JPH10225300A - グルコースまたはａｄｐの高感度測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清、血漿、尿、髄液などの被検液中に存在
するか形成されるグルコースまたはＡＤＰを簡便で高感
度に測定する。 【解決手段】 グルコースおよびＡＤＰのいづれか一成
分を含有する被検液にグルコースおよびＡＤＰのいづれ
か残りの成分および下記反応 【化１】 を触媒する酵素蛋白を作用させ、次いで反応によって生
成するグルコース−６−リン酸を、酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）類または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素とし、少
なくともグルコース−６−リン酸を基質としてグルコノ
−δ−ラクトン−６−リン酸を生成する反応およびその
可逆反応を触媒するグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類および
還元型または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の二種類の補酵素を
含有する試薬を作用させて、サイクリング反応を形成さ
せ、該反応によって変化する補酵素の量を測定すること
を特徴とするグルコースまたはＡＤＰの測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はグルコースおよびＡ
ＤＰのいづれか一成分を含有する被検液に、少なくとも
グルコースおよびＡＤＰのいづれか残りの成分および下
記反応

【０００２】

【化３】

【０００３】を触媒する酵素蛋白を作用させ、次いで反
応によって生成するグルコース−６−リン酸を（１）酸
化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）類〔酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類〕および酸化型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類〔酸化
型ＮＡＤ（Ｐ）類〕を補酵素とし、少なくともグルコー
ス−６−リン酸を基質としてグルコノ−δ−ラクトン−
６−リン酸を生成する反応およびその可逆反応を触媒す
るグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ
Ｈ）、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用
させて、次の反応式

【０００４】

【化４】

【０００５】〔式中、Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類
または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ２はＡ１の還元
型生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を、Ａ１が酸化型ＮＡ
Ｄ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、
Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。〕で表されるサイク
リング反応を形成させ、該反応によって変化するＡ２ま
たはＢ１の量を測定してなるグルコースまたはＡＤＰの
測定法に関し、臨床検査などの分野で用いられ、酵素サ
イクリングを用いた、血清、血漿、尿、髄液などの被検
液中に存在するか形成されるグルコースまたはＡＤＰを
高感度に測定する目的である。

【０００６】

【従来の技術】従来、生体試料中のグルコースを測定す
る方法としてはグルコースにグルコースオキシダーゼを
作用させて、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを
用いてキノン色素として測定する方法や酸化型補酵素の
存在下、ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼを作用させて、生成する還元型補酵素
の増加量を測定する方法が知られている。

【０００７】また、ＡＤＰを測定する方法としては、Ａ
ＤＰにピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを作
用させて還元型補酵素の減少量を測定する方法やピルビ
ン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを作用させて、
生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを用いてキノン
色素として測定する方法が知られている。しかしなが
ら、測定対象となるＡＤＰの濃度が低い場合には正確な
測定ができないもので、例えば、測定対象のＡＤＰが、
ＡＴＰおよびＭｇＣｌ₂の存在下にクレアチニンにクレ
アチニニナーゼおよびクレアチンキナーゼを作用させ
て、生成されるＡＤＰである場合、被検液中のクレアチ
ニン濃度が低いために生成するＡＤＰも濃度が低くな
り、従ってＡＤＰの正確な測定ができず、従ってまたク
レアチニンの測定も正確性を欠く欠点があった。

【０００８】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型補酵素（還元型ＮＡＤ（Ｐ）等）に変換す
ることが行われ、この場合、検出可能な物質の量は化学
量論的に測定対象物と等しくなる。現在、この検出可能
な物質を測定する方法としては、分光分析機器を用いる
方法が最も普及しているが、これも感度上に限界があ
り、測定対象物の含量が少ない場合適さないという欠点
があった。

【０００９】そこで、測定対象物の含量が少ない場合
や、測定対象物を含む被検体が少量の場合等は、分光分
析よりも感度の優れた蛍光分析、発光分析等が行われて
いる。しかしながら、これらの方法も臨床検査等の汎用
検査においては、測定機器の普及という点からあまり適
したものではなかった。また、低濃度ないし微量物質を
測定するその他の方法としては、該物質が等量の補酵素
に変換できる場合、２種類の酵素を用いて補酵素等を増
幅する高感度測定法として、いわゆる酵素サイクリング
法が知られている。例えば、ＮＡＤサイクリング、Ｃｏ
Ａサイクリング、ＡＴＰサイクリング等があるが、これ
らの方法は、臨床検査等のルーチン分析においては、操
作が煩雑なため、ほとんど用いられていないのが現状で
あった。

