JPH05196601A - 新規な電気化学的測定法 - Google Patents
新規な電気化学的測定法Info
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- JPH05196601A JPH05196601A JP4059758A JP5975892A JPH05196601A JP H05196601 A JPH05196601 A JP H05196601A JP 4059758 A JP4059758 A JP 4059758A JP 5975892 A JP5975892 A JP 5975892A JP H05196601 A JPH05196601 A JP H05196601A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ（又はＮＡ
ＤＰＨ）を共存させ、アミノフェノール類をメディエー
ターとしてこれを電気化学的に測定することを特徴とす
る該アミノフェノール類の測定法。 【効果】 本発明は、アミノフェノール類をメディエー
ターとする、高感度な電気化学的測定法を提供するもの
であり、本発明方法を利用すれば、高感度な酵素活性測
定が可能となるため、酵素免疫測定法や生体試料中の酵
素活性測定を効果的に実施する上で寄与するところ極め
て大なるものがある。
ＤＰＨ）を共存させ、アミノフェノール類をメディエー
ターとしてこれを電気化学的に測定することを特徴とす
る該アミノフェノール類の測定法。 【効果】 本発明は、アミノフェノール類をメディエー
ターとする、高感度な電気化学的測定法を提供するもの
であり、本発明方法を利用すれば、高感度な酵素活性測
定が可能となるため、酵素免疫測定法や生体試料中の酵
素活性測定を効果的に実施する上で寄与するところ極め
て大なるものがある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、例えば酵素免疫測定法
や血清中に存在する各種酵素類の酵素活性測定等に利用
し得る新規な電気化学的測定法に関する。
や血清中に存在する各種酵素類の酵素活性測定等に利用
し得る新規な電気化学的測定法に関する。
【０００２】
【発明の背景】酵素免疫測定法は、生体成分の分析、診
断、をはじめ多くの分野に於いて、微量成分の測定法と
して汎用されている。酵素免疫測定法には、例えば固相
を用いるヘテロジニアスな方法、ホモジニアスな方法、
ホモジニアスな反応後カラムでＢ／Ｆ分離を行う方法等
多くの方法が知られているが、いずれの方法に於いて
も、最終的には何らかの方法により酵素活性を測定する
必要があり、その為、より高感度な酵素活性測定法が望
まれている。酵素活性を高感度に測定することを目的と
して開発された方法の一つに酵素活性の電気化学的測定
法がある。この方法を利用した電気化学的酵素測定法も
近時数多く発表されている。
断、をはじめ多くの分野に於いて、微量成分の測定法と
して汎用されている。酵素免疫測定法には、例えば固相
を用いるヘテロジニアスな方法、ホモジニアスな方法、
ホモジニアスな反応後カラムでＢ／Ｆ分離を行う方法等
多くの方法が知られているが、いずれの方法に於いて
も、最終的には何らかの方法により酵素活性を測定する
必要があり、その為、より高感度な酵素活性測定法が望
まれている。酵素活性を高感度に測定することを目的と
して開発された方法の一つに酵素活性の電気化学的測定
法がある。この方法を利用した電気化学的酵素測定法も
近時数多く発表されている。
【０００３】即ち、酵素反応により生成したフェノール
を電気化学的に測定する方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ３１巻，９号，１５４６〜１５４９
頁，１９８５年；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，５８巻，１３５〜１３９頁，１９８６年等）、
酵素反応により生成した４−アミノフェノールを電気化
学的に測定する方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９２巻，９０〜９５頁，１９９１
年；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，１０３−１０７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９０等）、酵素
反応により生成した１−ナフトールを電気化学的に測定
する方法（特開平３−２１６５４７号公報等）等がそれ
である。しかしながら、これらの方法は何れも感度不足
であり、そのままでは酵素免疫測定法等の実用には供し
得ない。これに対し、感度の高い電気化学的測定法とし
て、フェロセン誘導体やインドール誘導体をメディエー
ター（酵素反応と電極反応の仲立ちをする物質）として
これを測定する方法（特開昭６２−１６７４６５号公
報）や、グルコースオキシダーゼを共存させてハイドロ
キノンやカテコール等をメディエーターとし、これを測
定する方法（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅ
ｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，６巻，３０５〜３１０頁，１９
９１年；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
５７巻，２７５４〜２７５６頁，１９８５年等）等があ
る。また、本発明者らは、ＮＡＤＨとジアホラーゼを共
存させてフラビン類やキノン類をメディエーターとし、
これを測定することにより、高感度な測定が可能となる
ことを見出し、先に研究発表している（Ｒｅｖ． Ｐｏ
ｌａｒｏｇｒａｐｈｙ，３６巻，３８頁，１９９０年；
ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９１，
Ａｂｓｔｒａｃｔ，６５３頁等）。しかしながら、各種
酵素活性の測定に利用し得る４−アミノフェノール等の
アミノフェノール類をメディエーターとした電気化学的
測定法及びその効果的な増感法について報告された例は
未だない。
を電気化学的に測定する方法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ３１巻，９号，１５４６〜１５４９
頁，１９８５年；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，５８巻，１３５〜１３９頁，１９８６年等）、
酵素反応により生成した４−アミノフェノールを電気化
学的に測定する方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９２巻，９０〜９５頁，１９９１
年；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ，１０３−１０７，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９０等）、酵素
反応により生成した１−ナフトールを電気化学的に測定
する方法（特開平３−２１６５４７号公報等）等がそれ
である。しかしながら、これらの方法は何れも感度不足
であり、そのままでは酵素免疫測定法等の実用には供し
得ない。これに対し、感度の高い電気化学的測定法とし
て、フェロセン誘導体やインドール誘導体をメディエー
ター（酵素反応と電極反応の仲立ちをする物質）として
これを測定する方法（特開昭６２−１６７４６５号公
報）や、グルコースオキシダーゼを共存させてハイドロ
キノンやカテコール等をメディエーターとし、これを測
定する方法（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅ
ｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，６巻，３０５〜３１０頁，１９
９１年；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
５７巻，２７５４〜２７５６頁，１９８５年等）等があ
る。また、本発明者らは、ＮＡＤＨとジアホラーゼを共
存させてフラビン類やキノン類をメディエーターとし、
これを測定することにより、高感度な測定が可能となる
ことを見出し、先に研究発表している（Ｒｅｖ． Ｐｏ
ｌａｒｏｇｒａｐｈｙ，３６巻，３８頁，１９９０年；
ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９１，
Ａｂｓｔｒａｃｔ，６５３頁等）。しかしながら、各種
酵素活性の測定に利用し得る４−アミノフェノール等の
アミノフェノール類をメディエーターとした電気化学的
測定法及びその効果的な増感法について報告された例は
未だない。
【０００４】
【発明の目的】本発明は上記した如き状況に鑑みなされ
たもので、４−アミノフェノール等のアミノフェノール
類を電気化学的に高感度に測定する方法を提供すること
を目的とする。
たもので、４−アミノフェノール等のアミノフェノール
類を電気化学的に高感度に測定する方法を提供すること
を目的とする。
【０００５】
【発明の構成】上記目的を達成するため、本発明は下記
の構成より成る。「測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ
（又はＮＡＤＰＨ）を共存させ、一般式[I]
の構成より成る。「測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ
（又はＮＡＤＰＨ）を共存させ、一般式[I]
【化２】 （式中、Ｒ1，Ｒ3，Ｒ5は、何れか一つがアミノ基又は
低級アルキル置換アミノ基を表わし、他は夫々独立して
水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロ
ゲン原子を表わし、Ｒ2及びＲ4は夫々独立して水素原
子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲン原
子を表わす。）で示されるアミノフェノール類をメディ
エーターとしてこれを電気化学的に測定することを特徴
とする該アミノフェノール類の測定法。」
低級アルキル置換アミノ基を表わし、他は夫々独立して
水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロ
ゲン原子を表わし、Ｒ2及びＲ4は夫々独立して水素原
子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲン原
子を表わす。）で示されるアミノフェノール類をメディ
エーターとしてこれを電気化学的に測定することを特徴
とする該アミノフェノール類の測定法。」
【０００６】即ち、本発明者らは、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）や、血清中に存在する各種酵素の酵素活性測定等
に利用し得る、アミノフェノール類の電気化学的測定法
に於ける効果的な増感方法を求めて鋭意研究を重ねた結
果、測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰ
Ｈ）を共存させてアミノフェノール類をメディエーター
としてこれを測定することにより該目的を達成し得るこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。
ＩＡ）や、血清中に存在する各種酵素の酵素活性測定等
に利用し得る、アミノフェノール類の電気化学的測定法
に於ける効果的な増感方法を求めて鋭意研究を重ねた結
果、測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰ
Ｈ）を共存させてアミノフェノール類をメディエーター
としてこれを測定することにより該目的を達成し得るこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】一般式[I]に於て、Ｒ1〜Ｒ5で表わされる
低級アルキル基としては、例えば、メ チル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，アミル基等炭素数１〜５の
アルキル基（直鎖状，分枝状何れにても可）が挙げら
れ、低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基，
エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基，アミロキシ基
等炭素数１〜５のアルコキシ基（直鎖状，分枝状何れに
ても可）が挙げられ、ハロゲン原子としては、塩素，臭
素，弗素，沃素が挙げられる。また、Ｒ1,Ｒ3,Ｒ5は、
何れか一つがアミノ基又は低級アルキル置換アミノ基を
表わすが、低級アルキル置換アミノ基の低級アルキル基
としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブ
チル基、アミル基等炭素数１〜５のアルキル基（直鎖
状、分枝状何れにても可）が挙げられる。
低級アルキル基としては、例えば、メ チル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，アミル基等炭素数１〜５の
アルキル基（直鎖状，分枝状何れにても可）が挙げら
れ、低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基，
エトキシ基，プロポキシ基，ブトキシ基，アミロキシ基
等炭素数１〜５のアルコキシ基（直鎖状，分枝状何れに
ても可）が挙げられ、ハロゲン原子としては、塩素，臭
素，弗素，沃素が挙げられる。また、Ｒ1,Ｒ3,Ｒ5は、
何れか一つがアミノ基又は低級アルキル置換アミノ基を
表わすが、低級アルキル置換アミノ基の低級アルキル基
としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブ
チル基、アミル基等炭素数１〜５のアルキル基（直鎖
状、分枝状何れにても可）が挙げられる。
【０００８】本発明で用いられるジアホラーゼは、その
由来に特に限定はなく、動物、植物、微生物の何れの由
来のものにても良い。また、その使用濃度は高いほど４
−アミノフェノールの検出感度が高くなるので好ましい
が、濃度があまり高いと電解反応が阻害されるおそれが
あるので自から上限はあるが、通常は電解処理液中の濃
度が10-10Ｍ以上、好ましくは10-8Ｍ以上になるように
適宜用いられる。尚、ジアホラーゼを電極表面に固定化
して用いれば、ジアホラーゼのくり返し使用が可能とな
り、ジアホラーゼの使用量を減じることができると共
に、使用済のジアホラーゼを廃液中に垂れ流ししなくて
も済むのでより好ましい。本発明で用いられるＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨの使用濃度は、特に限定されるものでは
ないが、通常は電解処理液中の濃度が0.1〜100ｍＭ、好
ましくは1〜50ｍＭになるように適宜選択される。尚、
本発明で用いられる電解処理液とは、メディエーターで
あるアミノフェノール類、又はアミノフェノール類を生
成し得る試薬等の組み合わせ（例えば酵素とその基質
等）と生成したアミノフェノール類との混合物、ＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡＤＰＨ）及びジアホラーゼを含んで成る水
溶液又は緩衝剤溶液のことで、他にＭgＣl2等の賦活剤
