JPS6017347A - 一種以上の酵素を利用する検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 出またはその程度を測定あるいは監視する検定システム
に関するものである。本発明の検定システムは、場合に
よりその酵素または基質を検出または測定するのに使用
することができる。

本発明者等は、ヨーロッパ特許出願第８２３０５５９８
号明細書において、少なくとも端表面に酵素と、該酵素
が触媒活性になると電荷を電極に移送するメデイエイタ
化合物との組合せ物を具えてなるセンサ電極を提案した
。かかる電極は、適当な電位で釣り合った当該酵素に対
する特異基質と接触する際、基質類の複雑な混合物中で
も酵素／基質反応の存在に応答する信号、すなわち該反
応の程度を指示する信号を生ずる。その理由は、前記酵
素が所望の基質成分に対し特異性があるからである。

かかるシステムの実用操作はメゾイエイタ化合物の組込
みに左右される。かかる化合物として棹種の例が前記特
許出願明細書に開示されており、たとえばポリビオロゲ
ン類、フルオラニル、クロロアニル等があるが、最も特
徴あるメゾイエイタはメタロセン類である。

フェロセン類（ビスシクロペンタジェニル鉄およびその
誘導体）は上述した最後の群に属し、酵素／基質反応で
電荷移送に用いる他のメゾイエイタ類と比べ数多くの利
点を有する。フェロセン（　ＦｅＣＩ）、　）およびそ
の誘導体の特異な構造並びに特性については相当猷の理
論的研究および実験的研究がなされている。１９５１年
に初めて合成されたフェロセンは現在周知のメタロセン
化合物類の最も早い例であった。フェロセン類は水溶液
中の溶解度が劣り、吸光係数が低いため分光光度検定で
は制限されたものとなるが、生物電気化学システムに一
層適していることが確かめられているδフエロセン類は
（ａ）機能化し得るシクロペンタジェニル環の置換によ
り変化させることのできる広範囲な酸化還元電位と、（
ｂ）電気化学的に可逆な一電子レドツクス特性と、（０
）Ｉ）Ｈと無関係な酸化還元電位および還元状態の緩徐
な自動酸化を有する。

これら化合物は、たとえば一方又は両方のシクロペンタ
ジェニル環の置換および／または重合による誘導値の形
成に役立つ。本発明者等は下表に列挙した如き多数の７
工ロセン誘導体を検討した。

１、１　−ジメチルフェロセン　１００　Ｉ，Ｄ　−７
エロセン酢酸　１２４　８　８７０ ヒドロキシエチルフエロセン　１６１　Ｊ：ｓ　−フェ
ロセン　１６５　１，Ｄ　８８５ １、１−ビス（ヒドロキシメチル）フェロセン　２２４
　８　８８５フエロセンモノカルボン＠　２７５　Ｓ　
４２０フエロセン１．１　−ジカルボンｉｌ　２８５　
Ｓクロロフェロセン　８４５　Ｉ，Ｄ　−メチルトリメ
チルアミノフェロセン　４０Ｏ　Ｓ　＋上表中、Ｓは水
溶解性、Ｉ，Ｄは水に不溶で３％洗剤（　’Ｉ’ｗｅｅ
ｎ　−　２　０　）溶液に溶解を示し、Ｅｏは標準カロ
メル電極（以下ＳＯＥと略記する）に対するｍｙで示す
測定値、Ｅはｃｍ−１「１で示す測定値である。

上記に示した種々の７エロセン類のｐＨ　−　７．０に
おける燐酸塩綴衝液中でのＳＧＥに対するＥ−値は１０
０〜４００　ｍＶの電位範囲内にある。このｔ値の傾向
は置換効果に基づいて予期されるものと一致する。一般
に、電子供与基は正の電荷を安定にし、従って電子受容
基より一層酸化を促進する。

上述した７エロセン類のうち、■、１−ジメチルフェロ
センおよびフユロセンモノヵルボン酸が特に広範囲な使
用し得る酵素類のために通常好適であることを確かめた
。

前述した特許出願明細書に記載された発明は基ｆｉ、！
：してグルコースの使用および酵素としてクルコースオ
キシダーゼまたは脱水素酵素の使用（従って、たとえば
糖尿病状況の診断に用いるグルコースセンサ）に特に適
合させたものであるが、一般に適用でき、また本発明者
等によってメゾイエイタ化合物を共同して電気化学的挙
動を検討された他の酵素／基質の組合せとしては下記の
ものがかかるシステムに組入れた特に有用な読取り信号
を出すことがわかった。

酵素　基質 ピルビン酸オキシダーゼ　ピルビン酸塩Ｌ−アミノ酸オ
キシダーゼ　Ｌ〜ルアミノ類アルデヒドオキシダーゼ　
アルデヒド類キサンチンオキシダーゼ　キサンチン類グ
ルコースオキシダーゼ　ダルコース グリコレ−士オキシダーゼ　グリコール酸塩サルコシン
オキシダーゼ　サルコシン ラクテートオキシダーゼ　乳酸塩 ダルタチオンリダクターゼ　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈリポアミド
デバイドロゲナーゼ　ＮＡＤＨＰＱＱ酵素類 ｙル：ｌ−スｇＱ水５）Ｊ素　ダルコースメチルアミン
脱水素酵素　メチルアミンチトクロームＢ−結合酵素 ラクテートオキシダーゼ　乳酸塩 ・非金属黄色蛋白質類 一酸化炭素オキシドレダクターゼ　−酸化炭素キュプロ
プロテインスガラクトーズオキシダーゼ　ガラクトース
しかし、すべての酵素／基質の組合せがこの既知のシス
テムの使用に好都合であるとは限らない。

それは、例えば、これら酵素または基質の入手が容易で
ないとかまたは不安定であるとか、あるいは触媒反応中
酵素内の電子変化を使用し易い形に移すことが困難であ
るという理由からである。