【００１０】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系におよぼす共存物質の影響を小さくすることができ
る。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を
増やすことも可能である。更に、検体がヒト血液である
場合などは、採血量を減らすことができるため、被採血
者への心理的負担を軽減することもできるし、新生児な
どのようにわずかな量しか採血できない患者の検査も可
能となる。また、廃棄物の減少により環境汚染を軽減す
ることに貢献することにもなる。

【００１１】また、下記反応を触媒する酵素蛋白として
はＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）が超好
熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８（Ｐｙ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３
８）菌株の菌体内に存在することが報告されている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７５３７−１
７５４１（１９９４））が、その理化学的性質の記載は
ほとんどなく、また、該菌株の生育温度が９０〜１０５
℃であるため、その由来する酵素の至適温度が９０℃以
上であり、活性測定に用いるＧ６ＰＤＨは酵母由来でそ
の熱安定性を考慮して、活性測定を５０℃で行っている
もので、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度と異なる温度条件にて
活性測定を行ったものにすぎず、ＡＤＰ−ＨＫの至適温
度に照らして一般の生体成分の臨床診断の温度条件とは
全く異なる温度条件であった。更に、該測定法はなんら
高感度測定法ではなかった。

【００１２】

【化５】

【００１３】また、サイクリング反応を用いたグルコー
ス−６−リン酸の高感度測定法は植田らによって報告さ
れている（特開平４−３３５８９８号報）が、このグル
コース−６−リン酸はグルコースとＡＴＰとから形成さ
れた酵素反応を対象とするものであり、ＡＤＰの高感度
測定法に関してはこれまで全く報告がなされておらず、
またグルコースの高感度測定法に関してＡＤＰを利用し
てなる高感度測定法の報告もなされていないものであっ
た。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとくグルコー
スまたはＡＤＰは酵素を用いた種々の方法にて測定され
ているが、これらはいずれも高感度測定法とは言い難
く、特にグルコースまたはＡＤＰが他の酵素反応によっ
て遊離され、その含量が少ない場合の測定について簡便
で高感度な測定法の開発が望まれている。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、グルコースまたはＡＤＰ
のいづれか一成分を含有する被検液に、少なくともグル
コースまたはＡＤＰのいづれか残りの成分および下記反
応

【００１６】

【化６】

【００１７】を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によ
って生成するグルコース−６−リン酸を、酸化型チオＮ
ＡＤ（Ｐ）類および酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類およびそれら
の補酵素に作用するＧ６ＰＤＨを用いることにより、サ
イクリング反応を形成せしめ、その反応における吸光度
の測定に際し、チオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類の
還元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ
付近と異なっていることを利用し、他物質の吸収波長の
混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、高
感度な測定が可能であることを確認し、本発明を完成す
るに至った。

【００１８】すなわち、Ｇ６ＰＤＨを用いた酵素サイク
リング反応を実施するに当たり、上記二種類の補酵素の
一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類を使用して、どちらか一方の
補酵素の変化量のみを分別定量するもので、その結果、
グルコースまたはＡＤＰのいづれか一成分を含有する被
検液に、少なくともグルコースまたはＡＤＰのいづれか
残りの成分および下記反応

【００１９】

【化７】

【００２０】を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によ
って生成するＤ−グルコース−６−リン酸を高感度に測
定できるものである。本発明は上記知見に基づき完成さ
れたもので、グルコースおよびＡＤＰのいづれか一成分
を含有する被検液に、少なくともグルコースおよびＡＤ
Ｐのいづれか残りの成分および下記反応

【００２１】

【化８】

【００２２】を触媒する酵素蛋白を作用させ、次いで反
応によって生成するグルコース−６−リン酸を、（１）
酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類および酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類
を補酵素とし、少なくともグルコース−６−リン酸を基
質としてグルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸を生成す
る反応およびその可逆反応を触媒するＧ６ＰＤＨ、
（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試薬を作用させ
て、次の反応式

【００２３】

【化９】

【００２４】〔式中、Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類
または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を示し、Ａ２はＡ１の還元
型生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）
類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を、Ａ１が酸化型ＮＡ
Ｄ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）類を示し、
Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。〕で表されるサイク
リング反応を形成させ、該反応によって変化するＡ２ま
たはＢ１の量を測定することにより、グルコースまたは
ＡＤＰを簡便かつ高感度に測定可能であることを確認
し、本発明を完成した。

