JP3156408B2 - 酵素反応を利用した測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用した測
定方法に関し、特にグルタミン酸等各種の物質を測定す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素試薬を用いた測定法は、化学反応を
用いる検出法に比較して、酸、塩基や有機溶剤等の危険
な試薬を使用せず、加熱、抽出等の繁雑な反応操作を行
うことがなく、また廃液の処理等もほとんど考慮する必
要が無い等、安全で環境にもやさしい分析方法である。
また酵素は基質特異性が高く選択性に優れ、反応条件も
穏やかであるという利点がある。

【０００３】そのため従来より酵素反応を利用した各種
の分析方法が知られている。例えば、基質と酸素より酸
化酵素の作用で基質酸化体と過酸化水素が生成する反応
を利用して減少した酸素や増加した過酸化水素を電極法
で検知する方法や、生成した過酸化水素を比色法で定量
する方法が一般的である。また、脱水素酵素を用いた測
定法では、基質に補酵素を添加し脱水素酵素の作用で基
質と補酵素間の酸化還元反応が起こるのを利用して増減
する補酵素を比色法で検出する方法が一般的である。こ
れらの方法のうち最終検出手段が比色法による場合は、
試料の濁り、着色が正確な測定を妨げたり、これらの除
去のため繁雑な前処理が必要となる等の問題があった。

【０００４】また、酸化酵素を用いて電極で検出する測
定法は、濁りや着色物質による影響を受けないが、実用
に適する充分な活性を有する酸化酵素の種類が限定され
ているので、多様な測定要求に応えることができなかっ
た。脱水素酵素に関しては、例えば、アルコール脱水素
酵素はエタノールに比べメタノールにはあまり作用しな
いので、メタノールの混在する系でエタノールの測定す
る場合に用いられる。しかし、脱水素酵素の補酵素とし
て利用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下ＮＡＤと略す）等を再現性よく電極法で測定する
ことは困難であり、単純に脱水素酵素を利用することは
できない。

【０００５】また、Ｌ−グルタミン酸は食品のうまみ成
分として良く知られているアミノ酸であり、各種の食品
に添加されており、多くの測定対象のなかでも、Ｌ−グ
ルタミン酸に対する測定要求は高い。グルタミン酸の測
定は、アミノ酸分析計での測定や、ピログルタミン酸に
変換したのち有機溶媒で抽出し化学的に定量する方法
や、比色法等が多く用いられてきたが、前処理が面倒で
ある等の問題が残っている。

【０００６】またＬ−グルタミン酸に作用する酸化酵素
としてＬ−グルタミン酸酸化酵素が知られている。この
酵素は、Ｌ−グルタミン酸と酸素より、α−ケトグルタ
ル酸とアンモニアと過酸化水素を生成する。この酸化酵
素と電極を組み合せるとＬ−グルタミン酸の測定が可能
となるはずである。しかし、Ｌ−グルタミン酸酸化酵素
の比活性は低く充分な感度を得ることは困難である。ま
た、基質濃度と生成する過酸化水素もしくは減少する酸
素の量に比例関係が成立する範囲が狭く、実試料の希釈
率が大きくなり、実用に適さないという問題もあった。

【０００７】一方、Ｌ−乳酸はみそ、しょうゆ、乳製品
等の発酵工程により製造される食品に多く含まれており
グルタミン酸と同時に測定する必要性が高い。しかし、
従来はＬ−グルタミン酸とＬ−乳酸の測定は独立して行
われており、連続して簡便に測定する方法はなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の酸化
酵素のみを利用した電気化学的測定では充分な活性を有
する酵素の種類が少なく、測定対象が限られていた等、
上記の問題を解決し、様々な物質を測定出来る方法を提
供することを目的とする。また、多様な測定物質を精度
良く簡便に測定することができる方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記の各構成
に要約することができるが、これらに限定されるもので
はない。

【００１０】（１） ａ．基質還元体Ｘred を含み得る
試料、Ｘred と補酵素酸化体Ｃoxより基質酸化体Ｘoxと
補酵素還元体Ｃred を生成する反応を触媒する第１の脱
水素酵素Ｅ1 、補酵素酸化体Ｃox、補酵素還元体Ｃred
と第２の基質酸化体Ｙoxより第２の基質還元体Ｙred と
Ｃoxを生成する第２の脱水素酵素Ｅ2 、及び第２の基質
酸化体Ｙoxを含む反応系で、第２の基質還元体Ｙred を
生成させる工程、ｂ．生成したＹred を測定する工程、
を有する試料中のＸred 量を求める測定方法。

