JP3178122B2 - 乳酸、ピルビン酸の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用した迅
速かつ簡便な乳酸、ピルビン酸の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピルビン酸は解糖系の中間代謝物で、乳
酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸をはじめ各種有機酸の出発
物質である。また解糖系のみならず、アミノ酸代謝や脂
肪酸代謝等でも重要な役割を果たしている。そのため体
液や血液中のピルビン酸濃度の測定、あるいは代謝系酵
素の活性測定の際の基質あるいは生成物としてピルビン
酸の定量価値は大きい。またアルコール発酵や乳酸発酵
等の発酵工程において発酵異常の際にピルビン酸が生成
する。

【０００３】一方、乳酸は代謝系や乳酸発酵において、
ピルビン酸から乳酸脱水素酵素の作用で生成する。代謝
系においてはピルビン酸から生成する乳酸はＬ体のみで
あるが、乳酸発酵において、特に乳酸菌ではＤ体または
Ｌ体のみを生成するもの、Ｄ体とＬ体の混合物を生成す
るもの等が知られている。そのためＬ−乳酸、Ｄ−乳
酸、ピルビン酸を測定することは、発酵制御、コンタミ
ネーションの発見等に欠かせないものである。

【０００４】従来、Ｄ−乳酸の測定は、Ｄ−乳酸脱水素
酵素（以下Ｄ−ＬＤＨと略す）と補酵素ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）をもちい
て、生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと略す）もしくはピルビン酸を吸光
光度法、蛍光強度法で測定していた。しかし、この測定
法では、Ｄ−ＬＤＨの性質より様々な問題があった。

【０００５】第１に、反応効率が低いため、実用的なレ
ベルでは必要とする酵素量が多く、分析コストが高くな
る。用いる酵素量を減少させるためには、反応時間を長
くしたり、反応温度を調節するという手段が考えられる
が、さらに繁雑な操作や測定時間の延長等のマイナス要
因となっていた。第２点として、Ｄ−ＬＤＨの関与する
反応の平衡はＮＡＤＨとピルビン酸からＤ−乳酸を生成
する方向に傾いているため、全てのＤ−乳酸が変化しつ
くす前に反応が停止してしまう。そのため生成したピル
ビン酸を、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ
により消費する等の手段が必要であり、反応工程が複雑
化するとともに分析コストが上昇していた。

【０００６】また、Ｄ−乳酸のみでなく、Ｌ−乳酸も測
定する場合には、Ｄ−乳酸と同様の測定をＬ−乳酸脱水
素酵素（以下Ｌ−ＬＤＨと略す）を用いて行い、その後
もう一回Ｄ−乳酸を分析する必要がある。そのため操作
は複雑となり、測定時間、コストが２倍になる。また、
ピルビン酸の測定方法には、このＬ−ＬＤＨとＮＡＤＨ
を用いる方法、あるいはピルビン酸酸化酵素を用いる方
法がある。Ｌ−ＬＤＨとＮＡＤＨを用いる方法は、Ｌ−
乳酸の測定とは逆にＮＡＤＨの減少量を吸光光度法によ
り測定するものである。しかし、Ｄ，Ｌ−乳酸とピルビ
ン酸の両方の値を求めるためには乳酸は別の測定法で測
定しなければならない。

【０００７】このように乳酸脱水素酵素を用いる測定方
法では、その反応の一般的検出手段が反応により変化す
るＮＡＤもしくはＮＡＤＨの紫外域における吸光度変化
であり、試料の濁りや着色物質の影響を受けやすいとい
う欠点があった。その他の方法としてピルビン酸酸化酵
素の反応を利用することもできる。この方法では補酵素
としてチアミンピロホスフェートとフラビンアデニンジ
ヌクレオチド、活性化因子としてマグネシウム、カルシ
ウム、コバルト、マンガン等の２価イオンを必要とす
る。そして無機リン酸と酸素よりアセチルリン酸、二酸
化炭素、過酸化水素を生成する。しかし、この酵素を用
いる方法は酵素の安定性が悪く、高価な補酵素を大量に
必要とするため実用的ではない。