やメルカプトエタノール，ジチオスレイトール等のＳＨ
化合物、 アルブミン，ゼラチン等の蛋白質、界面活性
剤等、各種添加剤を含有していても一向に差支えない。
本発明に係る電解処理液に於て用いられる緩衝剤として
は、例えばトリス−塩酸緩衝液等のグッド緩衝液、炭酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエチルアミン
緩衝液等が好ましく挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。本発明の測定法を実施する場合に用いられ
る電解セルは、通常この分野で用いられる何れのタイ
プ、何れの材質の電解セルでも良く、特に限定されな
い。また、電極も通常この分野に於て用いられる電極の
何れにても良いが、例えば作用電極としてはグラッシー
カーボン電極、パイロリティックグラファイト電極、カ
ーボンペースト電極、金電極等が、対極としては白金電
極、カーボン電極等が、また参照電極としてはＡg／Ａg
Ｃl電極、飽和甘こう電極（ＳＣＥ）等が好ましく用い
られる。電流値の測定はポテンシォスタット、ポーラロ
グラフ分析機等通常この分野に於いて用いられる測定機
器を用いて行なうことで足りる。本発明の測定法はバッ
チ法でもフロー法でも何れの方法で行なうも可である。
測定温度はジアホラーゼの作用が著しく阻害されない温
度であれば何れにても良く、特に限定されるものではな
いが、通常20〜60℃、好ましくは30〜40℃の範囲から適
宜選択される。また、測定時のpHもジアホラーゼの作用
が著しく阻害されないpHであれば何れにても良く特に限
定されるものではないが、通常pH５〜９の範囲が好まし
く用いられる。測定電位はpHによって異なるので特定さ
れないが、例えばpH8.5のときは通常50〜400ｍＶ、好ま
しくは100〜200ｍＶである。本発明の測定法は、例えば
酵素免疫測定法に有効に利用することができる。即ち、
酵素免疫測定法に於て、標識酵素の基質として該酵素の
作用によりアミノフェノール類を遊離する化合物を用
い、酵素反応により遊離したアミノフェノール類の量を
本発明の電気化学的測定法により測定すれば該酵素の活
性値をより高感度に求めることができ、それによって測
定対象たる抗原又は抗体の量をより高感度に測定するこ
とができる。尚、キノン類やフラビン類をメディエータ
ーとする系では酵素免疫測定法に利用するのは困難であ
る。
由来に特に限定はなく、動物、植物、微生物の何れの由
来のものにても良い。また、その使用濃度は高いほど４
−アミノフェノールの検出感度が高くなるので好ましい
が、濃度があまり高いと電解反応が阻害されるおそれが
あるので自から上限はあるが、通常は電解処理液中の濃
度が10-10Ｍ以上、好ましくは10-8Ｍ以上になるように
適宜用いられる。尚、ジアホラーゼを電極表面に固定化
して用いれば、ジアホラーゼのくり返し使用が可能とな
り、ジアホラーゼの使用量を減じることができると共
に、使用済のジアホラーゼを廃液中に垂れ流ししなくて
も済むのでより好ましい。本発明で用いられるＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨの使用濃度は、特に限定されるものでは
ないが、通常は電解処理液中の濃度が0.1〜100ｍＭ、好
ましくは1〜50ｍＭになるように適宜選択される。尚、
本発明で用いられる電解処理液とは、メディエーターで
あるアミノフェノール類、又はアミノフェノール類を生
成し得る試薬等の組み合わせ（例えば酵素とその基質
等）と生成したアミノフェノール類との混合物、ＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡＤＰＨ）及びジアホラーゼを含んで成る水
溶液又は緩衝剤溶液のことで、他にＭgＣl2等の賦活剤
やメルカプトエタノール，ジチオスレイトール等のＳＨ
化合物、 アルブミン，ゼラチン等の蛋白質、界面活性
剤等、各種添加剤を含有していても一向に差支えない。
本発明に係る電解処理液に於て用いられる緩衝剤として
は、例えばトリス−塩酸緩衝液等のグッド緩衝液、炭酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ジエチルアミン
緩衝液等が好ましく挙げられるがこれらに限定されるも
のではない。本発明の測定法を実施する場合に用いられ
る電解セルは、通常この分野で用いられる何れのタイ
プ、何れの材質の電解セルでも良く、特に限定されな
い。また、電極も通常この分野に於て用いられる電極の
何れにても良いが、例えば作用電極としてはグラッシー
カーボン電極、パイロリティックグラファイト電極、カ
ーボンペースト電極、金電極等が、対極としては白金電
極、カーボン電極等が、また参照電極としてはＡg／Ａg
Ｃl電極、飽和甘こう電極（ＳＣＥ）等が好ましく用い
られる。電流値の測定はポテンシォスタット、ポーラロ
グラフ分析機等通常この分野に於いて用いられる測定機
器を用いて行なうことで足りる。本発明の測定法はバッ
チ法でもフロー法でも何れの方法で行なうも可である。
測定温度はジアホラーゼの作用が著しく阻害されない温
度であれば何れにても良く、特に限定されるものではな
いが、通常20〜60℃、好ましくは30〜40℃の範囲から適
宜選択される。また、測定時のpHもジアホラーゼの作用
が著しく阻害されないpHであれば何れにても良く特に限
定されるものではないが、通常pH５〜９の範囲が好まし
く用いられる。測定電位はpHによって異なるので特定さ
れないが、例えばpH8.5のときは通常50〜400ｍＶ、好ま
しくは100〜200ｍＶである。本発明の測定法は、例えば
酵素免疫測定法に有効に利用することができる。即ち、
酵素免疫測定法に於て、標識酵素の基質として該酵素の
作用によりアミノフェノール類を遊離する化合物を用
い、酵素反応により遊離したアミノフェノール類の量を
本発明の電気化学的測定法により測定すれば該酵素の活
性値をより高感度に求めることができ、それによって測
定対象たる抗原又は抗体の量をより高感度に測定するこ
とができる。尚、キノン類やフラビン類をメディエータ
ーとする系では酵素免疫測定法に利用するのは困難であ
る。
【０００９】本発明の方法により測定可能な、酵素免疫
測定法に於ける標識酵素とその基質との組み合せとして
は、例えば以下の如きものが挙げられる。 アルカリフォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェ
ニルフォスフェイト 酸性フォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェニル
フォスフェイト β−ガラクトシダーゼ／４（又は２）−アミノフェニル
β−ガラクトピラノシド また、本発明の測定法は例えば生体試料（血清、血漿、
血液等）中に存在する酵素の活性値測定にも有効に利用
し得る。即ち、該測定対象酵素の基質として該酵素の作
用によりアミノフェノール類を遊離する化合物を基質と
して用い、酵素反応により遊離したアミノフェノール類
の量を本発明の電気化学的測定法により測定すれば、該
酵素の活性値をより高感度に求めることができる。本発
明の方法により測定可能な生体試料中の酵素と、その基
質との組み合わせとしては例えば下記の如きものが挙げ
られる。 アルカリフォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェ
ニルフォスフェイト 酸性フォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェニル
フォスフェイト γ−グルタミルトランスペプチダーゼ／γ−Ｌ−グルタ
ミル−４（又は２）−ヒドロキシアニリド ロイシンアミノペプチダーゼ／Ｌ−ロイシル−４（又は
２）−ヒドロキシアニリド 本発明の方法は上に挙げた以外にも、例えば、各種アミ