従って、本発明は、少くとも更に他の１種の酵素成分を
使用して修正し入念に研究し案出した検定システムを提
供することである。

本発明の一つは、適当な電位に均衡した電極を第１酵素
と、その酵素によって触媒される反応を受ける基質と、
第１酵素が触媒活性になると、その酵素から電荷を電極
に移送するメゾイエイタ化合物とから成るシステムと接
触させて電極を流れる電流によって生起した反応を測定
し、更に少くとも更に他の１種の酵素とこれに関連する
化合物を前記システムに混入し、この第２酵素は基質を
生成しうるものであるがあるいはこれと反応して基質の
存在、すなわちレベルに影響を与えるが、メゾイエイタ
によって電極とは電気化学的に結合しないもので、かく
することにより第２酵素とそれに関連する化合物が存在
する場合と存在しない場合に流れる電極電流の相異を調
べて第２酵素とそれに関連する化合物の反応の程度を測
定し、一方の分量を、他方の分量が知られている場合に
決定する検定方法である。

本発明者の同日付出願の発明の名称［分析装置及びその
センサ電極」にセンサ電極の性質と製造が記載されてい
る。かかる電極は本発明の実施にも好適で、この場合は
、電極の表面に第１酵素とメチイエイタ化合物を付着さ
せてセンサ電極全６Ｖ／成するのが好適である。

しかし、本発明者の他の同日付出願の発明の名称「特定
結合システムを用いる検定技術」の発明であって、特定
の結合剤（抗体、または核酸配列）とその検定具として
酵素類またはメゾイエイタ類に及ぼす効果に関するもの
には、電極が清浄な炭素棒であるもの、あるいはメゾイ
エイタだけを有するもの、酵素だけを有するもの、ある
いは時には基質を有するもののシステムが記載されてい
る。

かかるシステムは、所要に応じ本発明に組入れることが
でき、これはセンサ電極自体に限定されず、具体化され
るシステムの詳細に関連せず全体の検定法に関するもの
である。

本発明は主として次の二つに細分できる。

（１）その−は、電極表面に第１酵素とメゾイエイタ化
合物を付着させてセンサ電極を構成することである。

（２）その二は、第２酵素が特定の他の基質に触媒的変
化を鋤かせて第１酵素用の基質を生成することである。

上記第１細分に於ては、次のように操作するのがよい。

すなわち、（ａ）センサ電極の表面に第１酵素とメゾイ
エイタ化合物を付着させたものを基質に接触させて定常
電流の読みを得、（ｂ）第２酵素とそれに関連する化合
物とから成りその一方の分量が分っていないものを添加
して競合反応を起こさせ、電極電流を低下させ、（Ｃ）
その低下の割合、程度すなわち電極電流の低下を補償す
るに要する基質の添加程度を知って未知成分の公社を測
定する。

この方法に於ては、第２酵素としては、キナーゼ、例え
ばヘキソキナーゼが好ましく、また関連化合物としては
リン酸塩に富む化合物例えばＡＴＰが好ましい。

本発明の特に有用な方式は、１対の化合物、ヘキソキナ
ーゼとＡ、　Ｔ　Ｐの一方の分量がわかっているものを
組合せて用いその未知の方を検定する方法であり、これ
は、 （ａ）グルコースの溶液に、電極の表面にグルコースオ
キシドレダクターゼと、その酵素が触媒活性になるとそ
の酵素から電荷を電極に移送するメゾイエイタ化合物と
を有する電極を接触させてそのグルコースレベルに基づ
く定常電極電流を発生させ、（′ｂ）この溶液にヘキソ
キナーゼとＡＴＰを添加して、グルコースについて電極
には感応しない競合のホスｔ、　ｌル化反応を起こさせ
てその反応に応じて前記定常電流を低下させ、 （Ｃ）未知のレベルの値を、電流低下を補償するグルコ
ースの割合、程度からめることを特徴とする。

本発明の他の特に有用な方式はクリアチンキナーゼの検
定方法であり、これは、 （〜へキソキナーゼとアデノシンニリン酸とアデノシン
リン酸とグルコースの混合溶液に、電極表面にグルコー
スオキシドレダクターゼ酵素とその酵素が触媒活性にな
るとその酵素から電荷を電極に移送するメゾイエイタ化
合物とを付着した電極を接触させてそのグルコースレベ
ルに基づく定常電極電流を発生させ、 （ｂ）この溶液に、被検定クリアチンキナーゼを、アデ
ノシンニリン酸（ＡＤＰ）をクリアチンリン酸の反応に
よりアデノシンニリン酸（ＡＴＰ）に転化する条件下で
添加してその結果、グルコースをオキシドリグクターゼ
酵素反応と競合させて反応させ、ヘキソキナーゼとＡＴ
Ｉ）のホスホリル化によって、電極に不感応のグルコー
ス−６−リン酸を生成し、そのためその生成に対応して
定常電流を低下させ、 （０）未知のクリアチンキナーゼレベルの値を、電流低
下を補償するグルコースの割合、程度からめる方法であ
る。

コノ発明の他の特に価値のある方式はクレアチンの検定
法であり、これは、 （ａ）へキソキナーゼ、アデノシン三リンＩ’Ｗ（ＡＴ
Ｐ　）、クレアチンキナーゼ、及びグルコースの混合溶
液とそれ自身の表面にグルコースオキシドレダクターゼ
酵素及びメゾイエイタ化合物を有する電極を接触させ、
酵素が触媒活性を有する場合酵素から電極に電荷を移動
させ、それにより、グルコース−６−リン酸への競合的
ＡＴＰ／ヘキソキナーゼホスホリル化反応後残存する利
用しうるグルコースレベルに応する定常電極電流を生成
させるが、該ホスホリル化反応に電極は感じないため定
常電流が相反して減少される定常電流を生成されること
寥 （ｂ）この溶液に検定すべきクレアチンをＡ　Ｔ　Ｐ　
カＡＤＰに転化される条件で加え、クレアチンキナーゼ
によりクレアチンリン酸を生成させ、それにより競合的
グルコースホスホリル化反応に利用されうるＡ　Ｔ　Ｐ
　鮎を減少させること、（０）未知クレアチンレベルの
値を電極電流における変化の割合又は程度からめること を特徴とする。