【０００８】一方、Ｌ−乳酸を測定する方法にはＬ−乳
酸酸化酵素（以下ＬＯＤと略す）を用いる方法がある。
この方法ではＬ−乳酸と酸素より過酸化水素とピルビン
酸を生成する。この反応では補酵素は必要としない。こ
の反応で生成する過酸化水素の量を分光光度計で測定す
ればＬ−乳酸の測定ができるが、比色法は前述したよう
な問題点があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】つまり、従来開示され
たＬ−乳酸とＤ−乳酸およびピルビン酸の測定方法で
は、充分実用的な測定方法とは言い難い。本発明は、酵
素反応して、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、ピルビン酸を短時間
で精度良く簡便に測定することができる測定方法を提供
することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）試料中のＬ−乳酸を測定する工程、 （ｂ）試料中の乳酸をＬ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱
水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
存在下でＬ−乳酸とＤ−乳酸の平衡状態とした後にＬ−
乳酸を測定し、このＬ−乳酸量よりＬ−乳酸とＤ−乳酸
の総量を求める工程、 を含む、Ｌ−およびＤ−乳酸を測定する測定方法であ
る。

【００１１】 本発明は、においてＬ−乳酸を測定
する工程が、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体によりＬ−乳酸
を酸化し、増加または減少する電極活性物質を検出する
ことによるＬ−およびＤ−乳酸を測定する測定方法であ
る。

【００１２】尚、上記の測定方法において、Ｌ−乳酸
脱水素酵素を水溶液ではなく、酵素固定化体として例え
ばカラムに充填して用いることもできる。ただし、Ｌ−
乳酸脱水素酵素を水溶液として利用する方が、測定装置
にＬ−乳酸酸化酵素固定化体のみを装着すれば良く、装
置の構成を単純化できる利点がある。

【００１３】また、本発明は、（ａ）試料中のＬ−乳酸を測定する工程、 （ｂ）試料中の乳酸をＬ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱
水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
存在下でＬ−乳酸とＤ−乳酸の平衡状態とした後にＬ−
乳酸を測定し、このＬ−乳酸量よりＬ−乳酸とＤ−乳酸
の総量を求める工 程、 （ｃ）試料中のピルビン酸を、Ｌ−乳酸脱水素酵素とニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体の存在下で
Ｌ−乳酸へ変換し、変換により生じたＬ−乳酸と試料に
元来含まれていたＬ−乳酸との総量を測定する工程、を
含むＬ−乳酸、Ｄ−乳酸およびピルビン酸の測定方法で
ある。

【００１４】

【作用】Ｌ−ＬＤＨ、Ｄ−ＬＤＨの反応を次式に示す。

【００１５】 Ｌ−ＬＤＨ反応： Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン酸＋ＮＡＤＨ Ｄ−ＬＤＨ反応： Ｄ−乳酸＋ＮＡＤ→ピルビン酸＋ＮＡＤＨ

【００１６】どちらの反応も可逆的であるが、どちらの
酵素も平衡は乳酸とＮＡＤが生成する方向に傾いてい
る。そのためＬ−ＬＤＨはＮＡＤＨの存在下でピルビン
酸をほぼ１００％Ｌ−乳酸に変換する。そして、Ｌ−Ｌ
ＤＨはＮＡＤの存在下ではＬ−乳酸をほとんどピルビン
酸へ変換しない。Ｄ−ＬＤＨについても同様である。し
かし、本発明者等は乳酸にＮＡＤの存在下でＬ−ＬＤＨ
とＤ−ＬＤＨを作用させると、Ｄ−乳酸とＬ−乳酸が略
１：１の平衡状態に達すること（ラセミ化）を見いだし
た。そのため、これらの反応とＬ−乳酸に特異的な検出
法を用いれば、試料のＬ−乳酸、Ｄ−乳酸、ピルビン酸
を測定することができる。