【００１１】（２） ｂ．生成したＹred を測定する工
程が、Ｙred を、Ｙred の酸化反応を触媒する酸化酵素
Ｅ3 の固定化体に接触させ、減少または増加する電極活
性物質の変化量を電気化学的に検出することによる
（１）記載の測定方法。

【００１２】（３） 酸化酵素Ｅ3 の反応により減少ま
たは増加する物質が酸素または過酸化水素である（２）
の測定方法。

【００１３】（４） ｃ．更に試料中のＹred 量を測定
する工程を有し、前記ｂ．工程で求めたＹred の測定値
を、ｃ．工程で求めた試料中に元来存在していたＹred
量で補正する（１）記載の測定方法。

【００１４】（５） （１）において、Ｘred がＬ−グ
ルタミン酸であり、Ｅ1 がＬ−グルタミン酸脱水素酵素
であり、Ｃoxがニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
酸化型であり、Ｅ2 がＬ−乳酸脱水素酵素であり、Ｙox
がピルビン酸であり、Ｙred がＬ−乳酸であるＬ−グル
タミン酸測定方法。

【００１５】（６）（２）において、Ｙred がＬ−乳酸
であり、Ｅ３がＬ−乳酸酸化酵素であるＬ−グルタミン
酸測定方法。

【００１６】

【作用】図２に本発明の酵素反応を示す。本発明のａ．
工程では、第１の脱水素酵素Ｅ１反応と第２の脱水素酵
素Ｅ２反応を複合させて、試料中のＸred量に対応した
量のＹredを生成させるが、まず脱水素酵素Ｅ１が測定
対象物である基質還元体Ｘred を酸化する反応を説明す
る。一般的な脱水素酵素Ｅ１の反応式は以下のように示
される。ただし、基質還元体をＸred 、補酵素酸化体を
Ｃoxとし、基質酸化体をＸox、補酵素還元体をＣred と
する。 Ｅ１： Ｘred ＋Ｃox→Ｘox＋Ｃred

【００１７】この反応は可逆的であるが反応の平衡はほ
とんどの場合、Ｘred とＣoxが生成する方向に偏ってい
る。そのため、Ｅ1 を単独で用いＸred とＣoxを作用さ
せても、ほとんどＸred はＸoxに変化しないので、生成
してきたＸoxもしくはＣredを別の物質に変換し平衡を
ずらして反応を進行させる必要がある。またこのＸoxも
しくはＣred の消費反応はＥ1 の反応と同時に行わなけ
れば効果が無いので、同様の条件で反応させることがで
きる酵素を使用した反応が考えられる。そして、本発明
ではＥ1 の反応に利用される補酵素Ｃを共有する第２の
脱水素酵素Ｅ2を利用することに特徴を有する。還元さ
れた補酵素Ｃred を再酸化する反応を組み合せて、補酵
素をリサイクルし、高価な補酵素の使用量を少量で反応
を行うことにより、分析コストを低減させることができ
る。

【００１８】また、脱水素酵素であれば反応の平衡状態
が、ほとんどの場合基質還元体Ｙredと補酵素酸化体Ｃo
xが生成する方向へ偏っているので使用することが出来
る。上記のＥ１の反応系に更に第２の脱水素酵素Ｅ2 と
第２の基質酸化体Ｙoxを添加し、下記Ｅ２の反応を複合
させる。 Ｅ2 ： Ｃred ＋Ｙox→Ｃox＋Ｙred 本発明ではＸred と当mole以上のＹoxを添加するもので
あり、１moleのＸred より１moleのＹred が生成させる
ことができる。次にｂ．工程として、生成したＹred を
測定すれば、試料中のＸred 量を求めることができる。