【００２５】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明における酵素蛋白としては、下記反応

【００２６】

【化１０】

【００２７】を触媒する酵素蛋白であればなんら限定さ
れるものではなく、例えばこの酵素蛋白の生産菌として
は超好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８
菌株がドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオル
ガニスメン・ウント・チェルクツルレン・ＧｍｂＨ（Ｄ
ＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ
（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であ
り、本菌株から得られたＡＤＰ−ＨＫが好ましい。

【００２８】ＡＤＰ−ＨＫ生産菌の培養方法は例えば後
述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範囲で
行えばよく、７０〜１１０℃、好ましくは８５〜１０５
℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最高力価
となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする酵素を
採取すればよい。ＡＤＰ−ＨＫは主としてその菌体内に
含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよ
い。ＡＤＰ−ＨＫの抽出法を例示すれば培養液から菌体
を遠心分離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、
トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチー
ム、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分
離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。このよう
にして得られた粗製のＡＤＰ−ＨＫ含有液を公知の蛋白
質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することによ
り、精製されたＡＤＰ−ＨＫを得ることができる。例え
ばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別
沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交
換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、
アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法など
の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製Ａ
ＤＰ−ＨＫを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ
糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補
酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結保存また
は凍結乾燥させてもよい。

【００２９】また、本発明において用いられる、Ｇ６Ｐ
ＤＨ（ＥＣ１．１．１．４９）は、酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）類と、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素とするもの
なら特に限定されない。Ｇ６ＰＤＨの具体例としては、
動植物に広く分布し、乳腺組織、赤血球、肝、植物微生
物等から生成されている。また、酵母等に見られるよう
に一般に酸化型または還元型ＮＡＤＰに特異的であるが
ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏ
ｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アゾトバク
ター・ヴィネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ・ｖｉ
ｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセン
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ・ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ）等の酵素は、酸化型または還元型ＮＡＤにも作用す
る。（酵素ハンドブック、ｐ２０〜２１，朝倉書店（１
９８３）。また、バチルス・ステアロサーモフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）由来の酵素も同様に酸化型または還元型ＮＡＤ
（Ｐ）に作用する。（生化学、ｖｏｌ．５２、ｐ８１
９、１９８０）。このうち、酵母、ロイコノストック・
メセンテロイデス由来の酵素は例えば、オリエンタル酵
母工業、ベーリンガーマンハイム社、シグマ社等により
市販されており、例えばシグマ社より市販されているパ
ン酵母由来の酵素の補酵素に対する相対活性は４０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）では酸化型ＮＡＤＰ
を用いたときを１００％とすると、酸化型チオＮＡＤＰ
で６７％であった。

【００３０】また、東洋紡より市販されているロイコノ
ストック・メセンテロイデス由来のものについては、同
様に酸化型ＮＡＤＰを用いたときを１００％とすると、
酸化型チオＮＡＤＰで２７％、酸化型ＮＡＤで１７６
％、また酸化型チオＮＡＤでは４９％であった。旭化成
工業より市販されているバチルス・エスピー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ・ｓｐ．）由来の酵素については、４０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）では、酸化型ＮＡＤＰを用
いたときを１００％として、酸化型チオＮＡＤＰが４０
％、酸化型ＮＡＤで７％、酸化型チオＮＡＤでは３４％
であった。他の起源の酵素についても適宜の系に使用可
能であり、使用する酵素の補酵素、酸化型または還元型
ＮＡＤ（Ｐ）類、酸化型または還元型チオＮＡＤ（Ｐ）
類に対する特異性は、基質であるグルコース−６−リン
酸に対して反応性を有するものであればよく、そのよう
な酵素の性質はこれら補酵素と基質を用い確認できるも
のである。

【００３１】また、Ａ１およびＢ２で示される補酵素は
酸化型を示すもので、例えばＡ１は酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）類または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、を示すが、Ｂ２
はＢ１の酸化生成物であって、Ｂ１はＡ１が酸化型チオ
ＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を示すこ
とからＢ２は酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類であり、またはＢ１
はＡ１が酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類のときは還元型チオＮＡ
Ｄ（Ｐ）類を示すことからＢ２は酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）類である。この酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類として
は、例えば酸化型チオＮＡＤや酸化型チオＮＡＤＰの酸
化型チオＮＡＤ（Ｐ）、酸化型チオニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドや酸化型チオニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸の酸化型チオニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（リン酸）等
が挙げられる。