【００１７】つまり、 （ａ）Ｌ−乳酸測定：試料をそのまま測定し、Ｌ−乳酸
の量を求める。 Ｌ−乳酸測定は、Ｌ−乳酸に選択的な方法で測定しなけ
ればならない。具体的にはＬＯＤを用いた測定法が利用
できる。 ＬＯＤの反応を次式に示す。 Ｌ−乳酸＋Ｏ₂ →ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ この反応は、不可逆反応なのでピルビン酸が共存しても
測定値に影響は無い。また、Ｄ−乳酸、ＮＡＤ、ＮＡＤ
Ｈが共存していても影響されない。

【００１８】ＬＯＤを用いたＬ−乳酸の定量には、例え
ば減少した酸素または増加した過酸化水素等を検出すれ
ばよい。これには、酸素、過酸化水素の増減等を電極に
よって電流値に変換して測定する電気化学的測定法が分
光光度計を用いる測定と比較して試料の濁りや、着色物
質を含んでいても影響されず、操作が簡単であり好まし
い。ＬＯＤによりＬ−乳酸を定量する際にＬＯＤと直接
電子移動を行えるフェリシアン化カリウム、ベンゾキノ
ン等のメディエーターを共存させ、このメディエーター
の酸化還元を測定することにより実施することもでき
る。

【００１９】（ｃ）Ｄ−乳酸測定：試料をＬ−ＬＤＨと
Ｄ−ＬＤＨとＮＡＤのもとで反応させ、略ラセミ化させ
た後Ｌ−乳酸を測定する。ラセミ化させた後のＬ−乳酸
量より試料中に含まれていた全乳酸量を求めることがで
きる。これからＬ−乳酸の値を差し引くとＤ−乳酸の値
が得られる。 （ｃ）におけるラセミ化反応は、Ｌ−ＬＤＨとＤ−ＬＤ
Ｈの活性比にかかわらず広い範囲で可能である。Ｄ−Ｌ
ＤＨに対するＬ−ＬＤＨの比率は、活性で表した場合略
１／１０から略２０倍まで用いることができるが、１／
２〜１０倍の範囲が好ましく、より好ましくは１／２〜
５、更に好ましくは１〜５である。また、この反応の場
合ＮＡＤは必要ではあるがリサイクルされるので、試料
の乳酸濃度の略１／２０から略１０倍まで用いることが
できる。１／１０〜５倍の範囲が好ましく、より好まし
くは１／５〜４倍である。

【００２０】ただしＬ−ＬＤＨ、Ｄ−ＬＤＨの酵素活性
は、ピルビン酸から乳酸を生成する方向の活性で表され
る。これに対しＬＯＤの酵素活性はＬ−乳酸から過酸化
水素を生成する場合の活性である。上記反応でＬ−乳酸
とＤ−乳酸の比率は一定の値（略１：１）の平衡状態に
なるため、平衡状態になった後にＬ−乳酸の定量を行え
ば、全乳酸量が分かるのである。

【００２１】尚、ラセミ化反応はＬ−ＬＤＨとＤ−ＬＤ
Ｈを架橋剤等で固定化して行うこともできる。ただし、
ＬＤＨの固定化体の反応速度は比較的遅いため、充分な
感度を得るためには固定化体と試料の接触時間を長くす
る必要がある。このことは１試料あたりの分析時間が長
くなることを意味し、大量の検体を一括処理するにはＬ
ＤＨの水溶液を用いる方が便利である。

【００２２】Ｌ−ＬＤＨの起源については、ウシ、ブ
タ、ウサギ、ニワトリ等の内臓や筋肉由来の各種の酵素
を用いることができる。またＤ−ＬＤＨの起源について
は、乳酸菌、細菌等の微生物由来の各種の酵素を用いる
ことができる。

【００２３】（ｂ）ピルビン酸測定：試料をＬ−ＬＤＨ
とＮＡＤＨのもとで反応させ、ピルビン酸をＬ−乳酸に
変換後、Ｌ−乳酸を測定する。測定値は試料中に存在し
ていたＬ−乳酸とピルビン酸より生成したＬ−乳酸を足
しあわせた量に相当するので、これから試料中に存在し
ていたＬ−乳酸の値を差し引いた値からピルビン酸量が
得られる。

