JP3885977B2 - 生体試料を測定する方法 - Google Patents
生体試料を測定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3885977B2 JP3885977B2 JP32162396A JP32162396A JP3885977B2 JP 3885977 B2 JP3885977 B2 JP 3885977B2 JP 32162396 A JP32162396 A JP 32162396A JP 32162396 A JP32162396 A JP 32162396A JP 3885977 B2 JP3885977 B2 JP 3885977B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adp
- reaction
- glucose
- enzyme
- ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを測定する方法において、被検液を少なくともグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）〔酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）およびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類の生成量に基づいて測定する方法および生体試料中のＡＤＰを測定する測定用組成物に関し、臨床検査などの分野で用いられ、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中のＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成、増加量として簡便かつ正確に測定する目的である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生体試料中のＡＤＰを測定する方法としては液体クロマトグラフィーを用いる方法が知られているが液体クロマトグラフィー法は操作性が煩雑であるという欠点を有している。
また、操作性に優れるＡＤＰ測定の酵素法としては、ピルビン酸キナーゼ〔ＰＫ（ＥＣ ２．７．１．４０）〕と乳酸脱水素酵素〔ＬＤＨ（ＥＣ １．２．３．３）〕を用いた還元型ＮＡＤの減少法（反応式１）、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いたオキシダーゼ法（反応式２）やピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法（反応式３）が知られている（特開平７−８２９７号公報）。
これらの反応式を以下に示す。下記式中のＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、Ｐｉはリン酸、ＰＤＣはピルビン酸デカルボキシラーゼ、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を示す。
【０００３】
【化１】
【０００４】
【化２】
【０００５】
【化３】
【０００６】
しかしながら、反応式１に示す還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ) の減少法においては、前もって所定量の還元型ＮＡＤを反応液内に存在させ、反応の終了後、反応液内に残存する還元型ＮＡＤの量を測定する減少法であるために、
（１）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。
（３）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（４）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
等の問題点がある。
【０００７】
また、反応式２に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素の発色指示薬系を用いて測定するピルビン酸の定量法が広く利用されているが、（５）この方法は生体試料中の干渉物質（還元物質）（尿酸、アスコルビン酸等）や着色物質（ビリルビン、ヘモグロビン等）の影響を受けるので測定値の正確さにおいて必ずしも十分満足できる方法とはいえない。
【０００８】
また、反応式３に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法は、ピルビン酸キナーゼの逆反応を利用するもので、（６）この逆反応における至適ｐＨがｐＨ７．５であり、またピルビン酸脱炭酸酵素の至適ｐＨがｐＨ６．０〜６．４であり、さらにアルデヒド脱水素酵素の至適ｐＨがｐＨ９．０であり、使用する三種類の酵素の至適ｐＨが異なるために反応式３における反応の至適ｐＨを決定することが困難であり、（７）またピルビン酸脱炭酸酵素のピルビン酸に対するＫｍ値が３．６〜３０ｍＭとかなり大きな値であることから、基質である高価なホスホエノールピルビン酸を多く使用してピルビン酸を多く生成せしめる必要性があるとともに、（８）反応全体を短時間に終了させるためには非常に多くの酵素量を必要とする繁雑な手法にすぎなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
また、ＡＤＰ−ＨＫとしては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８）菌株の菌体内に存在することが報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７５３７−１７５４１（１９９４）〕が、その理化学的性質の記載はほとんどなく、酵素も精製、単離されたものではなく、また該菌株の生育温度が９０℃〜１０５℃であるため、その由来する酵素の至適温度が９０℃以上であり、活性測定に用いているＧ６ＰＤＨは酵母由来でその熱安定性を考慮して、活性測定を５０℃で行っているもので、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度と異なる温度条件にて活性測定を行ったものにすぎず、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度に照らして一般の生体成分の臨床診断の温度条件とは全く異なる測定条件であった。
【００１０】
かつまた、５０℃の反応温度で行うことに関して、臨床診断の分野では反応温度として５０℃で行うと（１）組み合わせの酵素の失活によって正確に測定できず、（２）検体となる生体成分の熱変性がおこり、にごりが生じる等の欠点があった。
【００１１】
まず、本発明者らはピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株を培養し、ＡＤＰ−ＨＫを精製し、該酵素の反応の至適温度を調べた結果、至適温度は８０〜１００℃であった。さらに、３７℃における相対活性は１００℃の１０％程度であり、一般的にこのような性質の酵素を用いて３７℃で酵素反応を行わせると正確な定量反応を行うことは不可能であると思われた。しかしながら、全く意外にも本発明者らは３７℃で該酵素反応を用いた定量実験を実施して、該酵素反応３７℃を含む生体成分の一般的定量における通常の反応温度条件である１５〜４５℃の温度条件にて生体成分などの被検液中のＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成・増加量として簡便かつ高精度に測定することが可能であることを発見した。
【００１２】
さらに、本発明者らは、下記酵素反応（反応式４、５）を用いて生体試料中のＡＤＰを測定する方法において、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下、ＡＤＰの量にも基づく酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に還元する反応を行い、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいた生体中のＡＤＰの定量方法が極めて有用であり、かかる反応が生体試料中のＡＤＰに普遍的に利用できる酵素反応であることを見い出して、本発明を完成した。即ち、本発明は生体試料中のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンを用いてＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成・増加量として測定できる方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを測定する方法において、被検液を少なくともグルコース、ＡＤＰ−ＨＫ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法に関する。
【００１４】
本発明で用いられる、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を生成する酵素反応は下記反応式４及び５で示される。
【００１５】
【化４】
【００１６】
【化５】