【００３２】また、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類としては、例
えば酸化型ＮＡＤや酸化型ＮＡＤＰの酸化型ＮＡＤ
（Ｐ）、酸化型アセチルピリジンアデニンジヌクレオチ
ドや酸化型アセチルピリジンアデニンジヌクレオチドリ
ン酸の酸化型アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
（リン酸）〔酸化型アセチルＮＡＤ（Ｐ）〕、酸化型ア
セチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドや酸化型
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸
の酸化型アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド（リン酸）、酸化型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドや酸化型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドリン酸の酸化型ニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型デアミノＮＡＤ
（Ｐ）〕等が挙げらる。

【００３３】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１は還元
型ＮＡＤ（Ｐ）類であることが必要であり、Ａ１および
Ｂ１の関係において一つのチオ型補酵素を使用するもの
である。また、定量に用いるＧ６ＰＤＨが（チオ）ＮＡ
Ｄ類（酸化型および還元型を含むことを意味する；以下
同様）のみを補酵素とする場合は上述のチオＮＡＤ類と
ＮＡＤ類より選択でき、また、用いるＧ６ＰＤＨが（チ
オ）ＮＡＤＰ類のみを補酵素とする場合は上述のチオＮ
ＡＤＰ類とＮＡＤＰ類より選択でき、また用いるＧ６Ｐ
ＤＨが（チオ）ＮＡＤ類および（チオ）ＮＡＤＰ類を共
に補酵素にする場合は、上述のチオＮＡＤ類およびチオ
ＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類およびＮＡＤＰ類より適宜
選択して用いればよい。従ってまた、Ａ２は上記補酵素
であるＡ１の還元型生成物であり、Ｂ２は上記補酵素で
あるＢ１の酸化型生成物として特定できる。

【００３４】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されているグルコースまたはＡＤＰを
測定することができるが、また、これらの物質を遊離、
生成する酵素系における基質や、その酵素活性を測定す
ることもできる。さらに、本発明の高感度定量法を用い
れば、上記のようなグルコースまたはＡＤＰを遊離、ま
たは生成する酵素系と連結し得る、単一の、もしくは複
数の行程からなる酵素系における基質や、その酵素活性
をも測定することができる。これらの酵素系は、特に限
定されるものではないが、例えば以下に示す種々の酵素
の反応系が挙げられる。

【００３５】Ａ１およびＢ１の量は被検液中のグルコー
スまたはＡＤＰ量に比較して過剰量であること、かつＧ
６ＰＤＨのＡ１およびＢ１それぞれに対するＫｍ値に比
較して過剰量であることが必要であり、特にグルコース
またはＡＤＰの２０〜１００００倍モルが好ましい。本
発明に使用するＡ１およびＢ１の濃度は０．０２〜１０
０ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｇ６ＰＤ
Ｈの量は１〜１０００Ｕ／ｍｌ、特に２〜４００Ｕ／ｍ
ｌが好ましいが、その量は被検液の種類等により適宜決
定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。

【００３６】上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応に使
用するマグネシウムイオンの代わりにマンガンイオンを
放出し得るイオン放出性塩類を用いてもよく、その塩類
としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩
化マグネシウム、塩化マンガンが挙げられるが、なんら
これらに限定されるものではない。本発明において、Ａ
ＤＰ−ＨＫ、グルコースまたはＡＤＰ、酸化型ＮＡＤ
（Ｐ）類およびマグネシウムイオンまたはマンガンイオ
ンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であれ
ばよく、被検液中グルコースまたはＡＤＰの含量、反応
時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−
ＨＫの濃度は０．１〜５００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは
１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。試薬成分としてのＡＤ
Ｐまたはグルコースの濃度は酵素反応を行うのに十分な
濃度あればよく、ＡＤＰまたはグルコースの濃度は０．
１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ
程度である。マグネシウムイオンまたはマンガンイオン
の濃度としては０．１〜 ５０ｍＭ程度、好ましくは
０．５〜１０ｍＭ程度である。