【００２４】ピルビン酸よりＬ−乳酸を生成させるＬ−
ＬＤＨ反応においては（ｃ）のラセミ化反応より反応が
進行し易いので、（ｃ）のラセミ化反応で使用するＬ−
ＬＤＨの活性に比べ１／１０程度の酵素量で充分であ
る。このＬ−ＬＤＨ反応において生成するＬ−乳酸と同
モル量のＮＡＤＨが消費されるので、試料中のピルビン
酸より多く、好ましくは２倍モル以上のＮＡＤＨを使用
する。

【００２５】本発明ではＬＯＤは固定化して使用する。
何故なら溶液で使用すると下記のような問題がある。第
１に溶液状態のＬＯＤとＬ−ＬＤＨ、Ｄ−ＬＤＨとＮＡ
Ｄを共存させるとＬ−乳酸のみがＬＯＤで消費されるの
で減少し、ラセミ化反応が起こり、Ｄ−乳酸がどんどん
Ｌ−乳酸へと変化する。そして最終的には全乳酸が過酸
化水素とピルビン酸になる。第２にＬＯＤとＬ−ＬＤＨ
とＮＡＤＨとを共存させると、Ｌ−乳酸より生成したピ
ルビン酸がＮＡＤＨと反応しＬ−乳酸を生じるリサイク
ル反応が起こる。そしてＮＡＤＨが無くなるまで過酸化
水素とピルビン酸を生成する。そしてこのような場合に
は正確なＬ−乳酸の測定が出来なくなる。そのため、あ
らかじめＬＤＨを含む反応液のｐＨを変化させたり、加
熱したりして酵素を失活させねばならず煩雑な操作を伴
うため実用的でない。

【００２６】このような問題は固定化体でも理論的には
予想される。しかし、ＬＯＤの反応速度はＬ−ＬＤＨ、
Ｄ−ＬＤＨに比べ速いので、固定化体を用いた場合であ
れば上記のようなリサイクル反応が影響しない時間で、
反応終了液とＬＯＤ固定化体を接触させることができ測
定が可能となる。この理由は試料に含まれるＬ−ＬＤ
Ｈ、Ｄ−ＬＤＨは緩衝液により希釈されてＬＯＤ固定化
体に接触するため、Ｌ−ＬＤＨ、Ｄ−ＬＤＨの反応は無
視し得るためである。

【００２７】ＬＯＤの起源についてはペディオコッカス
由来の酵素が知られているが他の起源の酵素も用いるこ
とができる。ＬＯＤの固定化方法は、特に限定されず吸
着法、化学結合法、包括法等の公知の方法が利用でき
る。固定化にもちいる担体にはケイソウ土、焼成したケ
イソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、アルミナ、セラ
ミック、カーボン、活性炭、モレキュラーシーブ、シリ
コンゴム、セルロース、アガロース、アミノ酸系ポリマ
ー等が使用できる。固定化酵素の形態は、例えば電極表
面に膜状に固定化する方法、担体に固定化しカラム等に
充填する方法等が考えられる。

【００２８】消費された酸素を測定する酸素電極は、ガ
ルバニ型、クラーク型等各種公知のものを利用できる。
生成する過酸化水素を測定する過酸化水素電極として
は、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、パラジウム
等を用い、カソード側に銀等を用いた公知のものを利用
できる。一般にアノードとしては、過電圧が低く高感度
が得られるという理由から白金を用いることが多い。そ
して電極表面にポリシロキサン、アクリル樹脂、蛋白
膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有している
形式が妨害物除去の観点から望ましい。

【００２９】作用極と対極からなる２電極の過酸化水素
電極、酸素電極を形成してもよいが、安定性、精度の点
から作用極、対極と参照極からなる３電極のものがより
好ましい。