ノ酸やペプチド類に一般式[I]で示されるアミノフェノ
ール類がその水酸基又はアミノ基の何れかを介して結合
している化合物を基質として用いることにより例えばエ
ンドトキシン、例えばトロンビン，プラスミン，カリク
レイン，Ｘa因子，XIIa因子等の血液凝固因子等を始め
として、各種プロテアーゼ類、エステラーゼ類の活性値
を高感度に測定することができる。
測定法に於ける標識酵素とその基質との組み合せとして
は、例えば以下の如きものが挙げられる。 アルカリフォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェ
ニルフォスフェイト 酸性フォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェニル
フォスフェイト β−ガラクトシダーゼ／４（又は２）−アミノフェニル
β−ガラクトピラノシド また、本発明の測定法は例えば生体試料（血清、血漿、
血液等）中に存在する酵素の活性値測定にも有効に利用
し得る。即ち、該測定対象酵素の基質として該酵素の作
用によりアミノフェノール類を遊離する化合物を基質と
して用い、酵素反応により遊離したアミノフェノール類
の量を本発明の電気化学的測定法により測定すれば、該
酵素の活性値をより高感度に求めることができる。本発
明の方法により測定可能な生体試料中の酵素と、その基
質との組み合わせとしては例えば下記の如きものが挙げ
られる。 アルカリフォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェ
ニルフォスフェイト 酸性フォスファターゼ／４（又は２）−アミノフェニル
フォスフェイト γ−グルタミルトランスペプチダーゼ／γ−Ｌ−グルタ
ミル−４（又は２）−ヒドロキシアニリド ロイシンアミノペプチダーゼ／Ｌ−ロイシル−４（又は
２）−ヒドロキシアニリド 本発明の方法は上に挙げた以外にも、例えば、各種アミ
ノ酸やペプチド類に一般式[I]で示されるアミノフェノ
ール類がその水酸基又はアミノ基の何れかを介して結合
している化合物を基質として用いることにより例えばエ
ンドトキシン、例えばトロンビン，プラスミン，カリク
レイン，Ｘa因子，XIIa因子等の血液凝固因子等を始め
として、各種プロテアーゼ類、エステラーゼ類の活性値
を高感度に測定することができる。
【００１０】本発明の測定法は、電解処理液中にＮＡＤ
Ｈ（又はＮＡＤＰＨ）とジアホラーゼとを共存させてア
ミノフェノール類をメディエーターとしてこれを測定す
る以外は、４−アミノフェノールを測定対象とする自体
公知の電気化学的測定法の操作法に準じてこれを行なう
ことで足りる。即ち、例えば４−アミノフェノールその
ものが最終測定対象物の場合には、電解セル（作用電極
として例えばグラッシーカーボン電極、対極として例え
ば白金電極、参照電極として例えばＡg／ＡgＣl電極を
使用）に適当な緩衝液と所定量のＮＡＤＨ（又はＮＡＤ
ＰＨ）水溶液及び所定量のジアホラーゼ溶液を加えて一
定時間攪拌後、所定電位（例えばＡg／ＡgＣl電極に対
して150ｍＶ）に於ける電流が定常値を示すことを確認
した後、試料（４−アミノフェノールを含む）溶液を添
加し、再度一定時間攪拌し、然る後、同じ電位に於ける
酸化電流を測定する。この値を予め４−アミノフェノー
ル濃度既知の試料を用いて同様の操作を行ない作成した
検量線に当て嵌めれば未知試料中の４−アミノフェノー
ル含量が容易に求められる。
Ｈ（又はＮＡＤＰＨ）とジアホラーゼとを共存させてア
ミノフェノール類をメディエーターとしてこれを測定す
る以外は、４−アミノフェノールを測定対象とする自体
公知の電気化学的測定法の操作法に準じてこれを行なう
ことで足りる。即ち、例えば４−アミノフェノールその
ものが最終測定対象物の場合には、電解セル（作用電極
として例えばグラッシーカーボン電極、対極として例え
ば白金電極、参照電極として例えばＡg／ＡgＣl電極を
使用）に適当な緩衝液と所定量のＮＡＤＨ（又はＮＡＤ
ＰＨ）水溶液及び所定量のジアホラーゼ溶液を加えて一
定時間攪拌後、所定電位（例えばＡg／ＡgＣl電極に対
して150ｍＶ）に於ける電流が定常値を示すことを確認
した後、試料（４−アミノフェノールを含む）溶液を添
加し、再度一定時間攪拌し、然る後、同じ電位に於ける
酸化電流を測定する。この値を予め４−アミノフェノー
ル濃度既知の試料を用いて同様の操作を行ない作成した
検量線に当て嵌めれば未知試料中の４−アミノフェノー
ル含量が容易に求められる。
【００１１】また、本発明の方法により例えばアルカリ
フォスファターゼの活性値を求めようとする場合には、
例えば４−アミノフェニルフォスフェイト及び要すれば
賦活剤のＭgＣl2を含む緩衝溶液（例えばpH10.3の炭酸
緩衝液）に試料（アルカリフォスファターゼ含有）を37
℃で添加し、一定時間要すれば攪拌下に反応させた後、
反応液の一定量を取り出し、これを試料として上記方法
（４−アミノフェノールそのものが最終測定対象物の場
合の測定方法）に準じて酸化電流値を求め、この値を予
めアルカリフォスファターゼ活性値既知の試料を用いて
同様の操作を行ない作成した検量線に当て嵌めれば未知
試料中のアルカリフォスファターゼ活性値が容易に求め
られる。尚、本発明の方法によりアルカリフォスファタ
ーゼ活性を測定した場合には、検出限界が８×10-15Ｍ
であり、例えばフェロセンをメディエーターとした場合
のアルカリフォスファターゼの検出限界である10-12Ｍ
（特開昭６２−１６７４６５号公報のFig.２より）と比
べて約２桁感度が高い。以下に、実験例及び実施例を挙
げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実
験例、実施例により何ら限定されるものではない。
フォスファターゼの活性値を求めようとする場合には、
例えば４−アミノフェニルフォスフェイト及び要すれば
賦活剤のＭgＣl2を含む緩衝溶液（例えばpH10.3の炭酸
緩衝液）に試料（アルカリフォスファターゼ含有）を37
℃で添加し、一定時間要すれば攪拌下に反応させた後、
反応液の一定量を取り出し、これを試料として上記方法
（４−アミノフェノールそのものが最終測定対象物の場
合の測定方法）に準じて酸化電流値を求め、この値を予
めアルカリフォスファターゼ活性値既知の試料を用いて
同様の操作を行ない作成した検量線に当て嵌めれば未知
試料中のアルカリフォスファターゼ活性値が容易に求め
られる。尚、本発明の方法によりアルカリフォスファタ
ーゼ活性を測定した場合には、検出限界が８×10-15Ｍ
であり、例えばフェロセンをメディエーターとした場合
のアルカリフォスファターゼの検出限界である10-12Ｍ
（特開昭６２−１６７４６５号公報のFig.２より）と比
べて約２桁感度が高い。以下に、実験例及び実施例を挙
げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実
験例、実施例により何ら限定されるものではない。
【００１２】
実験例１．４−アミノフェノールをメディエーターとす
る系でのサイクリックボルタモグラムの作成 ４−アミノフェノールをメディエーターとする系でのサ
イクリックボルタモグラムを４−アミノフェノールだけ
の場合、ＮＡＤＨを添加した場合、及びジアホラーゼと
ＮＡＤＨの両方を添加した場合の夫々について作成し比
較した。 〈測定装置〉 電解セル：アクリル製Ｈ型セル（容量0.4ｍｌ） 作用電極：グラッシーカーボンディスク電極（φ＝0.3
ｃｍ） （電極表面は常法に従い研磨、超音波処理して使用） 対極：白金電極 参照電極：Ａg／ＡgＣl（飽和ＫＣl溶液）電極 Ｙａｎａｃｏ ポーラログラフィ分析機 Ｐ−1000、
［(株)柳本製作所製］（横河電機(株)製3025型 Ｘ−Ｙ