【００１９】Ｙred の定量にはＹred に特異的に作用す
る酸化酵素Ｅ３を使用する方法が好ましい。Ｅ3 の代表
的な反応は下記に例示されている。 Ｅ３： Ｙred ＋Ｏ₂ →Ｚox＋Ｈ₂ Ｏ ₂ この酸化酵素の例では酸素より過酸化水素を生成する一
方向の反応であり、Ｚoxが共存していても反応には影響
がなく、またＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存して
いても影響がない。Ｅ1 及びＥ２の酵素はＥ３の反応を
阻害したり、Ｅ3 の反応によって阻害されないので失活
させる必要はない。Ｅ３反応の検出方法は電気化学的検
出等があるが、これについては後に記載する。

【００２０】本発明において補酵素酸化体Ｃoxが脱水素
酵素Ｅ1 で還元されＣred になり、さらにＥ2 で酸化さ
れＣoxに戻る。このため見かけ上はＣoxは反応に関与し
ていないかのようであるが、電子伝達体としてリサイク
ルしている。したがって、本発明ではＥ１反応系にＣox
を添加するが、たとえＣox量が試料中のＸred 量より少
ない場合でもＸred を完全にＹred に変換することがで
きる。測定を行う上でＸredとＹredの間の変換係数は必
ずしも１００％である必要はなく、予め決められた係数
に従って計算ができる。つまり、１００％反応が終了す
るまでに反応を停止させ、速度論的にＸred濃度を求め
ることもできる。ただし、反応を完結させることにより
正確な反応時間の制御が不必要となるため実用的に好ま
しい。

【００２１】このような反応条件を達成するためには、
反応系に加えるＹoxの量は試料Ｘred 量より多くなくて
は、すべてのＸred を酸化させることはできない。試料
がＸred 以外にＹred を含む場合は、工程ｃ．として試
料中のＹred 量をまず測定しておき、次に試料中のＸre
d からＹred への変換反応を行なった後のＹred を測定
し、両者の差からＹredの増加量を求めて、Ｘred の量
を求める必要がある。

【００２２】脱水素酵素Ｅ１、Ｅ２の反応は同時に進行
させるが、酸化酵素Ｅ３の反応は別段階で行うのでＹre
d の酸化により生成するＺoxはＹoxと同一であっても構
わない。また、Ｘred は反応系に補酵素酸化体Ｃoxを添
加するので酸化酵素Ｅ３により生成するＺoxとは反応し
ない。このためＸred のリサイクルは起こらない。本発
明において測定できる基質還元体Ｘred と、測定に用い
る酵素の組み合わせの例を表１から表３に示す。

【００２３】表１はＣoxの存在下で脱水素酵素Ｅ１によ
り基質還元体Ｘred を酸化し、基質酸化体Ｘoxを生成す
る反応を例示したものである。

【００２４】

【表１】

【００２５】表２は生成したＣreｄの存在下で第２の基
質酸化体であるＹoxを添加し、第２の脱水素酵素Ｅ２を
作用させて、第２の基質還元体Ｙred を生成させるａ．
工程を示す。またＹred を酸化する酸化酵素Ｅ３を作用
させて、Ｚoxを生成させる反応の組み合わせを例示して
いる。このＥ３の反応を利用してＹredの定量を行うこ
とが出来る（ｂ．工程）。

【００２６】

【表２】

【００２７】さらに、本発明では、酵素Ｅ０により基質
還元体Ｘred を生成する物質を測定することもできる。
例えば測定物を酵素Ｅ０により基質還元体Ｘred に分解
する工程を行い、次にＸredの定量を行えば、測定対象
物質を拡げることも出来る。

【００２８】

【表３】

【００２９】測定する物質は、脱水素酵素Ｅ1 およびＥ
2 の組み合せにより自由に変えることができる。表１に
示したようにＥ１として各種の脱水素酵素を使用するこ
とができる。

【００３０】例えば、グルタミン酸脱水素酵素を使用し
たグルタミン酸の測定、グリセロール脱水素酵素を使用
したグリセロールの測定、Ｌ−乳酸脱水素酵素を使用し
たＬ−乳酸の測定、アルコール脱水素酵素を使用したア
ルコールの測定、グルコース脱水素酵素を使用したグル
コースの測定、Ｄ−乳酸脱水素酵素を使用したＤ−乳酸
の測定等を例示できる。