この発明の第２の細区分はむしろ一層精巧な電極の製作
に役立つ。すなわち、電極自体に第１の酵素、それに対
するメゾイエイタ化合物及び第２酵素を付着させて前記
のさらに新たな基質用のセンサ電極を構成することであ
る０ 例えば、電極をサルコシンオキシダーゼ又はデヒドロゲ
ナーゼ、クレアチナーゼ及びｔｌｊ＆をサルコシンから
電極に移動させるメゾイエイタで波釘することができ、
電極をクレアチンを含有する溶液と接触させてサルコシ
ンに転化してクレアチンを検定する。

さらに例を挙げれば、電極をサルコシンオキシダーゼ又
はデヒドロゲナーゼ、クレアチナーゼ、クレアチニナー
ゼ及び電荷をサルコシンから電極に移送させるメゾイエ
イタで被覆することができ、電極検定すべきフレア、チ
ニンと接触させてクレアチン、次いでサルコシンに転化
してクレアチンを検定する。

発明者らの前述の出願において述べたように、酵素とし
てはグルコースオキシダーゼ又はピロロキノリンキノン
デヒドロゲナーゼ（キナーゼ／ＡＴＰ法に対し）が好ま
しく、また一般的に言ってフェロセンが好ましいメゾイ
エイタである。この発明が役に立つ可能性のある他の点
は、酵素とメゾイエイタの化学結合の概念である。発明
者らの上記の「特定の結合システムを利用する検定技術
」という名称の同日付出願において詳細に述べたように
グルコースオキシダーゼのタンパク質構遺の場合酵素活
性を害すまでなら８〜１２個までの７工ロセン単位を酵
素と化学的に結合させることは可能である。このような
改良酵素／メゾイエイタの結合をこの発明で用いうる。

この発明をさらに図面によって説明する。

グルコースセンサ電極は炭素体から出発してつくった。

その上に１，１−ジメチル７エロセンのトルエン溶液を
付着させた。トルエンを蒸発させ、１．１−ジメチルフ
ェロセンの層を残し、その上に酵素グルコースオキシダ
ーゼをカルボジイミド結合により設ける。この複合電極
に隣接するが接触することなく標準カロメル電極を設け
た。

発明者らの前記ヨーロッパ特許出願第８’２８０５５９
８号及び同日付出願の「分析装置及びそれに用いるセン
サー電極」という名称の明細書中に上記−鍛型の＠極の
多数の形の製作及び構造的特徴が詳細に述べられる。そ
れらの開示は引用としてここに包含する。このようなフ
ェロセン／グルコースオキシダーゼ電極自体はこの発明
の主題でない。

上記のようにつくられた電極を標準カロメル電極（ＳＯ
Ｅ）に対して＋１５０　ｍＶに保つ場合、それは有用な
範囲にわたって、それが接触する液体基質中の利用しう
るグルコースレベルに対上直線的に応答する。

前の発明において、基質のグルコースレベルを測定した
。この発明において第１図で例示するように、既知の初
レベル（又は少なくともしゅうぶんなレベル）のグルコ
ースＣＧ）を通常用い、競合反応をこのグルコースに対
して起こさせ、グルコースがグルコースオキシダーゼＧ
Ｏと反応して′重子移動すなわち電荷移動を７エロ會ン
を経て電極はＪ二連）に与えうるか、加えたヘキソキナ
ーゼ酵素（ＨＫ）及びアデノシン三リンｆｉ（ＡＴＰ）
と電極につながらない反応をしうるかのいずれかが起る
。

第１の場合においては酵素によりグリセルアルデヒド又
はグルコノラクトンのようなグルコース酸化生成物が生
成され８第２の場合には、グルコース−６−リン酸が生
成するとともにＡＴＰがＡＤＰ（アデノシンニリン酸）
に転化される。ＡＴＰ及びＨＫの濃度が高い程この競合
反応が電極宙、流の期待した読みを減少させる程度が大
である。ＨＫ濃度既知の場合、Ａ１２ｍ度を推論するこ
とができ、その逆も可能である。勿論、電極を定性的表
示すなわちＨＫ／Ａ　Ｔ　Ｐの存在の単なる検出に用い
ることも可能である。

第２図は前記のようにつくった電極を用いる検定システ
ムの他の可能な配置を示す。この例において検定はホス
ホグアニジン、クレアチンリン酸、ＣＰをクレアチンβ
Ｎに転化する酵素クレアチンキナーゼ（ＯＫ　）　（Ｅ
、０．２．７．８．２　）の濃度を測定する（システム
はアルギニンリン酸のようなりレアチンリン酸以外のホ
スホグアらジンを基質として有する酵素の検定を同様に
良く行うことができた；又は酵素の適当な選択によりホ
スホエノールビルパートのような他のホスホリル化基質
を検定することができた）。

操作において、トリス／ＨＣ１で緩衝化した液系はｐＨ
７のグルコース（Ｇ）２０ｍＭ、クレアチンリン酸（Ｃ
Ｐ）（２０ｍＭ）、アデノシンニリンｅ（ＡＤｐ）（５
ｍＭ）及ヒヘキソキナーゼ（ＨＫ）（２０ｍ−ｍ７）を
含有する。これを１　、　】１−ジメチルフェロセン／
グルコースオキシダーゼ電極と接触させグルコースがそ
の酸化生成物ＧＬに酸化されるのに応じて定常読みを与
える。クレアチンキナーゼを加える場合ホス７アートが
クレアチンホスファートから除かれクレアチン分子が残
る。このホスファートはクレアチンキナーゼによりアデ
ノシンニリン酸（ＡＤＰ　）に移されアデノシンニリン
酸（ＡＴＰ　）を生じる。かくてこれは酵素へキソキナ
ーゼにより接触される反応においてクルコースト反応し
それによりグルコースヲホスホリル化してグルコース−
６−リンｅ（ＧＰ）を生成させるが、この反応は電極で
ひきおこされたグルコース酸化反応と競合する。その結
果、溶液中のグルコースの活性、したがって電極の電流
は減少する。ホスホリル化されたグルコースは電、極で
活性がない。