レコーダー接続） 〈方法〉４×10-4Ｍの４−アミノフェノールを含む0.1
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）と、これに0.1ＭのＮＡ
ＤＨを添加したもの、及び3.3×10-6Ｍのジアホラーゼ
と0.1ＭのＮＡＤＨとを添加したものを夫々試料とし
た。これら試料の夫々について、上記測定装置を用い常
法に従い、37±0.3℃、除酸素下、掃引速度10ｍＶ／秒
（−0.2Ｖより正方向に掃引）でサイクリックボルタン
メトリーを行ないボルタモグラムを作成した。結果を図
１に示す。図１から明らかなように、ジアホラーゼ、Ｎ
ＡＤＨ共に無添加の場合(a)及びＮＡＤＨのみ添加の場
合(b)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加し
た場合(c)にはアノーディック電流が大幅に増加してい
ることが判る。
る系でのサイクリックボルタモグラムの作成 ４−アミノフェノールをメディエーターとする系でのサ
イクリックボルタモグラムを４−アミノフェノールだけ
の場合、ＮＡＤＨを添加した場合、及びジアホラーゼと
ＮＡＤＨの両方を添加した場合の夫々について作成し比
較した。 〈測定装置〉 電解セル：アクリル製Ｈ型セル（容量0.4ｍｌ） 作用電極：グラッシーカーボンディスク電極（φ＝0.3
ｃｍ） （電極表面は常法に従い研磨、超音波処理して使用） 対極：白金電極 参照電極：Ａg／ＡgＣl（飽和ＫＣl溶液）電極 Ｙａｎａｃｏ ポーラログラフィ分析機 Ｐ−1000、
［(株)柳本製作所製］（横河電機(株)製3025型 Ｘ−Ｙ
レコーダー接続） 〈方法〉４×10-4Ｍの４−アミノフェノールを含む0.1
Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）と、これに0.1ＭのＮＡ
ＤＨを添加したもの、及び3.3×10-6Ｍのジアホラーゼ
と0.1ＭのＮＡＤＨとを添加したものを夫々試料とし
た。これら試料の夫々について、上記測定装置を用い常
法に従い、37±0.3℃、除酸素下、掃引速度10ｍＶ／秒
（−0.2Ｖより正方向に掃引）でサイクリックボルタン
メトリーを行ないボルタモグラムを作成した。結果を図
１に示す。図１から明らかなように、ジアホラーゼ、Ｎ
ＡＤＨ共に無添加の場合(a)及びＮＡＤＨのみ添加の場
合(b)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加し
た場合(c)にはアノーディック電流が大幅に増加してい
ることが判る。
【００１３】実験例２．２−アミノフェノールをメディ
エーターとする系でのサイクリックボルタモグラムの作
成 ２−アミノフェノールをメディエーターとする系でのサ
イクリックボルタモグラムを２−アミノフェノールだけ
の場合、及びジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場合の
夫々について作成し比較した。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉２×10-4Ｍの２−アミノフェノールと0.1Ｍの
ＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）、及び
これに１ｍＭのＮＡＤＨ及び10-7Ｍのジアホラーゼを
添加したものを夫々試料とした。これら試料の夫々につ
いて、上記測定装置を用い常法に従い、37±0.3℃、除
酸素下、掃引速度５ｍＶ／秒（−0.1Ｖより正方向に掃
引）でサイクリックボルタンメトリーを行ないボルタモ
グラムを作成した。結果を図２に示す。図２から明らか
なように、ジアホラーゼ及びＮＡＤＨ無添加の場合(a)
に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場合(b)に
はアノーディック電流が大幅に増加していることが判
る。
エーターとする系でのサイクリックボルタモグラムの作
成 ２−アミノフェノールをメディエーターとする系でのサ
イクリックボルタモグラムを２−アミノフェノールだけ
の場合、及びジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場合の
夫々について作成し比較した。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉２×10-4Ｍの２−アミノフェノールと0.1Ｍの
ＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）、及び
これに１ｍＭのＮＡＤＨ及び10-7Ｍのジアホラーゼを
添加したものを夫々試料とした。これら試料の夫々につ
いて、上記測定装置を用い常法に従い、37±0.3℃、除
酸素下、掃引速度５ｍＶ／秒（−0.1Ｖより正方向に掃
引）でサイクリックボルタンメトリーを行ないボルタモ
グラムを作成した。結果を図２に示す。図２から明らか
なように、ジアホラーゼ及びＮＡＤＨ無添加の場合(a)
に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場合(b)に
はアノーディック電流が大幅に増加していることが判
る。
【００１４】実験例３．２−アミノ−４−メチルフェノ
ールをメディエーターとする系でのサイクリックボルタ
モグラムの作成 ２−アミノ−４−メチルフェノールをメディエーターと
する系でのサイクリックボルタモグラムを２−アミノ−
４−メチルフェノールだけの場合、及びジアホラーゼと
ＮＡＤＨを添加した場合の夫々について作成し比較し
た。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉２×10-4Ｍの２−アミノ−４−メチルフェノー
ルと0.1ＭのＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
8.5）、及びこれに１ｍＭのＮＡＤＨ及び10-7Ｍのジ ア
ホラーゼを添加したものを夫々試料とした。これら試料
の夫々について、上記測定装置を用い常法に従い、37±
0.3℃、除酸素下、掃引速度５ｍＶ／秒（−0.1Ｖより正
方向に掃引）でサイクリックボルタンメトリーを行ない
ボルタモグラムを作成した。結果を図３に示す。図３か
ら明らかなように、ジアホラーゼ及びＮＡＤＨ無添加の
場合(a)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場
合(b)にはアノーディック電流が大幅に増加しているこ
とが判る。
ールをメディエーターとする系でのサイクリックボルタ
モグラムの作成 ２−アミノ−４−メチルフェノールをメディエーターと
する系でのサイクリックボルタモグラムを２−アミノ−
４−メチルフェノールだけの場合、及びジアホラーゼと
ＮＡＤＨを添加した場合の夫々について作成し比較し
た。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉２×10-4Ｍの２−アミノ−４−メチルフェノー
ルと0.1ＭのＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
8.5）、及びこれに１ｍＭのＮＡＤＨ及び10-7Ｍのジ ア
ホラーゼを添加したものを夫々試料とした。これら試料
の夫々について、上記測定装置を用い常法に従い、37±
0.3℃、除酸素下、掃引速度５ｍＶ／秒（−0.1Ｖより正
方向に掃引）でサイクリックボルタンメトリーを行ない
ボルタモグラムを作成した。結果を図３に示す。図３か
ら明らかなように、ジアホラーゼ及びＮＡＤＨ無添加の
場合(a)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨを添加した場
合(b)にはアノーディック電流が大幅に増加しているこ
