求項 1乃至 9のいずれかに記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[11] リン酸イオンとして、ピロリン酸イオンに無機ピロホスファターゼを作用させたものが 用いられる請求項 1乃至 10のいずれかに記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[12] 核酸の検出、核酸特異配歹 1Jまたは核酸のシークェンス、核酸増幅反応および受容 体の挙動のモニタリング、リン酸イオンまたはピロリン酸イオンが触媒反応に関与する 酵素の活性測定に用いられる請求項 1乃至 11のいずれかに記載のリン酸イオンの 定性 ·定量法。
[13] リン酸イオンが触媒反応に関与する酵素がピルビン酸ォキシダーゼまたは前立腺 の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼである請求項 12記載のリン酸イオン の定性 ·定量法。
[14] リン酸イオン以外の基質が 10mM以上の濃度で用いられる請求項 13記載のリン酸ィ オンの定性 ·定量法。
[15] 連結酵素 (リガーゼ)の触媒作用により生成するピロリン酸イオンを検出することで、 遺伝子多型 (SNPs)の検出を可能とする請求項 11記載のリン酸イオンの定性'定量法
[16] リン酸イオンの検出に、酸化型メディエーターを使用した既製のセンサが用いられ る請求項 1乃至 15のいずれかに記載のリン酸イオンの定性'定量法。
[17] 酸化型メディエーターを使用した既製のセンサが血糖センサである請求項 16記載 のリン酸イオンの定性'定量法。
[18] 基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、請求項 1乃至 15記載のいずれか に記載の酵素および試薬が作用極上および Zまたはその付近に配置されたリン酸ィ オンセンサ。
[19] 請求項 18記載のバイオセンサと、バイオセンサの電極における電気的な値を計測 する計測部と、計測部における計測値を表示する表示部と、計測値を保存するメモリ 一部とを備えたバイオセンサ装置。
[20] 計測部における計測方法としてポテンシャルステップクロノアンべロメトリー法、クー ロメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法が適用される請求項 19記載のバイオ センサ装置。
[21] さらにバイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段を備え、無線手段 が非接触型 ICカードまたは短距離無線通信である請求項 19または 20記載のバイオ センサ装置。
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