クレアチンキナーゼの濃度は電極における電流の減少の
割合を計算することにより；グルコースで元の電流が回
復されるまで滴定することにより；又はシステムを定常
状態に達せしめて最終の電流の読みを最初の電流の読み
と比較することにより推定しうる。第５図は第２図に関
して前述したようなシステムで得られた最初の定常接触
電流がクレアチンキナーゼを含有する溶液をシステムに
加えた場合どのように低下するかを示す。

クレアチンキナーゼ検定は１０〜１０４単位／リットル
の範囲で線状応答を示し、したがって広範囲の状態の診
断、例えば心筋損傷（急性心筋梗塞又は通性（ｆａｃｕ
ｌ、ｔａｔｉｖｅ　）心筋損傷のような）振せんせん妄
及び筋ジストロフィー、それラスべてが血液中における
クレアチンキナーゼ準位の上昇を起こす、の診断に用い
うる。

第８図は基質クレアチンの検出に用いうる可能な例をさ
らに示す。この例においてｌ）Ｈ９に緩衝化されクレア
チンキナーゼにより接触される反応の方向は逆になる。

操作において、定常システムを前記のように調製するが
、グルコース（Ｇ）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）、クレア
チンキナーゼ（ＯＫ）及びアデノシンニリン酸（ＡＴＰ
　）による。上記グルコース１，１′−ジメチルフェロ
セン電極を溶液に導入する場合、定常状態電極電流は上
記グルコースレベルで利用しうるちのより小さい。これ
はアデノシンニリン酸が溶液中のグルコースのＧＰ（グ
ルコース−６−リン酸）へのホスホリル化を推進しした
がってグルコースの電極における活量を減少させるから
である。換言すれば、既知の範囲の競合反応を生じさせ
安定化させる。

この既知の競合反応にクレアチン含有試料を加えた場合
クレアチンもクレアチンキナーゼによりホスホ・リル化
されこれに応じてアデノシンニリン酸のレベルの減少が
起こる；換言すれば第２の未知ルヘルの競合反応が起こ
る。ホスファートをグルコースに移してグルコース−６
−リン酸を生じるのに利用しうるクレアチンキナーゼの
量はりレアチンをクレアチンリン酸に転化させるのに用
いられるものがあるのでしたがって減少させられる。

他の変数が既知である場合、加えたクレアチンのレベル
を検定することが可能であり、又は加えたクレアチンが
既知の場合アデノシン三リン酸のレベル検定が可能であ
り、各場合単に電極における活量の変化を観察すること
によって検定しうる。

この発明の検定システムはプラスマとともに用いうるし
、一般的に言って血清、尿、間質液、全面、唾液等のよ
うな任意の生物学的流体とともに使用することができる
。（例えば）緩衝液中のタレアヂンキナーゼの活量はブ
ラスマ中の酵素の活量とよ（（ｃｃ　”　０．９０　）
相関することを確かめた。

この例の範囲内で種々の改良を行いうる。例えハ、クレ
アチンをグレアチンに転化する酵素をさらに混合して検
定システムをクレアチン用に構成することができる（下
記の第４図はクレアチニン用の他の検定システムを示す
ものではあるが前記のことを含む）。

第４図は異なる型の検定技術を示し、これは基質に対す
る競合反応に依存せず、グリシン誘導体の検定に適する
異なる酵素を利用する。

第４図に示す方法の操作において、電極を前記及び引用
した発明者らの相応する本願の明細書中に述べたように
してつくるが、グルコースオキシダーゼを電極表面に固
定化する代りに表面にサルコシンオキシダーゼ、クレア
チニナーゼ（クレアチニンアミノヒドロラーゼ）及びク
レアチナーゼ（クレアチンアミジノヒドロラーゼ）の混
合物を固定化する。

サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）は炭素１個の化合物
の代謝における中間物であり、アクチンマイシンの成分
、代謝拮抗物質の効力基である。

サルコシンオキシダーゼは肝臓及び腎臓ミトコンドリア
中に存在しまた微生物源例えばコリネフォルム細菌種の
細胞からも得られる。サルコシンデヒドロゲナーゼはプ
ソイドモナスの細胞から得ることができる。１！極をク
レアチニンを含有する基質と接触する場合 （ａ）クレアチンがクレアチニンからクレアチニナーゼ
の作用により生成される。

（ｂ）サルコシンがクレアチンから酵素クレアチナーゼ
により生成される。

（（１）グリシンがサルコシンから酵素サルコシンオキ
シダーゼにより生成され、この酵素が電子を電極に７エ
ロセンを経て送りクレアチニン濃度に定量的に関係する
読み出し信号を与える０適当に目盛りを決めた装置によ
り測った電極電流はクレアチニン濃度の尺度である。

次にこの発明を特定の例によってさらに詳細しこ説明す
る。

例　１ ルギン（Ｌｕｇｇｉｎ　）毛細管によって作業室力）ら
隔離された、４　ｍｍ直径の金の作業電極と、０．５ｃ
ｍ２の白金ガーゼの対向電極と、さらＧこ飽和甘木補助
電極（ＳＯＥ）とを組み込んだ２室の電気イヒ学セルの
作業室に対し、フェロセンモノカルボキシルｐ　（２０
０ｐＭ　）を含む１ｍｌの’ｌ”ｒｉｓ　／　ＨＣ１緩
衝剤（５０ｍＭ　、　ｐＨ７，５）が加えられた。