とが判る。
【００１５】実験例４ p−メチルアミノフェノ−ルを
メディエ−タ−とする系でのサイクリックボルタモグラ
ムの作成 p−メチルアミノフェノ−ルをメディエ−タ−とする系
でのサイクリックボルタモグラムを、p−メチルアミノ
フェノ−ルだけの場合、ＮＡＤＨを添加した場合、及び
ジアホラ−ゼとＮＡＤＨの両方を添加した場合の夫々に
ついて作成し比較とした。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉１×10-4Ｍのp−メチルアミノフェノ−ルを含
む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）と、これに10ｍＭ
のＮＡＤＨを添加したもの、及び４×10-7Ｍのジアホラ
−ゼと10ｍＭのＮＡＤＨとを添加したものを夫々試料と
した。これら試料の夫々について、上記測定装置を用い
常法に従い、37±0.3℃、除酸素下、掃引速度５ｍＶ／
秒（−0.2Ｖより正方向に掃引）でサイクリックボルタ
ンメトリーを行ないボルタモグラムを作成した。結果を
図４に示す。図４から明らかなように、ジアホラーゼ、
ＮＡＤＨ共に無添加の場合(a)及びＮＡＤＨのみ添加の
場合(b)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加
した場合(C)にはアノーディック電流が大幅に増加して
いることが判る。
メディエ−タ−とする系でのサイクリックボルタモグラ
ムの作成 p−メチルアミノフェノ−ルをメディエ−タ−とする系
でのサイクリックボルタモグラムを、p−メチルアミノ
フェノ−ルだけの場合、ＮＡＤＨを添加した場合、及び
ジアホラ−ゼとＮＡＤＨの両方を添加した場合の夫々に
ついて作成し比較とした。 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉１×10-4Ｍのp−メチルアミノフェノ−ルを含
む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）と、これに10ｍＭ
のＮＡＤＨを添加したもの、及び４×10-7Ｍのジアホラ
−ゼと10ｍＭのＮＡＤＨとを添加したものを夫々試料と
した。これら試料の夫々について、上記測定装置を用い
常法に従い、37±0.3℃、除酸素下、掃引速度５ｍＶ／
秒（−0.2Ｖより正方向に掃引）でサイクリックボルタ
ンメトリーを行ないボルタモグラムを作成した。結果を
図４に示す。図４から明らかなように、ジアホラーゼ、
ＮＡＤＨ共に無添加の場合(a)及びＮＡＤＨのみ添加の
場合(b)に比べ、ジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加
した場合(C)にはアノーディック電流が大幅に増加して
いることが判る。
【００１６】実験例５．ジアホラーゼ濃度の影響 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）を用いて10
-5Ｍ ４−アミノフェノール 溶液と0.1Ｍ ＮＡＤＨ溶液
を夫々調製した。また、同じ緩衝液を用いて３×10
-8Ｍ，7.5×10-9Ｍ，1.9×10-9Ｍ，4.7×10-10Ｍのジア
ホラーゼ溶液を夫々調製した。電解セルに0.1Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pH8.5）385μlと上記ＮＡＤＨ溶液５μl
及び上記各ジアホラーゼ溶液５μlを注入し、数秒間攪
拌した後、＋0.15Ｖに於ける電流が定常値を示すことを
確認し、然る後これに上記４−アミノフェノール溶液５
μlを加えて、常法に従い、除酸素下、37±0.3℃で夫々
電気化学反応を行ない、0.15Ｖに於ける酸化電流量を夫
々測定した。結果を図５に示す。図５より明らかなよう
に、ジアホラーゼ濃度の平方根に比例して電流量が増加
していることが判る。
-5Ｍ ４−アミノフェノール 溶液と0.1Ｍ ＮＡＤＨ溶液
を夫々調製した。また、同じ緩衝液を用いて３×10
-8Ｍ，7.5×10-9Ｍ，1.9×10-9Ｍ，4.7×10-10Ｍのジア
ホラーゼ溶液を夫々調製した。電解セルに0.1Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pH8.5）385μlと上記ＮＡＤＨ溶液５μl
及び上記各ジアホラーゼ溶液５μlを注入し、数秒間攪
拌した後、＋0.15Ｖに於ける電流が定常値を示すことを
確認し、然る後これに上記４−アミノフェノール溶液５
μlを加えて、常法に従い、除酸素下、37±0.3℃で夫々
電気化学反応を行ない、0.15Ｖに於ける酸化電流量を夫
々測定した。結果を図５に示す。図５より明らかなよう
に、ジアホラーゼ濃度の平方根に比例して電流量が増加
していることが判る。
【００１７】実施例１．４−アミノフェノールの測定
（検量線の作成） 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉電解セルに0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）
382μlと3.3×10-6Ｍ又は3.3×10-4Ｍのジアホラーゼ溶
液（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液）４μl及 び
0.1Ｍ ＮＡＤＨ水溶液４μlを注入し、数秒間攪拌した
後、これに各種濃度の ４−アミノフェノール10μlを添
加して、常法に従い、除酸素下、37±0.3℃で夫々電気
化学反応を行ない、0.15Ｖに於ける酸化電流量を夫々測
定した。結果を図６（3.3×10-6Ｍのジアホラーゼ溶液
使用の場合）及び図７（3.3×10-4Ｍのジアホラーゼ溶
液使用の場合）に示す。図６及び図７より明らかなよう
に、４−アミノフェノール濃度と生じた電流量との関係
を示す検量線は原点を通る直線となり、本発明の方法が
定量性に優れていることが判る。また、本実験結果か
ら、電解処理液中に3.3×10-6Ｍのジアホラーゼが存在
した場合、少なくとも５×10-10Ｍまでの４−アミノフ
ェノールが検出可能であることが判った。
（検量線の作成） 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉電解セルに0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）
382μlと3.3×10-6Ｍ又は3.3×10-4Ｍのジアホラーゼ溶
液（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液）４μl及 び
0.1Ｍ ＮＡＤＨ水溶液４μlを注入し、数秒間攪拌した
後、これに各種濃度の ４−アミノフェノール10μlを添
加して、常法に従い、除酸素下、37±0.3℃で夫々電気
化学反応を行ない、0.15Ｖに於ける酸化電流量を夫々測
定した。結果を図６（3.3×10-6Ｍのジアホラーゼ溶液
使用の場合）及び図７（3.3×10-4Ｍのジアホラーゼ溶
液使用の場合）に示す。図６及び図７より明らかなよう
に、４−アミノフェノール濃度と生じた電流量との関係
を示す検量線は原点を通る直線となり、本発明の方法が
定量性に優れていることが判る。また、本実験結果か
ら、電解処理液中に3.3×10-6Ｍのジアホラーゼが存在
した場合、少なくとも５×10-10Ｍまでの４−アミノフ
ェノールが検出可能であることが判った。
【００１８】実施例２．アルカリフォスファターゼ活性
の測定 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉各種単位のアルカリフォスファターゼを含む試
料溶液１μlを0.25ｍＭのＭgＣl2と0.1Ｍの４−アミノ
フェニルフォスフェイトを含有する炭酸緩衝液（pH10.