【００３７】本発明の反応液組成については、使用する
Ｇ６ＰＤＨの各種補酵素間の相対活性等を考慮して２種
の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反応の至適ｐ
Ｈ条件を酵素サイクリング反応が効率よく進行するよう
に設定すればよい。これら使用する酵素は単独でも、あ
るいは適宜２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発
明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩
衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モ
ノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）
を用いて行われる。

【００３８】また測定対象となる被検液としてはグルコ
ースまたはＡＤＰを含有または形成されたＡＤＰを含む
ものであればよく、例えば、血清、血漿、尿、髄液など
が例示される。さらに形成されたＡＤＰの例示として下
記表１〜６

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】

【表４】

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】に表され、これらの反応に関与する基質の
測定または酵素活性の測定の目的に組み込まれるもので
あり、これら以外の反応であってもＡＤＰを形成しうる
反応系であれば何らこれらに限定されるものではない。
このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて
上記反応系によって反応を行うもので、反応温度として
は例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反
応温度条件で行えばよく、また、反応時間は反応が直線
的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計
って測定する。

【００４６】反応後に、反応によって変化するＡ２また
はＢ１の量を測定するもので、Ａ２は、反応によってＡ
１から生成された還元型補酵素であり、Ｂ１は反応によ
ってＢ２を生成した残存する還元型補酵素である。これ
らの還元型補酵素において、チオＮＡＤ（Ｐ）類の場合
は吸収波長４００ｎｍ付近、ＮＡＤ（Ｐ）類の場合は吸
収波長３４０ｎｍ付近にてＡ２またはＢ１の量としてい
ずれか一方または両方を測定すればよく、好適には増加
の量として測定できるＡ２を測定することである。また
Ａ２の測定においても、Ａ１として酸化型チオＮＡＤ
（Ｐ）類を用いた場合にはＡ２は還元型チオＮＡＤ
（Ｐ）類として生成されるもので、吸収波長４００ｎｍ
付近にて吸光度として測定でき、またはＡ１として酸化
型ＮＡＤ（Ｐ）類を用いた場合にはＡ２は還元型ＮＡＤ
（Ｐ）類として生成されるもので、吸収波長３４０ｎｍ
付近にて吸光度として測定できる。

【００４７】

【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。

【００４８】

【参考例１】ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法 測定試薬 ５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２０ｍＭ グルコース ２ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ（ロイコノストック由来、
東洋紡社製） ０．０２５％ ＮＢＴ １ｍＭ ＮＡＤＰ １％ トリトンＸ−１００ ５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ） 測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．
０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応
後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５
分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎ
ｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として
酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操
作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の
吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａ
ｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３
７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる
酵素量とし、計算式は下記の通りである。 酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×
酵素の希釈倍率 ＡＤＰ−ＨＫの取得 Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６
３８の培養 培地組成 ０．１％ 酵母エキス ０．５％ トリプトン ０．７２％ マルトース ２．３９％ ＮａＣｌ ０．４％ Ｎａ₂ ＳＯ₄ ０．０７％ ＫＣｌ ０．０２％ ＮａＨＣＯ₃ ０．０１％ ＫＢｒ ０．０３％ Ｈ₃ ＢＯ₄ １．０８％ ＭｇＣｌ₂ ０．１５％ ＣａＣｌ₂ ０．００２５％ ＳｒＣｌ₂ ０．０２５％ ＮＨ₄ Ｃｌ ０．０１４％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．１％ ＣＨ₃ ＣＯＯＮａ ０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）₃ ０．０００５％ ＭｎＳＯ₄ ０．００１４％ ＦｅＳＯ₄ ０．０００２％ ＮｉＣｌ₂ ０．０００１％ ＣｏＳＯ₄ ０．０００１％ ＺｎＳＯ₄ ０．００００１％ ＣｕＳＯ₄ ０．０００００１％ Ｎａ₂ Ｗｏ₄ ０．０００００１％ Ｎａ₂ Ｍｏ₄ ０．１％ システイン塩酸塩 上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５
００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２
０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１
０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培
養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２
００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植
し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ
／ｍｌの培養液２００ｌを得た。

【００４９】ＡＤＰ−ＨＫの精製 得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体
を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍ
Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌ
に調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴ
ＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理し
て、菌体破砕液を得た。

【００５０】この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠
心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得
た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透
析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ
（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）
のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジ
エントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モ
ルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出され
た。

【００５１】この得られた活性画分に４Ｍとなるように
ＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈ
ｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社
製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、
４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を
行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣ
ｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。