【００３０】本発明ではこのようにして固定化したＬＯ
Ｄと電極を用いてピルビン酸、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸の測
定を行うことができる。具体的には（ａ）先ず、Ｌ−乳
酸またはＬ−乳酸の比率が明確な乳酸の標準液を用いて
検量線を作成する。得られたＬ−乳酸の検量線より試料
のＬ−乳酸濃度を求める。（ｃ）次にＬ−ＬＤＨ、Ｄ−
ＬＤＨとＮＡＤによるラセミ化反応を行い、反応液のＬ
−乳酸濃度より全乳酸量を求める。そして全乳酸量から
（ａ）で求めた試料中に元来存在していたＬ−乳酸量を
差し引いてＤ−乳酸量を求める。この際、例えば試料と
酵素試薬を１：１で混合した場合はラセミ化反応後の測
定値を２倍してＬ−乳酸量を出すことになる。更に、反
応液中の乳酸はＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１の平衡状態
になっているので全乳酸濃度はその２倍となる。従って
この場合はラセミ化反応後のＬ−乳酸測定値を４倍すれ
ば全乳酸量を求めることができる。

【００３１】本発明における乳酸、ピルビン酸はそれぞ
れの遊離の酸およびその塩を示すが、標準液もまた遊離
の酸でも塩でも良い。なかでもリチウム塩は吸湿性等の
点から扱い易い。本発明の方法ではＬ−乳酸、Ｄ−乳
酸、ピルビン酸の３種を測定するにあたり、用意する標
準液はＬ−乳酸の標準液のみで良いので調製や測定に要
する時間が短縮できる。一般に有機酸は不安定であり溶
液での長期保存は難しい。また高純度の試薬は高価であ
り、特にＤ−乳酸リチウムは非常に高価である。またピ
ルビン酸リチウムは溶解し難く扱いにくい。本発明で
は、Ｌ−乳酸リチウムの標準液のみを使用すれば良いの
で操作が簡単でコスト的にも有利である。もちろん、各
々の標準液により検量線を作成しても良いが、１分子あ
たりの感度は同じになる。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００３３】実施例１ （１）ＬＯＤ固定化カラムの製造方法 焼成した珪藻土よりなる耐火レンガ（３０〜６０メッシ
ュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピ
ルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬
した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてア
ミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに
１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガに、ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液にペディオコッカスのＬＯＤ５０ユニッ
ト／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、
０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体
を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填しＬＯ
Ｄ固定化カラムとする。

【００３４】（２）過酸化水素電極の製造方法 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化させて、過酸化水素選択透過膜を白金線上に形成
し、これを過酸化水素電極とした。

【００３５】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。

【００３６】（３）測定装置 図１に示すフロー型測定装置によってＬ−乳酸の測定を
行う。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により
送液し、サンプラ（３）により試料５μｌを注入する。
注入された試料は３０℃の恒温槽（４）中のＬＯＤ固定
化カラム（５）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素が生
成する。そして、過酸化水素電極（６）で電流値の変化
を検出する。電極での電流値の変化は検出器（７）によ
り検出される。さらに信号をパーソナルコンピュータ
（１０）に送ることもできる。

【００３７】緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを
含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は１．０ｍｌ／分
であった。

【００３８】（４）Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸の測定 Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸の混合液につ
いて、試料をそのまま、Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨと
ＮＡＤで反応させＤ−乳酸とＬ−乳酸の１：１の平衡状
態とした反応液の２点について測定した。ラセミ化反応
条件は、試料０．２ｍｌにＬ−ＬＤＨ５０Ｕ／ｍｌ、Ｄ
−ＬＤＨ２０Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１０ｍＭ、リン酸ナトリ
ウム２００ｍＭでｐＨ７．５の試薬を０．２ｍｌ加え６
０分室温で放置した。標準液、試料を５μｌ注入し電流
値を得た。標準液には蒸留水をブランクに、１、２、５
ｍＭのＬ−乳酸を用いた。標準液より検量線を求め、試
料の電流値をＬ−乳酸濃度（ｍＭ）として算出した。検
量線を検量線Ａに示す。Ｘは試料中の乳酸濃度、Ｙは電
流値を示す。また結果を〔表１〕に示す。 検量線Ａ Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝４４．８７Ｘ＋０．５
９

【００３９】

【表１】

【００４０】〔表１〕のは試料中のＬ−乳酸を測定し
た結果であり、その電流値とＬ−乳酸測定値を示した。
はラセミ化反応後のＬ−乳酸による電流値とＬ−乳酸
測定値を示す。Ｄ−乳酸濃度の算出方法は、反応液のＬ
−乳酸濃度を（反応液は１：１で希釈されているので）
２倍し、さらにラセミ化後ではＬ−乳酸は全乳酸の１／
２であるので２倍して全乳酸量を求め、試料に元来含ま
れていたＬ−乳酸測定値を差し引いて求めた。