3）49μlに添加し、37℃で10分間反応させた。この反応
液10μlを試料とし、以下、実施例１の方法に準じて、
0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）382μl、3.3×10 -4
Ｍのジアホラーゼ ４μl及び0.1Ｍ ＮＡＤＨ ４μlを用
いて電気化学反応を行ない、0.15Ｖで生じる酸化電流量
を夫々測定した。結果を図８に示す。図８より明らかな
ように、アルカリフォスファターゼ活性値と生じた電流
量との関係を示す検量線は原点を通る直線となり、本発
明の方法が定量性に優れていることが判る。また、本実
験結果から、電解処理液中に3.3×10-6Ｍのジアホラー
ゼが存在した場合のアルカリフォスファターゼの検出限
界は10-7unit（４×10-19mol/50μl＝８×10-15Ｍ）で
あることが判った。
の測定 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉各種単位のアルカリフォスファターゼを含む試
料溶液１μlを0.25ｍＭのＭgＣl2と0.1Ｍの４−アミノ
フェニルフォスフェイトを含有する炭酸緩衝液（pH10.
3）49μlに添加し、37℃で10分間反応させた。この反応
液10μlを試料とし、以下、実施例１の方法に準じて、
0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.5）382μl、3.3×10 -4
Ｍのジアホラーゼ ４μl及び0.1Ｍ ＮＡＤＨ ４μlを用
いて電気化学反応を行ない、0.15Ｖで生じる酸化電流量
を夫々測定した。結果を図８に示す。図８より明らかな
ように、アルカリフォスファターゼ活性値と生じた電流
量との関係を示す検量線は原点を通る直線となり、本発
明の方法が定量性に優れていることが判る。また、本実
験結果から、電解処理液中に3.3×10-6Ｍのジアホラー
ゼが存在した場合のアルカリフォスファターゼの検出限
界は10-7unit（４×10-19mol/50μl＝８×10-15Ｍ）で
あることが判った。
【００１９】実施例３．β−ガラクトシダ−ゼ活性の測
定 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉各種濃度のβ−ガラクトシダ−ゼを含む0.1％
アルブミン溶液10μｌと、30ｍＭ４−アミノフェニル
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む基質溶液10μｌとを
３ｍＭ ＭgＣl2と0.1％アルブミンを含む0.1Ｍリン酸緩
衝液（pH7.3）280μｌに添加し、37℃で10分間反応させ
た。その後、反応液を限外濾過し（ミリポア社、UFP2、
LGC24、分画分子量 10,000）、酵素反応を停止させた。
この濾液10μｌを試料とし、以下実施例１の方法に準じ
て 0.1Ｍ ＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.
5）880μｌ、2.3×10-6Ｍのジアホラ−ゼ10μｌ及び10
ｍＭ ＮＡＤＨ100μｌを用いて電気化学反応を行ない、
0.15Ｖで生じる酸化電流量を夫々測定した。結果を図９
に示す。図９より明らかなように、β−ガラクトシダ−
ゼ濃度と生じた電流量との関係を示す検量線は原点を通
る直線となり、本発明の方法が定量性に優れていること
が判る。また、本実験結果から、電解処理液中に2.3×1
0-8Ｍのジアホラーゼが存在した場合のβ−ガラクトシ
ダ−ゼの検出限界はこの測定条件で3.6×10-16mol／0.3
ｍｌ＝1.2×10-12Ｍであることが判った。
定 〈測定装置〉実験例１と同じ。 〈方法〉各種濃度のβ−ガラクトシダ−ゼを含む0.1％
アルブミン溶液10μｌと、30ｍＭ４−アミノフェニル
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含む基質溶液10μｌとを
３ｍＭ ＭgＣl2と0.1％アルブミンを含む0.1Ｍリン酸緩
衝液（pH7.3）280μｌに添加し、37℃で10分間反応させ
た。その後、反応液を限外濾過し（ミリポア社、UFP2、
LGC24、分画分子量 10,000）、酵素反応を停止させた。
この濾液10μｌを試料とし、以下実施例１の方法に準じ
て 0.1Ｍ ＫＣlを含む0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.