第６図は、０〜＋５００ｍＶ対ＳＣ′Ｅの範囲にわたる
５　ｍＶｓ−１の走査速度において得られたｆｕ流の循
環する電圧電流（ｍｖ−μＡ）グラフを示す。この前進
及び逆行の電気化学的波は、Ｅ局がこの装置の半波電位
である場合に、可逆的の一組（すなわちカップル）　Ｅ
Ｈ（フエロセンモノ力ルボギシル酸／フェリジニウムモ
ノカルボキシル酸）　−＝　＋２７　Ｆｉ　ｍ■対ＳＯ
Ｅと一致する。

サルコシン脱水素酵素ｆ、　Ｑ　工Ｕｍｌ””及びクレ
アチニンアミド水解酵素５０ＩＵｒｎｌ−”のそのあと
の順次の添加は、フェロセンモノカルボキシル酸の可逆
的電気化学、曲線（ａ）になんら影響を及ぼさなかった
。

しかしながら、さらにクレアチナーゼ（り１７アチン分
解酵素）　（５ｍＭ　＞の添加に際し、ポルタンメトリ
ーによるグラフ（ｂ）が得られた。高められたＴ１３　
Ｐｌｉ　’Ｒ流は、フエロセンモノ力ルボギシル酸が、
還元されるザルコシン脱水素酵素を経る反応によって７
エリシニウムイオンから珂生される触媒により連結され
た（−組の）反応を表わす。

、この挙動は反応成分のすべてが存在する場合にのみ観
察される。どの酵素でもどれか存在しないシステムすな
わち系に対しては、クレアチニン、クレアチン及びサル
コシンを、それぞれ、５ｍＭ添加しても、フェロセンモ
ノカルボキシル酸の電気化学に影響を及ぼさない。又、
もう１つ別の例において、緩衝剤、クレアチニン、フェ
ロセンモノカルボキシル酸、タレアチンアミジノ氷解酵
素、及びサルコシン脱水素酵素の添加は、なんら触媒的
電流を与えずしてただ前進及び復帰が、クレアチナーゼ
（クレアチン分解酵素）が加えられるまで、フェロセン
モノカルボキシル酸に対して継続する。

用いられたすべての材料は、シグマ化学会社によって供
給された。

里−胆　−クレアチンキナーゼ（活素）に対する効力検
定（評価分析） （ａ）一般 血栓症による冠状動脈の突然かつ完全な閉鎖は、心筋組
織帯への血液の供給を断ち、酸素及びグル、コースをそ
の組織帯から奪う。罹恵すなわち冒された筋肉への損傷
が、血液循環への心臓酵素の放出に導く。この酵素クレ
アチンキナーゼ、（Ｅ（３２・７・８・２）（ＣＫ）は
、心臓筋肉のうちの可溶性筋漿（筋細胞の物質で、線維
以外のもの）の約２０％を構成する。従って、血液中の
ＯＫの高いレベルの存在は、しばしば急性心筋梗塞（Ａ
ＭＩ）の診断（鑑別）をもたらす。

血漿中のＯＫ活性を測定する幾つかの方法が、考案され
てきて、１年当り８ｏ百万を越える決定（定量）を行な
うため、臨床生化学検査室で毎日用いられている。

クレアチンキナーゼは、アデノシン−５′−トリホスフ
ェート（ＡＴＰ）がらクレアチンへのボスフェート残余
（残留物）の可逆的転移を接触的に作用させる。

この反応生成物、クレアチンボスフェートは、収縮、弛
緩及び筋細胞内の物質の輸送のための主要なエネルギー
貯蔵を表わす。

クレアチンキナーゼは、分子［８２０００の二、量体（
二型性）酵素であり、分子ｆｄ４１０００（８）の２個
のサブユニット（すなわち、副構成単位）から構成され
る。人間の組織には２個の異なったサブユニットの型が
存在し、Ｍ（筋）とＢ（脳）型である。これらのイソエ
ンチームすなわち異性（又は同類）酵素を、電気泳動技
術によって分離することができるし又、山羊の非人間Ｏ
Ｋ　−ＭＢ抗体（免疫体）の使用に基礎をおく免疫抑制
法によって分離することもできる。この異なった異性酵
素を分離する方法は臨床上重要であり、それは、血漿に
おける高い異性酵素のレベルが検出され、Ａ　Ｍ　Ｉ　
、例えば、手術、筋異栄養（発育異常）、及び筋損傷と
、激しい運動とは別の原因に関連することが見出された
からである。これらは表■で一覧表にされている。これ
は、ＡＭＩに対する全血漿ＯＫ効力検定の重要性を否定
するように思われるが、実際には、この効力検定は、乙
断がなされる前に他の臨床上の要素も考慮されるので太
き・な価値が残る。

表　工 条　件　全ＯＫ活性Ｕ／Ｌ　ＣＫ−五（Ｂ活性Ｕ／Ｌ急
性心筋梗塞　８０−１９７０　６−２８２心臓発生ショ
ック　９０−８６０　５−１１４心臓発生の細動除去　
１８０−５８０　９−４１デユシエン筋異栄養　４００
−４５５０　８１−２８０整形外科手術　１５−６８０
　０−１８頭部損傷（負傷）　１５８−８８０　０−１
８神経外科手術　６８−６１０　０−８８ウエイトリフ
ター　１１０−７４０　０−１０、フェロセンをベース
にしたグルコースｍ素電極の迅速な応答時間は、嵩グル
コース濃度の警官に加えて、この装置を・嵩グルコース
濃度の変化速度を監視するのに用いることができること
を示す。

かくしてＯＫ活性を、グルコースの消費速度を監視する
グルコース酵素電極によって、例えば第２図に示す連結
した反応連鎖を用いて決定することができる。最適化条
件のもとでは、電極電流の低下速度は、グルコースの消
費速度に比例すべきであり、このグルコースの消費速度
は、順次ＣＫの活性を評価するタレアチンホスフエート
の消費速度に比例するだろう。