【００４１】（５）Ｌ−乳酸、ピルビン酸の測定 Ｌ−乳酸、ピルビン酸、Ｌ−乳酸とピルビン酸の混合液
について、試料をそのまま、Ｌ−ＬＤＨとＮＡＤＨ
で反応させピルビン酸をＬ−乳酸に変換した後の２点に
ついて測定した。反応条件は、試料０．２ｍｌにＬ−Ｌ
ＤＨ２Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤＨ１０ｍＭ、リン酸ナトリウム
２００ｍＭでｐＨ７．０の試薬を０．２ｍｌ加え３０分
室温で放置した。標準液、試料を５μｌ注入し電流値を
得た。標準液には蒸留水をブランクに、１、２、５ｍＭ
のＬ−乳酸を用いた。標準液より検量線を求め、試料の
電流値をＬ−乳酸濃度（ｍＭ）として算出した。

【００４２】検量線を検量線Ｂに示す。また結果を〔表
２〕に示す。 検量線Ｂ Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝４１．２１Ｘ＋０．５
３

【００４３】

【表２】

【００４４】〔表２〕のは試料中のＬ−乳酸を測定し
た場合の電流値とＬ−乳酸測定値を示す。はピルビン
酸をＬ−乳酸に変換した後のＬ−乳酸測定値を示す。ピ
ルビン酸濃度の算出方法は、反応後のＬ−乳酸濃度を
（反応液は１：１で希釈されているので）２倍し、試料
のＬ−乳酸測定値を差し引いて求めた。検量線のＹは電
流値（ｎＡ）、Ｘは試料中の乳酸濃度（ｍＭ）とする。

【００４５】（４）と（５）のどちらも標準液の測定値
は理論どおりの値が得られ正確に測定できた。（４）と
（５）は測定日が異なるので若干検量線の勾配に差があ
るが、これは本質的な差ではない。

【００４６】実施例２ （１）ＬＯＤ固定化カラムの製造方法 実施例１と同様にＬＯＤ固定化カラムを作成した。 （２）過酸化水素電極の製造方法 実施例１と同様に過酸化水素電極を作成した。 （３）測定装置 実施例１と同様のＬ−乳酸測定装置を用いた。

【００４７】（４）実試料の測定 市販の乳酸飲料７点について２０〜４０倍に希釈し実施
例１と同様に測定した。希釈液そのまま、希釈液
０．２ｍｌにＬ−ＬＤＨ５０Ｕ／ｍｌ、Ｄ−ＬＤＨ２０
Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１０ｍＭ、リン酸ナトリウム２００ｍ
ＭでｐＨ７．５の試薬０．２ｍｌ、を加え６０分室温で
放置後、及び希釈液０．２ｍｌにＬ−ＬＤＨ２Ｕ／ｍ
ｌ、ＮＡＤＨ１０ｍＭ、リン酸ナトリウム２００ｍＭで
ｐＨ７．０の試薬０．２ｍｌを加え室温で３０分放置し
た後にＬ−乳酸を測定した。標準液、試料を５μｌ注入
し電流値を得た。標準液には蒸留水をブランクに、１、
２、５ｍＭのＬ−乳酸を用いた。標準液より検量線を求
め、試料の電流値をＬ−乳酸濃度（ｍＭ）として算出
し、試料中のＬ−乳酸、Ｄ−乳酸、ピルビン酸のそれぞ
れの濃度（％）を求め〔表３〕に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】 試料の明細 種類 製造販売 商品名 Ａ 乳酸菌飲料 ヤクルト ヤクルト Ｂ 醗酵乳 ヤクルト ジョアプレーン Ｃ 醗酵乳 ヤクルト ジョアマンダリン Ｄ 乳酸菌飲料 サンライト マイサワー Ｅ ヨーグルト 雪印乳業 ヨグール Ｆ 醗酵乳 関西ルナ のむヨーグルト Ｇ ヨーグルト 明治乳業 ブルガリアヨーグルト また、この試料をそれぞれ遠心分離（２００００ｒｐｍ
２０分）した後、ＦキットのＤ／Ｌ−乳酸測定系で測
定した値との相関は次のようになりよく一致した。