5）880μｌ、2.3×10-6Ｍのジアホラ−ゼ10μｌ及び10
ｍＭ ＮＡＤＨ100μｌを用いて電気化学反応を行ない、
0.15Ｖで生じる酸化電流量を夫々測定した。結果を図９
に示す。図９より明らかなように、β−ガラクトシダ−
ゼ濃度と生じた電流量との関係を示す検量線は原点を通
る直線となり、本発明の方法が定量性に優れていること
が判る。また、本実験結果から、電解処理液中に2.3×1
0-8Ｍのジアホラーゼが存在した場合のβ−ガラクトシ
ダ−ゼの検出限界はこの測定条件で3.6×10-16mol／0.3
ｍｌ＝1.2×10-12Ｍであることが判った。
【００２０】
【発明の効果】本発明は、アミノフェノール類をメディ
エーターとする、高感度な電気化学的測定法を提供する
ものであり、本発明方法を利用すれば、高感度な酵素活
性測定が可能となるため、酵素免疫測定法や生体試料中
の酵素活性測定を効果的に実施する上で寄与するところ
極めて大なるものがある。
エーターとする、高感度な電気化学的測定法を提供する
ものであり、本発明方法を利用すれば、高感度な酵素活
性測定が可能となるため、酵素免疫測定法や生体試料中
の酵素活性測定を効果的に実施する上で寄与するところ
極めて大なるものがある。
【００２１】
【図１】図１は実験例１で得られたサイクリックボルタ
モグラムを示す。
モグラムを示す。
【図２】図２は実験例２で得られたサイクリックボルタ
モグラムを示す。
モグラムを示す。
【図３】図３は実験例３で得られたサイクリックボルタ
モグラムを示す。
モグラムを示す。
【図４】図４は実験例４で得られたサイクリックボルタ
モグラムを示す。
モグラムを示す。
【図５】図５は実験例５で得られた、ジアホラーゼ濃度
と酸化電流量との関係を示すグラフである。
と酸化電流量との関係を示すグラフである。
【図６】図６は実施例１で得られた、ジアホラーゼ濃度
3.3×10-8Ｍの場合の検量線を示す。
3.3×10-8Ｍの場合の検量線を示す。
【図７】図７は実施例１で得られた、ジアホラーゼ濃度
3.3×10-6Ｍの場合の検量線を示す。
3.3×10-6Ｍの場合の検量線を示す。
【図８】図８は実施例２で得られた検量線を示す。
【図９】図９は実施例３で得られた検量線を示す。
【００２２】
図１に於て(a)は４−アミノフェノールのみの場合の、
(b)はこれにＮＡＤＨを添加した場合の、また(c)はジア
ホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加した場合のサイクック
ボルタモグラムを夫々示す。図２に於て(a)は２−アミ
ノフェノールのみの場合の、(b)はこれにジアホラーゼ
とＮＡＤＨを添加した場合のサイクリックボルタモグラ
ムを夫々示す。図３に於て(a)は２−アミノ−４−メチ
ルフェノールのみの場合の、(b)はこれにジアホラーゼ
とＮＡＤＨを添加した場合のサイクリックボルタモグラ
ムを夫々示す。図４に於て(a)はp−メチルアミノフェノ
−ルのみの場合の、(b)はこれにＮＡＤＨを添加した場
合の、また(c)はジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加
した場合のサイクックボルタモグラムを夫々示す。
(b)はこれにＮＡＤＨを添加した場合の、また(c)はジア
ホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加した場合のサイクック
ボルタモグラムを夫々示す。図２に於て(a)は２−アミ
ノフェノールのみの場合の、(b)はこれにジアホラーゼ
とＮＡＤＨを添加した場合のサイクリックボルタモグラ
ムを夫々示す。図３に於て(a)は２−アミノ−４−メチ
ルフェノールのみの場合の、(b)はこれにジアホラーゼ
とＮＡＤＨを添加した場合のサイクリックボルタモグラ
ムを夫々示す。図４に於て(a)はp−メチルアミノフェノ
−ルのみの場合の、(b)はこれにＮＡＤＨを添加した場
合の、また(c)はジアホラーゼとＮＡＤＨの両方を添加
した場合のサイクックボルタモグラムを夫々示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 測定系にジアホラーゼとＮＡＤＨ（又は
ＮＡＤＰＨ）を共存させ、一般式[I] 【化１】 （式中、Ｒ1，Ｒ3，Ｒ5は、何れか一つがアミノ基又は
低級アルキル置換アミノ基を表わし、他は夫々独立して
水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロ
ゲン原子を表わし、Ｒ2及びＲ4は夫々独立して水素原
子、低級アルキル基、低級アルコキシ基又はハロゲン原
子を表わす。）で示されるアミノフェノール類をメディ
エーターとしてこれを電気化学的に測定することを特徴
とする該アミノフェノール類の測定法。 - 【請求項２】 一般式[I]で示されるアミノフェノール
類が酵素反応により生成するアミノフェノール類である
請求項１に記載の測定法。 - 【請求項３】 一般式[I]で示されるアミノフェノール
類が、酵素免疫測定法に於て、標識酵素が基質に作用し
て生ずるアミノフェノール類である請求項２に記載の測
定法。 - 【請求項４】 標識酵素が、アルカリホスファターゼ、
酸性ホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼである請
求項３に記載の測定法。 - 【請求項５】 一般式[I]で示されるアミノフェノール
類が、生体試料中に存在する酵素が基質に作用して生ず
るアミノフェノール類である、請求項２に記載の測定
法。 - 【請求項６】 生体試料中に存在する酵素が、アルカリ
ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ又はロイシンアミノペプチダーゼ
である請求項５に記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05975892A JP3180415B2 (ja) | 1991-11-19 | 1992-02-14 | 新規な電気化学的測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33003391 | 1991-11-19 | ||
| JP3-330033 | 1991-11-19 | ||
| JP05975892A JP3180415B2 (ja) | 1991-11-19 | 1992-02-14 | 新規な電気化学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05196601A true JPH05196601A (ja) | 1993-08-06 |
| JP3180415B2 JP3180415B2 (ja) | 2001-06-25 |
Family
ID=26400828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05975892A Expired - Fee Related JP3180415B2 (ja) | 1991-11-19 | 1992-02-14 | 新規な電気化学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3180415B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994025618A1 (de) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Byk Gulden Italia S.P.A. | Enzymatische verstärkungssysteme |
| JP2007017442A (ja) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Asulab Sa | 体液中のタンパク分解酵素を差分決定するシステム |
| US8668821B2 (en) | 2005-06-16 | 2014-03-11 | Isis Innovation Limited | Detection of phenols |
| WO2019182008A1 (ja) * | 2018-03-21 | 2019-09-26 | 池田食研株式会社 | ２－アミノフェノール類の測定方法 |
-
1992
- 1992-02-14 JP JP05975892A patent/JP3180415B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994025618A1 (de) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Byk Gulden Italia S.P.A. | Enzymatische verstärkungssysteme |
| US8668821B2 (en) | 2005-06-16 | 2014-03-11 | Isis Innovation Limited | Detection of phenols |
| JP2007017442A (ja) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Asulab Sa | 体液中のタンパク分解酵素を差分決定するシステム |
| WO2019182008A1 (ja) * | 2018-03-21 | 2019-09-26 | 池田食研株式会社 | ２－アミノフェノール類の測定方法 |
| JPWO2019182008A1 (ja) * | 2018-03-21 | 2021-03-11 | 池田食研株式会社 | ２−アミノフェノール類の測定方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3180415B2 (ja) | 2001-06-25 |
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