（ｂ）試葵 タレアチンホスフエート、アデノシン−５′−ジホスフ
ェート、アデノシン−５′−トリホスフェート、３７℃
において８００　ＩＵ■　の活性をもったウサギの筋肉
からのタレアチンキナーゼ、及び８７°Ｃにおいて１６
００　ＩＵｍ９＋”の活性をもったイーストすなわち酵
母からのヘキソキナーゼは、ベーリンガーによって供給
された。Ｄ−グルコース及び塩化マグネシウムは、アナ
ラアール（Ａｎａｌａ　Ｒ）グレード（すなわち等級）
を有し、ＢＤＴ（によって供給された。すべての実験に
は、ＨＯＩによってｐＨ７，０に調節された２　５４　
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが用いられた
〇（○）電気化学実験 ４酊直径の熱分解黒鉛の作画電極を用い例１に記載した
セルによって、直流の循環式のポルタンメトリーの実験
を行なった。

グルコース酵素Ｎ極を用いた実験は、攪ｎ俸を備付けた
、第１の原型デザインのｌ　ｍｌの８室の電気化学セル
によって行なわれた。定常状態のグルコースに依存する
電流における変化の速度は、オックスフォード電極ボテ
ンシオスタート及びブライギンＢ５−２フ１チヤートレ
コーダーを用いて、１６０　ｍＶ対ｓ　ＯＥニおいテ平
衡を保たせたグルコース酵素電極によって測定された。

すべての効力検定は８７°Ｃにおいてサーモスタットに
よる恒温制御のもとに行なわれた。

（ｄ）血漿試料 ヘパリン化された血漿試料、すなわち生理的抗凝血作用
があるヘパリンを血液に加えて得た血漿試料は、オック
スフォードのジョンラドクリフ病院の臨床生化学検査室
によって冷凍されて供給された。

（ｅ）グルコースオキシダーゼ（酸化酵素）反応の連結
解除 第７図は、（ａ）において、２０１ｎＭの塩化マグネシ
ウム及び１０　ｍＭのグルコースを含む１）Ｈ７，Ｏの
２５　ｍＭのＴｒｉｓ　−ＨＯＩ緩衝剤におけるフェロ
センモノカルボキシル酸の直流の循環式のポルタンメト
リーによるグラフを示す。グルコースの酸化酵素の添加
は、グルコースの酵素による連結された酸化から生ずる
、酸化電位において典型的の触媒電流を示す曲線Φ）を
与えた。ヘキソキナーゼ２０ＩＵｙ＋Ｊ−１が添加され
る場合、ポルタンメトリーによるグラフの変化は観察さ
れない。しかしながら、１０　ｍＭの最終濃度へＡＴＰ
の添加に際しては、触媒作用の挙動はもはや観察されず
、フェロセンの可逆的Ｍ気化学に関連するポルタンメト
リーによるグラフが（ａ）において再び得られる。これ
らの観察は、グルコースの附燐酸反応と一致してグルツ
ース−６−ホスフェートを生成し、かぐしてｍ気化学的
に連結された酸化反応のためこの受媒質を溶液から取除
く。

コノシステムの成分のうちどれも・フェロセンモノカル
ボキシル酸の電気化学に干渉しなかったか、又は走査さ
れた一位の範囲、０−４５０　ｍＶ対ＳＣｇ（すなわち
、ＳＯＥに対する０−４，５０ｍＶ）にわたっていかな
る直流による電気化学も示さなかったので、グルコース
酵素％ｉ極の応答を、最初はＡＴＰ！告器として、次い
でキナーゼ活性の監視のため、調査することは可能であ
った。

（ｆ’ｌ　Ａ　Ｔ　Ｐセンサーとしてのグルコース酵素
電極第８図は、１ｏｍＭのグルコ、−ス及びヘキソキナ
ーゼ２０　ＩＵ−におけるグルコース酵素電極の電流一
時間の応答の線図を示す。ＡＴＰの５個の部分標本（各
々は、２．０　ｍＭの５個の濃度に対する）の系列が加
えられ、定常状態の電流の減少が１各々添加後に測定さ
れた。第９図は、加えられたＡ、　Ｔ　Ｐの関数として
の定常状態の電流を描く。

第１０図は、０．９９の相関係数が計算される加えられ
たＡＴＰの舟と、消費されたグルコースの量を互いに関
連させる。この実験は、グルコース酵素電極を、ヘキソ
キナーゼの存在において、ＡＴＰによるグルコースの化
学量論による消費を監視するのに用いることができるこ
とを示している。この電極を再使用することができる。

すなわち、第８図は、この電極がこの実験の終りにおい
てグルコースをさらに加えるとそれに応答する。

第１１図は、ヘキソキナーゼ２０工Ｕｍｌ。

Ａ　Ｄ　Ｐ　（５，０ｍ　Ｍ　）及びタレアチンボスフ
エート（２０ｍｙ　）をさらに添加した後に、２０　ｍ
Ｍグルコースにおけるグルコース酵素電極の電流一時間
応答が安定であることを示している。これらの試薬濃度
は、この検定におけるグルコースの消ｇ！速度が、クレ
アチンの活性によって制限されるということを保証する
のに十分過剰であることが見出された。５００　ＩＵ　
（’の報告された活性をもつ、クレアチンキナーゼかつ
この系に加えられる場合１その電流は時間と共に減少す
る。減少のこの最初の速度から、グルコースの消費の速
度が計算された。このグルコース消費速度は、消費され
たμモルのタレアチンホスフエー）　ｍｌｎ　■　にお
ケルクレアチンキナーゼの活性に光斑であるべきである
。これらの結果から０．９９の相関係数が計算されたく
第１２図）。