【００１７】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明におけるＡＤＰ−ＨＫとしては、上記反応式４で示される少なくともグルコースを基質とし、ＡＤＰを消費してグルコース−６−リン酸およびＡＭＰを生成するＡＤＰ−ＨＫであれば何ら限定されるものではなく、例えばＡＤＰ−ＨＫの生産菌としては超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株がドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレン・ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であり、本菌株から得られた高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫが好ましい。
【００１８】
また、上記反応式５で示される酵素反応に用いられるＧ６ＰＤＨは市販されており（ベーリンガーマンハイム社：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来、シグマ社：パン酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来）、容易に入手可能である。
【００１９】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応（反応式４）に使用するイオン放出性塩類であるマグネシウムイオンの代わりにコバルトイオンまたはマンガンイオンを放出し得るいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化コバルト、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２０】
酵素反応式５に示されるように、上記のＧ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類にはこの他に酸化型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）、酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において、酵素反応４および５で示される酵素反応のＡＤＰ−ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測定対象となる被検液中の物質の種類、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよびＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ程度である。グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度であればよく、グルコースは例えば０．５〜１００ｍＭ程度、好ましくは１〜５０ｍＭ程度、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２２】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。測定対象となる被検液としてはＡＤＰが存在または形成されたＡＤＰを含有する生体試料が挙げられ、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２３】
被検液中のＡＤＰ量に相当する本発明の反応は、生成されるＡＭＰとともに還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成を伴い、この還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。
【００２４】
また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光を測定してもよい。
【００２５】
本発明における被検液中のＡＤＰの測定において、形成されたＡＤＰを被検液とする場合、各種生体試料中の酵素およびその基質による反応においてＡＤＰを形成する反応系であればなんら限定されるものではなく、例えばキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼとその基質となる物質が当該キナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼおよびカルボキシラーゼの作用によってＡＤＰに導くものであればよい。
【００２６】
また、これらの反応において、基質を定量する場合に、添加する酵素量は１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。また、酵素活性を測定する場合の添加する基質は１〜１００ｍＭ程度であるが、特に反応において阻害を受けない限りこれらより過剰量を使用することを除外するものではない。
またこれらの反応は、前記反応式４および５とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよいが好ましくは同一反応系となすことである。
以下、本発明の生体試料中のＡＤＰの測定方法を例をもって具体的に説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものでない。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
参考例１
＜ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
０．０２５％ ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）
１ｍＭ ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
【００２９】
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
【００３０】
＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞
ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4
０．１％ システイン塩酸塩
【００３１】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）５００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌ容タンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。
【００３２】
＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ、２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００３３】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。
【００３４】
この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。
【００３５】
この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇのＡＤＰ−ＨＫ酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３６】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【００３７】
【化６】
【００３８】
（２）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１００，０００±５，０００であった。
（３）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
（４）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性酵素と認められた。
【００３９】
実施例１
＜３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４０】
測定方法
ＡＤＰを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ、１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図１（横軸：最終濃度として表示）に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４１】
実施例２
＜３７℃でコバルトイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＣｏＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４２】
測定方法
ＡＤＰを２．３ｍＭ、４．６ｍＭ、６．９ｍＭ、９．２ｍＭ、１１．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図２に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４３】
実施例３
＜３７℃でマンガンイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４４】
測定方法