【００３１】また、表２に示したようにＥ１の反応系に
ピルビン酸とＬ−乳酸脱水素酵素を添加し、生成したＬ
−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素を用いて測定することができ
る。またＥ１の反応系にアセトアルデヒドとアルコール
脱水素酵素を添加し、生成したエタノールをアルコール
酸化酵素を用いて測定することができる。更にＥ１反応
系にＤ−グルコノ−δ−ラクトンとＤ−グルコース脱水
素酵素を添加し、生成したＤ−グルコースをＤ−グルコ
ース酸化酵素を用いて測定することが出来る。

【００３２】尚、Ｅ１反応に組み合わせるＥ２反応は、
補酵素が一致するものを選ぶ。Ｅ２の要求する補酵素は
Ｅ１と共通していれば、ＮＡＤでもＮＡＤＰ（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）でもよい。即
ち、試料に添加する補酵素がＮＡＤの場合、Ｅ2 とＥ1
はＮＡＤ応答性の脱水素酵素、補酵素がＮＡＤＰの場合
はＮＡＤＰ応答性の脱水素酵素でなければならない。

【００３３】次に、Ｅ２反応により生成したＹred をＥ
３反応を利用して定量する工程を具体的に説明する
（ｂ．工程）。勿論試料中に元来存在していたＹredを
測定するｃ．工程も手法としては同じである。酸化酵素
Ｅ３の反応で生成した過酸化水素の定量は、例えば、パ
ーオキシダーゼと２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベ
ンツチアゾリン）−６−スルホン酸または４−アミノア
ンチピリンをもちいた方法（トリンダー法）等により、
可視部の吸光度を測定することにより測定できる。可視
部の吸光度測定は補酵素の定量に使用する紫外部の吸光
度測定に比べ、濁りの影響を受けにくい。しかし、分光
光度計をもちいる測定は試料の濁りや、着色物質を含ん
でいる場合には正確な測定が困難であり、そのために前
処理を必要とする。

【００３４】この方法に比較して、減少した酸素、また
は生成した過酸化水素を電極によって電流値に変換して
測定する電気化学的測定法は操作が簡単で濁りや着色物
質の影響を受けにくく優れた検出手段である。消費され
た酸素を測定する酸素電極は、ガルバニ型、クラーク型
等各種公知のものを利用できる。

【００３５】生成する過酸化水素を測定する過酸化水素
電極としては、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、
パラジウム等を用い、カソード側に銀等を用いた公知の
ものを利用できる。一般にアノードとしては、過電圧が
低く高感度が得られるという理由から白金を用いること
が多い。そして電極表面にポリシロキサン膜、アクリル
樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜、アルブミン膜
等の選択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去の
観点から望ましい。また、ジクロロインドフェノール、
フェリシアン化カリウム、ベンゾキゾン等の電子伝達
体、所謂メディエーター等を介在させた電極で測定する
ことも出来る。電極系は作用電極、対極より構成される
２電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できるが、安
定性、精度の点から作用電極、参照電極、対極より構成
される３電極のものがより望ましい。

【００３６】尚、溶液状の酸化酵素Ｅ3を利用すること
もできるが、酸化酵素Ｅ3 を固定化して用いていると酵
素の繰り返し利用が可能となり、酵素の反応条件を規定
し易い等の利点がある。また、酸化酵素Ｅ3 固定化体
を、増減する酸素または過酸化水素等の変化量を検出す
る電極と組み合せて使用するとＹred の検出を１段階で
短時間に行うことができ、好ましい。

【００３７】酵素の固定化法は、特に限定されず、吸着
法、化学結合法、包括法等を用いることが出来る。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化にもちいる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガ
ラスビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性
炭、モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、
アガロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学
結合法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミ
ノ基を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性
アルデヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触
させて固定化する方法が好適な例として挙げられる。固
定化酵素の形態は、担体に固定化しカラム等のリアクタ
ーに充填する方法が考えられる。

【００３８】また、Ｌ−乳酸酸化酵素をグルタルアルデ
ヒド、ホルムアルデヒド、サクシニルアデヒド等の架橋
剤で固定した膜を電極に取りつけて使用することもでき
る。膜状に固定化する際にはアルブミン、グロブリン、
ゼラチン等の他のタンパク質を添加してＬ−乳酸酸化酵
素を架橋することもできる。測定に使用する緩衝液は酸
化酵素Ｅ３に適したｐＨで緩衝能があり、電極に電気化
学的な影響を及ぼさないものならよい。