ａｌ）クレアチンキナーゼの効力検定の検出限度ＡＭＩ
後の患者においては、８０−２００　ＩＵ７−’の範囲
における血漿ＯＫ活性は共通である。この検定手順は従
って、緩衝溶液にて研究する場合、ＯＫの臨床レベルを
監視するのに好適であることが期待される（、第１２図
参照）。この電極応答の上限は、約１０　ＩＵ　ｔｎｔ
　（１００００ＩＵｌ）である。

（ｉ）血漿試料のクレアチンキナーゼの効力検定ＡＭＩ
後の患者からほんものの血漿試料を得ることは可能でな
かった。それ故、試料は、人間の血漿に臨床的に関連し
た濃度のＯＫを加えることによってシミュレーションを
行なった。ＡＤＰの部分標本、ＭｇＧｔ２及びＵＫも又
、上に用いたのと同じ試薬濃度を与えるためにこの血漿
に加えた。

この血漿に存在する最初のグルコース濃度は、グルコー
ス酵素電極によって決定され、かつグルコースを加える
ことによって２０　ｍＭまで増大した。

この反応はタレアチンホスフエートの添加によって開始
した。表■は、ｐＨ７，０における緩衝剤中、及びｐＨ
７，７における血漿中に供給されたクレアチンキナーゼ
の活性に対して得られたデーターを示す。血漿に対する
これらのデーターは、ＣＫ（逆反応に対する）の活性が
ｐＨ７，０に標準化される。標準化されたデーターに対
する相関図面は第１８図に表わされ、これから０．９７
の相関係数が得られた。ｎ−９、Ｖ−−１，０５士０．
０８゜グルコース酵素電極に基づく血漿中のクレアチン
キナーゼに対する効力検定の実行は、この方法がほんも
ののＡＭＩ後の患者の試料を用いる現在の方法とのもっ
と詳細な比較を受けることができることを示唆する。そ
の上、グルコース酸化酵素とへキソキナーゼとを共に非
可動化すなわち固定することによってこの酵素電極をさ
らに精製することができ、かくしてヘキソキナーゼを効
力検定試料に添加する必要性を除去する。

表　■ １５０　１５２　６４．７１５／Ｌ １５０　１．５２　６ｆ１．８１５９ １５０　１４１８　５９．６１．４２ ９０　８８　３．７．０　８８ ７０　７６　８１．５　７５ ８０”　２．５　１ｉ、９ １５　１５　１．９　４．５ ７．５　７．．８　２．８　５．３ ７゜５　７．８　３．６　８．６