ＡＤＰを２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１２．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図３に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４５】
実施例４
＜２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４６】
測定方法
ＡＤＰを２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、８．４ｍＭ、１１．２ｍＭ、１４ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、２０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図４に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４７】
実施例５
＜４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４８】
測定方法
ＡＤＰを２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．１ｍＭ、１０．８ｍＭ、１３．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、４０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図５に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４９】
参考例２
＜５０℃のときのＡＤＰの定量性＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
０．５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００５０】
測定方法
ＡＤＰを０、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌを５０℃で５分間予備加温した後、ＡＤＰサンプル２０μｌ加え、５０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図６に示すように５０℃では定量的な測定はできなかった。
【００５１】
【発明の効果】
以上のように本発明の測定方法は、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっている還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を測定することから測定値の信頼性が高い。更に、本発明の測定方法は、被検液中の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。従って、本発明によれば、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によって３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図２】本発明によって３７℃でコバルトイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図３】本発明によって３７℃でマンガンイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図４】本発明によって２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図５】本発明によって４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図６】本発明の代わりに５０℃にて反応したときのＡＤＰ測定の定量曲線を示すものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを測定する方法において、被検液を少なくともグルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）〔酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）およびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類の生成量に基づいて測定する方法および生体試料中のＡＤＰを測定する測定用組成物に関し、臨床検査などの分野で用いられ、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中のＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成、増加量として簡便かつ正確に測定する目的である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生体試料中のＡＤＰを測定する方法としては液体クロマトグラフィーを用いる方法が知られているが液体クロマトグラフィー法は操作性が煩雑であるという欠点を有している。
また、操作性に優れるＡＤＰ測定の酵素法としては、ピルビン酸キナーゼ〔ＰＫ（ＥＣ ２．７．１．４０）〕と乳酸脱水素酵素〔ＬＤＨ（ＥＣ １．２．３．３）〕を用いた還元型ＮＡＤの減少法（反応式１）、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いたオキシダーゼ法（反応式２）やピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法（反応式３）が知られている（特開平７−８２９７号公報）。
これらの反応式を以下に示す。下記式中のＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、Ｐｉはリン酸、ＰＤＣはピルビン酸デカルボキシラーゼ、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を示す。
【０００３】
【化１】
【化２】
【化３】
しかしながら、反応式１に示す還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ) の減少法においては、前もって所定量の還元型ＮＡＤを反応液内に存在させ、反応の終了後、反応液内に残存する還元型ＮＡＤの量を測定する減少法であるために、
（１）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。
（３）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（４）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
等の問題点がある。
【０００７】
また、反応式２に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素の発色指示薬系を用いて測定するピルビン酸の定量法が広く利用されているが、（５）この方法は生体試料中の干渉物質（還元物質）（尿酸、アスコルビン酸等）や着色物質（ビリルビン、ヘモグロビン等）の影響を受けるので測定値の正確さにおいて必ずしも十分満足できる方法とはいえない。
【０００８】
また、反応式３に示すピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法は、ピルビン酸キナーゼの逆反応を利用するもので、（６）この逆反応における至適ｐＨがｐＨ７．５であり、またピルビン酸脱炭酸酵素の至適ｐＨがｐＨ６．０〜６．４であり、さらにアルデヒド脱水素酵素の至適ｐＨがｐＨ９．０であり、使用する三種類の酵素の至適ｐＨが異なるために反応式３における反応の至適ｐＨを決定することが困難であり、（７）またピルビン酸脱炭酸酵素のピルビン酸に対するＫｍ値が３．６〜３０ｍＭとかなり大きな値であることから、基質である高価なホスホエノールピルビン酸を多く使用してピルビン酸を多く生成せしめる必要性があるとともに、（８）反応全体を短時間に終了させるためには非常に多くの酵素量を必要とする繁雑な手法にすぎなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
また、ＡＤＰ−ＨＫとしては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８）菌株の菌体内に存在することが報告されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７５３７−１７５４１（１９９４）〕が、その理化学的性質の記載はほとんどなく、酵素も精製、単離されたものではなく、また該菌株の生育温度が９０℃〜１０５℃であるため、その由来する酵素の至適温度が９０℃以上であり、活性測定に用いているＧ６ＰＤＨは酵母由来でその熱安定性を考慮して、活性測定を５０℃で行っているもので、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度と異なる温度条件にて活性測定を行ったものにすぎず、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度に照らして一般の生体成分の臨床診断の温度条件とは全く異なる測定条件であった。