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。

【００３９】実施例１ 試料としてＬ−グルタミン酸試料及びＬ−グルタミン酸
とＬ−乳酸の混合物試料を用い、それぞれの試料にＮＡ
Ｄ、グルタミン酸脱水素酵素、Ｌ−乳酸脱水素酵素、ピ
ルビン酸を接触させ一定時間反応させた後に（ａ．工
程）、Ｌ−乳酸濃度を測定した（ｂ．工程）。

【００４０】Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体を用い、Ｌ−乳
酸が酸化される際に生成した過酸化水素を白金電極で測
定する方法でＬ−乳酸濃度測定を行った。 （１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸酸化酵素（シグマ社製、ペディ
オコッカス由来）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した
溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定
化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３
０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＬ−乳酸酸化酵素
固定化カラムとした。

【００４１】（２）過酸化水素電極の製造 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して選択透過膜を形成し、これを過酸化水素電極と
した。また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を
用い、対極には導電性の配管を用いた。

【００４２】（３）Ｌ−乳酸測定装置 フロー型Ｌ−乳酸測定装置を図１に示す。緩衝液槽
（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、サンプ
ラ（３）より試料５μｌを注入する。試料中のＬ−乳酸
が、恒温槽（４）中のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム
（５）内に送液されると過酸化水素が生成し、過酸化水
素電極（６）により電流値の変化が捕らえられ検出器
（７）により検出される。さらに信号をパーソナルコン
ピュータ（１０）に送ることもできる。緩衝液の組成は
１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、
１ｍＭアジ化ナトリウムを含みｐＨ７．０である。

【００４３】（４）測定方法 Ｌ−グルタミン酸試料及びＬ−乳酸とＬ−グルタミン酸
の混合液試料について、〔Ａ〕試料をそのまま（ｃ．工
程）、及び〔Ｂ〕Ｌ−グルタミン酸の酸化が完了しピル
ビン酸が還元された状態の反応液の２点について上記の
Ｌ−乳酸測定装置を用いてＬ−乳酸濃度を測定した。
〔Ｂ〕の反応系では、濃度がＮＡＤ５ｍＭ、ピルビン酸
１０ｍＭ、グルタミン酸脱水素酵素（ベーリンガー社
製、ウシ肝臓由来）１００ユニット／ｍｌ、Ｌ−乳酸脱
水素酵素（ベーリンガー社製、ブタ筋肉由来）１００ユ
ニット／ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５とし
た液を２５℃の室温で、約１０分間反応させた。

【００４４】試料としては、Ｌ−グルタミン酸１ｍ
Ｍ、Ｌ−グルタミン酸２ｍＭ、Ｌ−乳酸１ｍＭ、Ｌ
−グルタミン酸１ｍＭ、Ｌ−乳酸１ｍＭ、Ｌ−グルタ
ミン酸２ｍＭを使用した。 （５）結果 それぞれの１０分後のＬ−乳酸の生成量は表４のように
なった。

【００４５】反応前〔Ａ〕の測定結果は、各試料中のＬ
−乳酸測定値を示す（ｃ．工程）。反応後〔Ｂ〕はＬ−
グルタミン酸の酸化が完了し、ピルビン酸が還元され生
成したＬ−乳酸と、反応前から試料中に存在していたＬ
−乳酸の総量値を示している（ｂ．工程）。試料中のＬ
−グルタミン酸の量は、反応後のＬ−乳酸測定値から反
応前のＬ−乳酸測定値を差し引いて求めた。

【００４６】

【表４】

【００４７】実施例２ 実施例１と同様のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラムと過酸
化水素電極を有するＬ−乳酸測定装置を用いて食品試料
中のＬ−乳酸およびＬ−グルタミン酸を測定した。