【００５２】この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した
後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝
化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１０
０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．
５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエン
トにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３
Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出さ
れた。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇの酵素粉末（１
７０Ｕ／ｍｇ）を得た。

【００５３】ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通り
であった。 ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質 （１）酵素作用 基質としてＡＤＰ−ＨＫを用いた酵素作用を以下に示
す。

【００５４】

【化１１】

【００５５】（２）基質特異性 基質特異性を表７に示す。

【００５６】

【表７】

【００５７】（３）分子量 トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ_XL（０．７５×３
０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−Ｈ
Ｋの分子量は１０００００±５０００であった。 （４）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）
であった。

【００５８】（５）至適温度は８０〜１００℃であるこ
とから高度好熱性酵素と認められた。

【００５９】

【実施例１】 ＜グルコースの測定＞ 反応液組成 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５） ５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ ２ｍＭ ＡＤＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ １０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ 上記反応液１ｍｌをキュベットにとり、０、５、１０、
１５、２０μＭのグルコース溶液をそれぞれ０．０５ｍ
ｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２
分目と３分目の４００ｎｍにおける吸光度を読みとり、
その差を求めた。その結果、グルコース量に対する吸光
度変化量は良好な直線性を示した（図１）。

【００６０】

【実施例２】 ＜ＡＤＰの測定＞ 反応液組成 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５） ５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ ２０ｍＭ グルコース ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ １０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ 上記反応液１ｍｌをキュベットにとり、０、１０、２
０、３０、４０、５０μＭのＡＤＰ溶液をそれぞれ０．
０５ｍｌ添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開
始後２分目と３分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み
とり、その差を求めた。その結果、ＡＤＰ量に対する吸
光度変化量は良好な直線性を示した（図２）。

【００６１】

【実施例３】 ＜クレアチニンの測定＞ 反応液組成 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５） ２ｍＭ ＡＴＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ３００Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ ５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ ２０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ １ｍＭ 酸化型チオＮＡＤ ２０ｍＭ グルコース ６００Ｕ／ｍｌ クレアチニナーゼ ０．２ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ 上記反応液１．０ｍｌをキュベットにとり、０、２、
４、６、８、１０ｍｇ／ｄｌのクレアチニン溶液をそれ
ぞれ０．０５ｍｌ添加し、３７℃にて反応を開始させ
た。反応開始後、２分目と３分目の４００ｎｍにおける
吸光度を読みとり、その差を求めた。その結果、クレア
チニンに対する吸光度変化量は良好な直線性を示した
（図３）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、グルコースの定量曲線を示す。

【図２】図２は、ＡＤＰの定量曲線を示す。

【図３】図３は、クレアチニンの定量曲線を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコースおよびＡＤＰのいづれか一成
   分を含有する被検液に、少なくともグルコースおよびＡ
   ＤＰのいづれか残りの成分および下記反応 【化１】 を触媒する酵素蛋白を作用させ、次いで反応によって生
   成するグルコース−６−リン酸を（１）酸化型チオニコ
   チンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類および
   酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
   酸）類を補酵素とし、少なくともグルコース−６−リン
   酸を基質としてグルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸を
   生成する反応およびその可逆反応を触媒するグルコース
   −６−リン酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ
   １、を含有する試薬を作用させて、次の反応式 【化２】 〔式中、Ａ１は酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌ
   クレオチド（リン酸）類または酸化型ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチド（リン酸）類を示し、Ａ２はＡ１
   の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類のときは
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
   酸）類を、Ａ１が酸化型ニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド（リン酸）類のときは還元型チオニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類を示し、Ｂ２は
   Ｂ１の酸化型生成物を示す。〕で表されるサイクリング
   反応を形成させ、該反応によって変化するＡ２またはＢ
   １の量を測定することを特徴とするグルコースまたはＡ
   ＤＰの測定法。
2. 【請求項２】 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオ
   チド（リン酸）類がチオニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド（リン酸）またはチオニコチンアミドヒポキサ
   ンチンジヌクレオチドリン酸である請求項１記載の測定
   法。
3. 【請求項３】 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   （リン酸）類がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   （リン酸）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
   （リン酸）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレ
   オチド（リン酸）およびニコチンアミドヒポキサンチン
   ジヌクレオチド（リン酸）からなる群より選ばれた補酵
   素である請求項１記載の測定法。
4. 【請求項４】 ＡＤＰが、存在または形成されるＡＤＰ
   である請求項１記載の測定する方法。