【図面の簡単な説明】

第１図は競合的なグルツース酸化酵素／グルコース及び
ヘキソキナーゼ／グルコース反応ヲ用いてＡＴＰ又はヘ
キソキナーゼを検出又は測定する模式図であり、 第２図はクレアチンキナーゼを検出又は測定するためさ
らに改良した類似の反応を示す模式図であり、 第３図はクレアチンを検出又は測定するためさらに改良
した類似の反応を示す模式図であり、第４　ＦＡはクレ
アチニンの検出又は検定する反応の模式図であり、 第５図は第２図に関して述べたような定常状態溶液にク
レアチンキナーゼを加える効果を示すグラフであり、 ＠６図〜第１３図はポルタンメトリーによるグラフと、
行った特定の実験から導き出されたグラフによる結果と
を示す。 しｊ：；に’）＋ｊ’９（１”１＊ｆコ文ＥｆｌＥ’ｊ
　シ）グし７．牛゛／ヘナーゼン消７７Ｏ ＦＩＧ、５゜ ＯＳＣＥ＋ｆすす’ｒＥ／ｍＶ　５０゜ＦＩＧ、６ 時１’／Ｉ／今 ６［ ０２、４６８１０ ＡＴＰ／Ｐｍｏ！ Ａ丁Ｐ？Ｆ刀Ｕ　／ｐｍｏｌ ○０１　０１　１０　１０ Ｃバ冷１１・生ＩＷｔｎ１ ０　．５　１　１．５ ＩＬ）／ｒｔｄイ＃１−刺 ＦＩＧ、＋３゜ 第１頁の続き 優先権主張　＠１９８３年５月５日［相］イギリス（Ｇ
Ｂ）■８３１２２６０ ０１９８３年５月５日［相］イギリス （ＧＢ）■８３１２２６５ ＠１９８３年９月６日［株］イギリス （Ｇ　Ｂ　）＠８３２３７９７ ０１９８３年９月６日［相］イギリス （ＧＢ）■８３２３７９８ ＠１９８４年２月２９日■イギリス （ＧＢ）■８４０５２６２ ＠１９８４年２月２９日■イギリス （ＧＢ）■８４０５２６３ ＠発明者　アンソニー・ニドワード・ジョージ・カス イギリス国ロンドン・エヌダブ リュ−１０１エイチジエイ・ト リスヒル・ギアリー・ロード６１ 手　続　補　正　書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第　９０８３４号 ２、発明の名称 一種以上の酵素を利用する検定方法 ４代理人 ７、補正の内容（別紙の通り） 図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　適当な電位に均衡したｉ！極を、第１酵素と、その
   酵素によって触媒される反応を受ける基質と、第１酵素
   が触媒活性になると、その酵素から電荷を電極に移送す
   るメゾイエイタ化合物とから成るシステムと接触させて
   電極に流れる電流によって生起した反応を測定し、更に
   他の少くとも１種の酵素とこれに関連する化合物を前記
   システムに混入し、この第２酵素は基質を生成しうるち
   のであるかあるいはこれと反応して基質の存在すなわち
   レベルに影響を与えるが、メゾイエイタによって電極と
   は電気化学的に結合しないもので、がぐす名ことにより
   第２酵素とそれに関連する化合物が存在する場合と存在
   しない場合に流れる電極電流の相異を調べて第２酵素と
   それに関連する化合物の反応の程度を測定し一方の分母
   を、他方の分量が知られている場合に決定することを特
   徴とする検定方法。 ２、　電極が、その表面に第１酵素とメゾイエイタ化合
   物とを有しセンサ電極を構成する特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ＆　第２酵素が基質に対し競合反応を起・ニして電極に
   流れる電流の低下をもたらす特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４（ａ）センサ電極の表面に第１酵素とメゾイエイタ化
   合物を付着させたものを基質に接触させて定常電流の読
   みを得、（ｂ）第２酵素とそれに関連する化合物とから
   成りその一方の分量が分っていないものを添加して競合
   反応を起こさせ、電極電流を低下させ、（Ｃ）その低下
   の割合、程度、すなわち電極電流の低下を補償するに要
   する基質の添加程度を調べて未知成分の分量を測定する
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 ５、　第２酵素がキナーゼ、関連化合物が高エネルギー
   リン酸塩である特許請求の範囲第３又は第４項記載の方
   法。 代　第２酵素がヘキソキナーゼ、関連化合物がＡＴＰで
   ある特許請求の範囲第８又は第４項記載の方法。 ７．１対の化合物、ヘキソキナーゼとＡＴＰの一方の分
   量がわかっているものを組合せて用いその未知の方を検
   定する方法において、（ａ）グルコースの溶液に、電極
   の表面にグルコースオキシドレダクターゼと、その酵素
   が触媒活性になるとその酵素から電荷を電極に移送する
   メゾイエイタ化合物とを有する電極を接触させてそのグ
   ルコースレベルに基づく定常電極電流を発生させ、 （ｂ）この溶液にヘキソキナーゼとＡＴＰを添加して、
   グルコースについて電極には感応しない競合のホスホリ
   ル化反応を起こさせてその反応に応じて前記定常電流を
   低下させ、（Ｃ）未知のレベルの値を、電流低下を補償
   するグルコースの割合、程度からめることを特徴とする
   検定方法。 ＆　クリアチンキナーゼの検定方法において、（に）へ
   キソキナーゼとアデノシンニリン酸とアデノシンリン酸
   とグルコースの混合溶液に、電極表面にグルコースオキ
   シドレダクターゼ酵素とその酵素が触媒活性になるとそ
   の酵素から電荷を電極に移送するメゾイエイタ化合物と
   を付着した電極を接触させてそのグルコースレベルに基
   づく定常電極電流を発生させ、（ｂ）この溶液に、被検
   定クリアチンキナーゼを、アデノシンニリン酸（ＡＤＰ
   ）をクリアチンリン酸の反応によりアデノシンニリン酸
   ＋　ＡＴＰ　）に転化する条件下で添加してその結果、
   グルコースをオキシドリダクターゼ酵素反応と競合させ
   て反応させ、ヘキソキナーゼとＡＴＰのホスホリル化に
   よって、電極に不感応のグルコース−６−リン酸を生成
   し、そのためその生成に対応して定常電流を低下させ、 ＜Ｃ＞未知のクリアチンキナーゼレベルのＭＥ、電流低
   下を補償するグルコースの割合、程度からめることを特
   徴とする方法。 ９　クレアチンの検定方法において、 （ａ）へキソキナーゼ、アデノシンニリン酸（ＡＴＰ）
   、クレアチンキナーゼ、及びグルコースの混合溶液とそ
   れ自身の表面にグルコースオキシドレダクターゼ酵素及
   びメゾイエイタ化合物を有する電極を接触させ、酵素が
   触媒活性を有する場合酵素から電極に電荷を移送させ、
   それにより、グルコース−６−リン酸への競合的ＡＴＰ
   ／ヘキソキナーゼホスホリル化反応後残存する利用しう
   るグルコースレベルに応する定常電極電流を生成させる
   が、該ホスホリル化反応に電極は感じないため定常電流
   が相応して減少させる定常電流を生成させることジ （ｂｌこの溶液に検定すべきクレアチンをＡＴＰがＡＤ
   Ｐに転化される条件下で加え、クレアチンキナーゼによ
   りクレアチンリン酸を生成させ、それにより競合的グル
   コースホスホリル化反応に利用されうるＡＴＰ量を減少
   させること、 （Ｃ）　未知クレアチンレベルの値を電８Ｉｉｉ電流に
   おける変化の割合又は程度からめること を特徴とする検定方法。 １０、第２酵素が、特有の別の基質に触媒による変化を
   及ぼして第１酵素のための基質を生じさせる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ＩＬ　’ｌ！極に第１酵素と１そのためのメゾイエイタ
   化合物と、第２酵素とを付着させて上記別の基質用のセ
   ンサ電極を構成する特許請求の範囲第１θ項記載の方法
   。 ｌλ　電極をサルコシンオキシダーゼ又はデバイドロゲ
   ナーゼと、クレアチナーゼと、すＡノコシンから電極へ
   電荷を移送するメゾイエイタとで被覆し、この電極をク
   レアチン含有溶液に接触させてサルコシンへ転化しクレ
   アチンを検定する特許請求の範囲第１１項記載の方法。 Ｅ＆電極を、サルコシンオキシダーゼ又はデバイドロゲ
   ナーゼと、クレアチナーゼと、クレアチニナーゼと、及
   びサルコシンから電荷を電極に移送するメゾイエイタと
   で被覆し、これをクレアチニンと接触させて順次クレア
   チン、サルコシンへ転化させクレアチニンを検定する特
   許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４　ｍｌ酵Ｘがグルコースオキシダーゼである特許請
   求の範囲第１項ないし第９項いずれかの記載の方法。 １＆　第１酵素がグルコースデバイドロゲナーゼである
   特許請求の範囲第１項ないし第９項いずれかの記載の方
   法。 １ａ　メゾイエイタが７エロセンである特許請求の範囲
   第１項ないし第１８項いずれかの記載の方法。 １７、メゾイエイタが１．１−ジメチルフェロセンであ
   る特ｇ／ｆ請求の範囲第１項ないし第１８項いずれかの
   記載の方法。