【００４８】（１）測定方法 漬物用調味料である試料（中埜酢店製：「朝づけさ
ん」しそ風味）、（中埜酢店製：「朝づけさん」生姜
風味）について、それぞれ２５０倍に希釈してＬ−乳酸
濃度測定した（ｃ．工程）。更に試料、の２５０倍
希釈液を用い、反応系の濃度をＮＡＤ５ｍＭ、ピルビン
酸１０ｍＭ、グルタミン酸脱水素酵素（ベーリンガー社
製、ウシ肝臓由来）２０ユニット／ｍｌ、Ｌ−乳酸脱水
素酵素（ベーリンガー社製、ブタ筋肉由来）２０ユニッ
ト／ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５とした液
を２５℃で１時間反応させ（ａ．工程）、次にＬ−乳酸
濃度を測定した（ｂ工程）。試料中のＬ−グルタミン酸
濃度、Ｌ−乳酸濃度は元の試料の重量に対する％（Ｗ／
Ｗ）で示した。 （２）結果 それぞれの試料のＬ−乳酸とＬ−グルタミン酸濃度は表
５のようになった。

【００４９】

【表５】

【００５０】

【発明の効果】本発明の酵素反応を用いることにより、
脱水素酵素Ｅ１の基質還元体Ｘｒｅｄとなりうる物質を
簡便に、精度よく定量することが可能となった。また、
第２の基質還元体Ｙredも連続して測定することが出来
る。また、本発明により酸化酵素の基質特異性、Ｋｍ値
（測定範囲）、耐熱性、比活性、ｐＨ等が実用的でない
測定対象物でも測定できる。例えば、Ｌ−グルタミン
酸、グリセロール等を容易に測定することができる。ま
た、Ｌ−グルタミン酸とＬ−乳酸の２成分を連続して簡
便に測定することが可能になり、食品中の代表的なアミ
ノ酸と有機酸を測定することができる。実施例に示した
ようにＹredの測定装置だけを利用してＸredとＹredの
２成分の測定が出来る等の利点もある。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例で使用したフロー方式のＬ−乳酸
測定装置を示す。

【図２】図２は本発明の酵素反応を示す。

【符号の説明】

１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ 恒温槽 ５ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ６ 過酸化水素電極 ７ 検出器 ８ シングルボードコンピュータ ９ ＲＳ２３２Ｃコード １０ パーソナルコンピュータ １１ サンプラ制御信号 １２ 送液ポンプ制御信号 １３ 廃液

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−35050（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−12998（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−13860（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−120853（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−35051（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−239448（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−121656（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−119459（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−169798（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−14799（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−174399（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/416 C12Q 1/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ．基質還元体Ｘred を含み得る試料、
   Ｘred と補酵素酸化体Ｃoxより基質酸化体Ｘoxと補酵素
   還元体Ｃred を生成する反応を触媒する第１の脱水素酵
   素Ｅ1 、補酵素酸化体Ｃox、補酵素還元体Ｃred と第２
   の基質酸化体Ｙoxより第２の基質還元体Ｙred とＣoxを
   生成する第２の脱水素酵素Ｅ2 、及び第２の基質酸化体
   Ｙoxを含む反応系で、第２の基質還元体Ｙred を生成さ
   せる工程、 ｂ．生成したＹred を測定する工程、を有する試料中の
   Ｘred 量を求める測定方法。
2. 【請求項２】 ｂ．生成したＹred を測定する工程が、
   Ｙred を、Ｙred の酸化反応を触媒する酸化酵素Ｅ3 の
   固定化体に接触させ、減少または増加する電極活性物質
   の変化量を電気化学的に検出することによる請求項１記
   載の測定方法。
3. 【請求項３】 酸化酵素Ｅ3 の反応により減少または増
   加する物質が酸素または過酸化水素である請求項２記載
   の測定方法。
4. 【請求項４】 ｃ．更に試料中のＹred 量を測定する工
   程を有し、前記ｂ．工程で求めたＹred の測定値を、
   ｃ．工程で求めた試料中に元来存在していたＹred量で
   補正する請求項１記載の測定方法。
5. 【請求項５】 請求項１において、Ｘred がＬ−グルタ
   ミン酸であり、Ｅ1 がＬ−グルタミン酸脱水素酵素であ
   り、Ｃoxがニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化
   型であり、Ｅ2 がＬ−乳酸脱水素酵素であり、Ｙoxがピ
   ルビン酸であり、Ｙred がＬ−乳酸であるＬ−グルタミ
   ン酸測定方法。
6. 【請求項６】 請求項２において、Ｙred がＬ−乳酸で
   あり、Ｅ３がＬ−乳酸酸化酵素であるＬ−グルタミン酸
   測定方法。