【００１０】
かつまた、５０℃の反応温度で行うことに関して、臨床診断の分野では反応温度として５０℃で行うと（１）組み合わせの酵素の失活によって正確に測定できず、（２）検体となる生体成分の熱変性がおこり、にごりが生じる等の欠点があった。
【００１１】
まず、本発明者らはピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株を培養し、ＡＤＰ−ＨＫを精製し、該酵素の反応の至適温度を調べた結果、至適温度は８０〜１００℃であった。さらに、３７℃における相対活性は１００℃の１０％程度であり、一般的にこのような性質の酵素を用いて３７℃で酵素反応を行わせると正確な定量反応を行うことは不可能であると思われた。しかしながら、全く意外にも本発明者らは３７℃で該酵素反応を用いた定量実験を実施して、該酵素反応３７℃を含む生体成分の一般的定量における通常の反応温度条件である１５〜４５℃の温度条件にて生体成分などの被検液中のＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成・増加量として簡便かつ高精度に測定することが可能であることを発見した。
【００１２】
さらに、本発明者らは、下記酵素反応（反応式４、５）を用いて生体試料中のＡＤＰを測定する方法において、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下、ＡＤＰの量にも基づく酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に還元する反応を行い、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいた生体中のＡＤＰの定量方法が極めて有用であり、かかる反応が生体試料中のＡＤＰに普遍的に利用できる酵素反応であることを見い出して、本発明を完成した。即ち、本発明は生体試料中のＡＤＰをグルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンを用いてＡＤＰを還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成・増加量として測定できる方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを測定する方法において、被検液を少なくともグルコース、ＡＤＰ−ＨＫ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法に関する。
【００１４】
本発明で用いられる、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を生成する酵素反応は下記反応式４及び５で示される。
【００１５】
【化４】
【化５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明におけるＡＤＰ−ＨＫとしては、上記反応式４で示される少なくともグルコースを基質とし、ＡＤＰを消費してグルコース−６−リン酸およびＡＭＰを生成するＡＤＰ−ＨＫであれば何ら限定されるものではなく、例えばＡＤＰ−ＨＫの生産菌としては超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株がドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレン・ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であり、本菌株から得られた高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫが好ましい。
【００１８】
また、上記反応式５で示される酵素反応に用いられるＧ６ＰＤＨは市販されており（ベーリンガーマンハイム社：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来、シグマ社：パン酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来）、容易に入手可能である。
【００１９】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応（反応式４）に使用するイオン放出性塩類であるマグネシウムイオンの代わりにコバルトイオンまたはマンガンイオンを放出し得るいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化コバルト、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２０】
酵素反応式５に示されるように、上記のＧ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類にはこの他に酸化型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）、酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明において、酵素反応４および５で示される酵素反応のＡＤＰ−ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測定対象となる被検液中の物質の種類、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよびＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ程度である。グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度であればよく、グルコースは例えば０．５〜１００ｍＭ程度、好ましくは１〜５０ｍＭ程度、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２２】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。測定対象となる被検液としてはＡＤＰが存在または形成されたＡＤＰを含有する生体試料が挙げられ、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２３】
被検液中のＡＤＰ量に相当する本発明の反応は、生成されるＡＭＰとともに還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成を伴い、この還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。
【００２４】
また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光を測定してもよい。
【００２５】
本発明における被検液中のＡＤＰの測定において、形成されたＡＤＰを被検液とする場合、各種生体試料中の酵素およびその基質による反応においてＡＤＰを形成する反応系であればなんら限定されるものではなく、例えばキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼとその基質となる物質が当該キナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼおよびカルボキシラーゼの作用によってＡＤＰに導くものであればよい。
【００２６】
また、これらの反応において、基質を定量する場合に、添加する酵素量は１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。また、酵素活性を測定する場合の添加する基質は１〜１００ｍＭ程度であるが、特に反応において阻害を受けない限りこれらより過剰量を使用することを除外するものではない。
またこれらの反応は、前記反応式４および５とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよいが好ましくは同一反応系となすことである。
以下、本発明の生体試料中のＡＤＰの測定方法を例をもって具体的に説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものでない。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
参考例１
＜ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
０．０２５％ ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）
１ｍＭ ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
【００２９】
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）。この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
【００３０】
＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞
ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4
０．１％ システイン塩酸塩
【００３１】