【００５０】尚、Ｆキット（ベーリンガー・山之内社）
による測定は下記による。試料にＮＡＤ、グルタミン
酸、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼを加え
混和し、分光光度計により３４０ｎｍの吸光度を測定
し、ブランクとした。さらに、Ｄ−ＬＤＨを加え混和
し、２０分放置後吸光度を測定した。Ｄ−ＬＤＨによる
吸光度変化より試料中のＤ−乳酸濃度を算出した。

【００５１】Ｌ−乳酸測定には、さらにこの反応液にＬ
−ＬＤＨを加え、混和し、２０分放置後吸光度を測定し
た。Ｌ−ＬＤＨによる吸光度変化より、試料中のＬ−乳
酸濃度を算出した。

【００５２】Ｌ−乳酸 Ｙ＝１．０３Ｘ＋０．０１
（相関係数 ０．９９９） Ｄ−乳酸 Ｙ＝１．０２Ｘ−０．００ （相関係数
１．０００） 式のＹは本発明による測定結果、ＸはＦキットによる測
定結果である。

【００５３】本発明による方法では、濁りや着色物質の
影響を受けないので遠心分離等の前処理がいらない。ま
た使用する試薬の数が少なくピペット操作の回数が少な
いので操作が簡単である。また、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸の
測定については、Ｆキット法ではＤ：Ｌの比が大きく異
なるときは測定に使用する試料の希釈率を変えねばなら
ないが、本発明の方法では、Ｌ−乳酸が測定できれば、
例えば全乳酸はその４倍濃度が同一感度で測定できるの
で未知試料の測定の際、やり直しが少なく精度良く測定
できる。

【００５４】

【発明の効果】本発明の酵素反応を利用する測定方法を
用いることにより、Ｌ−乳酸とＤ−乳酸およびピルビン
酸の測定が短時間で正確に簡単にできるようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例で用いたフロー型Ｌ−乳酸測定装
置の図である。

【符号の説明】

１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ 恒温槽 ５ ＬＯＤ固定化カラム ６ 過酸化水素電極 ７ 検出器 ８ シングルボードコンピュータ ９ ＲＳ２３２Ｃコード １０ パーソナルコンピュータ １１ サンプラ制御信号 １２ 送液ポンプ制御信号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−239448（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−103224（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ，175（1985）ｐ．301−304 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）試料中のＬ−乳酸を測定する工程、 （ｂ）試料中の乳酸をＬ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱
   水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
   存在下でＬ−乳酸とＤ−乳酸の平衡状態とした後にＬ−
   乳酸を測定し、このＬ−乳酸量よりＬ−乳酸とＤ−乳酸
   の総量を求める工程、 を含む、Ｌ−およびＤ−乳酸の測定方法。
2. 【請求項２】Ｌ−乳酸を測定する工程が、Ｌ−乳酸酸化
   酵素固定化体によりＬ−乳酸を酸化し、増加または減少
   する電極活性物質を検出することによる請求項１記載の
   Ｌ−およびＤ−乳酸の測定方法。
3. 【請求項３】（ａ）試料中のＬ−乳酸を測定する工程、 （ｂ）試料中の乳酸をＬ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱
   水素酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの
   存在下でＬ−乳酸とＤ−乳酸の平衡状態とした後にＬ−
   乳酸を測定し、このＬ−乳酸量よりＬ−乳酸とＤ−乳酸
   の総量を求める工程、 （ｃ）試料中のピルビン酸を、Ｌ−乳酸脱水素酵素とニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチド還元体の存在下で
   Ｌ−乳酸へ変換し、変換により生じたＬ−乳酸と試料に
   元来含まれていたＬ−乳酸との総量を測定する工程、 を含むＬ−乳酸、Ｄ−乳酸およびピルビン酸の測定方
   法。