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．０）５００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌ容タンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。
【００３２】
＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ、２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００３３】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。
【００３４】
この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。
【００３５】
この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇのＡＤＰ−ＨＫ酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３６】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【００３７】
【化６】
（２）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１００，０００±５，０００であった。
（３）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
（４）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性酵素と認められた。
【００３９】
実施例１
＜３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４０】
測定方法
ＡＤＰを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ、１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図１（横軸：最終濃度として表示）に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４１】
実施例２
＜３７℃でコバルトイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＣｏＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４２】
測定方法
ＡＤＰを２．３ｍＭ、４．６ｍＭ、６．９ｍＭ、９．２ｍＭ、１１．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図２に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４３】
実施例３
＜３７℃でマンガンイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４４】
測定方法
ＡＤＰを２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ、１０．０ｍＭ、１２．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図３に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４５】
実施例４
＜２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４６】
測定方法
ＡＤＰを２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、８．４ｍＭ、１１．２ｍＭ、１４ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、２０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図４に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４７】
実施例５
＜４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００４８】
測定方法
ＡＤＰを２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．１ｍＭ、１０．８ｍＭ、１３．５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌ加え、４０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図５に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４９】
参考例２
＜５０℃のときのＡＤＰの定量性＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
０．５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
【００５０】
測定方法
ＡＤＰを０、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭの水溶液に調整し、ＡＤＰサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌを５０℃で５分間予備加温した後、ＡＤＰサンプル２０μｌ加え、５０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。測定結果は図６に示すように５０℃では定量的な測定はできなかった。
【００５１】
【発明の効果】
以上のように本発明の測定方法は、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっている還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を測定することから測定値の信頼性が高い。更に、本発明の測定方法は、被検液中の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。従って、本発明によれば、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によって３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図２】本発明によって３７℃でコバルトイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図３】本発明によって３７℃でマンガンイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図４】本発明によって２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図５】本発明によって４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示すものである。
【図６】本発明の代わりに５０℃にて反応したときのＡＤＰ測定の定量曲線を示すものである。
Claims (4)
- 酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを測定する方法において、被検液を少なくともグルコース、ピロコッカス・フリオサス由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびマグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、２０〜４０℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法。但し、ピロコッカス・フリオサス由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼは以下の理化学的性質を有する。
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用が以下の反応式のとおりである。
１００，０００±５，０００（ゲル濾過法により測定）
（３）至適ｐＨ
ｐＨ６．０〜７．０
（４）至適温度
８０〜１００℃ - ＡＤＰが、存在または形成されたＡＤＰである請求項１に記載の測定する方法。
- ピロコッカス・フリオサス由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素が０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、グルコースが０．５〜１００ｍＭ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）が０．５〜５０ｍＭ、イオン放出性塩類が０．１〜５０ｍＭの濃度である請求項１に記載の測定する方法。
- ピロコッカス・フリオサス由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素が０．１〜１００Ｕ／ｍｌ、グルコースが０．５〜１００ｍＭ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）が０．５〜５０ｍＭ、マグネシウムイオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれた１種または２種以上のイオン放出性塩類が０．１〜５０ｍＭの濃度である生体試料中のＡＤＰ測定用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32162396A JP3885977B2 (ja) | 1995-12-27 | 1996-12-02 | 生体試料を測定する方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34048295 | 1995-12-27 | ||
| JP7-340482 | 1995-12-27 | ||
| JP32162396A JP3885977B2 (ja) | 1995-12-27 | 1996-12-02 | 生体試料を測定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09234098A JPH09234098A (ja) | 1997-09-09 |
| JP3885977B2 true JP3885977B2 (ja) | 2007-02-28 |
Family
ID=26570539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32162396A Expired - Fee Related JP3885977B2 (ja) | 1995-12-27 | 1996-12-02 | 生体試料を測定する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3885977B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2291912A1 (en) | 1998-12-11 | 2000-06-11 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol |
| JP5633669B2 (ja) * | 2009-11-19 | 2014-12-03 | 日東紡績株式会社 | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット |
| WO2011136063A1 (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | 日東紡績株式会社 | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット |
| EP3072975A4 (en) | 2013-11-21 | 2017-05-03 | The University of Tokyo | Method for detecting fluorescence or absorbance, method for suppressing background, method for measuring adp, method for measuring activity of adp-synthesizing enzyme, and method for measuring activity of glucosyltransferase |
-
1996
- 1996-12-02 JP JP32162396A patent/JP3885977B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09234098A (ja) | 1997-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7476525B2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability | |
| US5871949A (en) | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay | |
| EP0881301B1 (en) | Method for assaying vital sample | |
| JP3885977B2 (ja) | 生体試料を測定する方法 | |
| JP4155415B2 (ja) | 生体試料の測定法 | |
| EP0178113B1 (en) | Reagent for assaying creatine kinase | |
| JP3049217B2 (ja) | Ａｄｐの測定法 | |
| JP4140929B2 (ja) | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 | |
| JPH0373276B2 (ja) | ||
| JPH10225300A (ja) | グルコースまたはａｄｐの高感度測定法 | |
| JP2872983B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法及び定量用試薬 | |
| JP3852991B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法および用途 | |
| EP0469154B1 (en) | Method of determining glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| JP3586485B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬 | |
| US5492815A (en) | Method of determining glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| JP2886846B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 | |
| JP4001658B2 (ja) | キナーゼ | |
| JPH10155479A (ja) | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPS6342519B2 (ja) | ||
| JP3929576B2 (ja) | リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 | |
| JP5697324B2 (ja) | 重炭酸イオン濃度測定方法及び該方法に用いる溶液 | |
| JPH04126099A (ja) | ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JPH10108692A (ja) | Ｄ−ソルビトール、ガラクチトールの高感度定量法 | |
| JP2753597B2 (ja) | グルコース―６―リン酸の測定方法および測定用組成物 | |
| JPS6140400B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060530 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060619 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060711 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060619 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060823 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060913 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20061017 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061115 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061116 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091201 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101201 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101201 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111201 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111201 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121201 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121201 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131201 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |