JP4155415B2 - 生体試料の測定法 - Google Patents
生体試料の測定法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4155415B2 JP4155415B2 JP01614497A JP1614497A JP4155415B2 JP 4155415 B2 JP4155415 B2 JP 4155415B2 JP 01614497 A JP01614497 A JP 01614497A JP 1614497 A JP1614497 A JP 1614497A JP 4155415 B2 JP4155415 B2 JP 4155415B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- adp
- reaction
- substrate
- creatine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を含有する被検液を少なくともＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）〔酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類の生成量に基づいて測定する方法に関し、臨床検査などの分野で用いられ、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中のＡＤＰ生成する酵素またはその基質を測定する目的である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を測定する方法としては酵素反応による基質の反応生成物に作用する他の脱水素酵素または酸化酵素と組み合わせて測定する方法（例えば、グリセロールとグリセロールキナーゼの場合、グリセロールにＡＴＰの存在下、グリセロールキナーゼを作用させてＡＤＰおよびグリセロールリン酸を生成せしめ、このグリセロールリン酸をグリセロールリン酸脱水素酵素またはグリセロールリン酸オキシダーゼを用いて測定する方法）や酵素反応によって生成するＡＤＰを種々の方法で測定する方法が知られている。
【０００３】
しかし、他の脱水素酵素や酸化酵素と組み合わせて、測定する方法はＡＤＰを生成する酵素によって、それぞれ、組み合わせの酵素を変えなければならず、汎用性に欠け、また、測定しようとする基質や酵素によっては組み合わせの酵素が存在しない場合もある。
また、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定する方法としては液体クロマトグラフィーを用いて測定する方法が知られているが液体クロマトグラフィー法は操作性が煩雑であるという欠点を有している。
【０００４】
さらに、操作性に優れるＡＤＰ測定酵素法としてピルビン酸キナーゼ〔ＰＫ（ＥＣ ２．７．１．４０）〕と乳酸脱水素酵素〔ＬＤＨ（ＥＣ １．２．３．３）〕を用いた還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ）の減少法（反応式１）、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いたオキシダーゼ法（反応式２）やピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+ 〕の増加法（反応式３）が知られている（特開平７−８２９７号公報）。
【０００５】
これらの反応式を以下に示す。下記式中のＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、Ｐｉはリン酸、ＰＤＣはピルビン酸脱炭酸酵素、ＡｌＤＨはアルデヒド脱水素酵素、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を意味する。
【０００６】
【化１】
【０００７】
【化２】
【０００８】
【化３】
【０００９】
しかしながら、還元型ＮＡＤの減少法においては、前もって所定量の還元型ＮＡＤを反応液内に存在させ、反応の終了後、反応液内に残存する還元型ＮＡＤの量を測定する減少法であるために、
（１）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。
【００１０】
（３）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（４）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
等の問題点がある。
また、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素の発色指示薬系を用いて測定するピルビン酸の定量法が広く利用されているが、（５）この方法は生体試料中の干渉物質（還元物質）（尿酸、アスコルビン酸等）や着色物質（ビリルビン、ヘモグロビン等）の影響を受けるので測定値の正確さにおいて必ずしも十分満足できる方法とはいえない。
【００１１】
また、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法は用いる酵素の反応の数が多く、繁雑な手法にすぎなっかた。
また、本発明に使用されるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとしては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８）菌株の菌体内に存在することが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７５３７−１７５４１）が、該菌株の生育温度が９０℃〜１０５℃であるため、その由来する酵素の至適温度が９０℃以上であり、活性測定に用いているＧ６ＰＤＨは酵母由来でその熱安定性を考慮して、活性測定を５０℃で行っているもので、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度と異なる温度条件にて活性測定を行ったものにすぎず、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度に照らして一般の臨床診断の温度条件とは全く異なる測定条件であった。かつ、５０℃の反応温度で測定を行うことに関して、臨床診断の分野では反応温度として５０℃で行うと（６）組み合わせの酵素の失活によって正確に測定できない。（７）検体となる生体成分の熱変性がおこり、にごりが生じる。などの問題点があり正確な測定が不可能であった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
まず、本発明者らはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株を培養し、ＡＤＰ−ＨＫを精製し、該酵素の反応の至適温度を調べた結果、至適温度は８０〜１００℃であった。さらに３７℃における相対活性は１００℃の場合の１０％程度であり、一般的にこのような性質の酵素を用いて３７℃で反応を行わせると正確な定量反応を行わせることは不可能であると思われた。しかし、意外にも本発明者らは３７℃で該酵素反応を用いた定量実験を実施して、該酵素反応３７℃を含む生体成分の一般的定量における通常の反応温度条件である１５〜４５℃の温度条件でも生体成分としての基質または酵素活性の測定が可能であることを見いだした。
【００１３】
さらに、本発明者らは、下記酵素反応（反応式４、５）を用いて生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を測定する方法において、生体試料がＡＤＰを生成する酵素の活性測定を目的とする被検液の場合にはその酵素の基質とＡＴＰの存在下にＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬を用いて、または生体試料が基質の量の測定を目的とする被検液の場合にはその基質に作用してＡＤＰを生成する酵素とＡＴＰの存在下にＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬を用いて、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンに基づく反応により、ＡＤＰをＡＭＰを生成せしめるとともに酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に還元する反応を行い、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいた生体中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の定量方法が極めて有用であり、かかる反応が生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質に普遍的に利用できる酵素反応であることを見い出して、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明は被検液としての生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を、ＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する反応試薬を用いるとともに、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下に反応せしめて簡便かつ高精度に測定することのできる方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を含有する被検液を少なくともＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法である。
【００１６】
本発明で用いられる、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を生成する酵素反応は下記反応式４及び５で示される。
【００１７】
【化４】
【００１８】
【化５】
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
上記反応式４で示されるＡＤＰ−ＨＫとしては、グルコースを基質とし、ＡＤＰを消費してグルコース−６−リン酸およびＡＭＰを生成するＡＤＰ−ＨＫであればなんら限定されるものではなく、例えばこのＡＤＰ−ＨＫ生産菌としては超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレン・ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られた高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫが好ましい。
【００２０】
また、上記反応式５で示される酵素反応に用いられるＧ６ＰＤＨは市販されており（ベーリンガーマンハイム社：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来、シグマ社：パン酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来）、容易に入手可能である。
【００２１】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応（反応式４）に使用するマグネシウムイオンの代わりにコバルトイオンまたはマンガンイオンを放出しうるいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化コバルト、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２２】
酵素反応式５に示されるように、上記Ｇ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ＮＡＤ、酸化型ＮＡＤＰを含む酸化型ＮＡＤ（Ｐ）の他に酸化型チオ−ＮＡＤ、酸化型チオ−ＮＡＤＰを含む酸化型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）、酸化型３−アセチルＮＡＤ、酸化型３−アセチルＮＡＤＰを含む酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノＮＡＤ、酸化型デアミノＮＡＤＰを含む酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明において、酵素反応４および５で示される酵素反応のＡＤＰ−ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測定対象となる被検液中の物質の種類、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよびＧ６ＰＤＨの濃度は０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ程度である。グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、グルコースは０．５〜１００ｍＭ程度、好ましくは１〜５０ｍＭ程度、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類は０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの濃度としては０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２４】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）（例えばｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６．５〜８）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。
【００２５】
測定対象となる被検液としてはＡＤＰを生成するかまたは形成されたＡＤＰを含有する生体試料が挙げられ、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２６】
用いた酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から形成される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよく、例えば還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。また還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００２７】
本発明における生体試料である被検液中のＡＤＰを生成する酵素の基質またはその酵素活性の一方の測定において、ＡＴＰの存在下に、ＡＤＰを生成する酵素またはの基質を被検液とする場合、各種生体試料中のキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼとその基質となる物質がキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼの作用によってＡＤＰに導くことができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反応４および５で示される酵素反応系を共役させることにより生体試料中のＡＤＰに誘導されるは酵素活性またはその基質の量を、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量として測定することができる。これらの例として基質と使用する酵素の関係として表１に示し、その反応に関与する基質や酵素活性いずれか一方の測定をなし、その反応に関与する他方の成分（但し、関与する他方の成分として、ＡＴＰは包含、意味しないものとする）を反応に関与するの成分の反応試薬として使用すればよい。
【００２８】
【表１】
【００２９】
以下にこれらの反応式を示す。
生体試料として尿素またはウレアアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分としての反応試薬を使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。なお、反応に関与する成分の反応試薬（但し、関与する他方の成分として、ＡＴＰは包含、意味しないものとする：以下同様である）としては、下記反応式中の左側および矢印下段に記載の成分を意味する（以下、同様である）もので、生体試料として尿素を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはウレアアミドヒドロラーゼ、水分子、マグネシウムイオン（塩化マグネシウム）、炭酸水素カリウムが挙げられ、また生体試料としてウレアアミドヒドロラーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては尿素、水分子、マグネシウムイオン（塩化マグネシウム）、炭酸水素カリウムが挙げられ、但し水分子は反応媒体の分子にて代替される。
【００３０】
【化６】
【００３１】
生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示す。なお、このような逐次酵素反応の場合、反応式中の左側の成分と右側の成分とが同一の場合には逐次反応での生成成分の逐次反応物であることから反応に関与する成分であるが反応試薬として別途に添加するものではないことは明白である（以下、同様である）。
【００３２】
また、下記反応式における▲１▼、▲２▼について、生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、酵素反応にて生成されるクレアチンを▲１▼の反応にて生成されるＡＤＰとして測定してもよく、または酵素反応にて生成されるクレアチンを▲２▼以下の反応にて生成されるＡＤＰとして測定してもよいことを意味する。
【００３３】
生体試料としてクレアチニンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては▲１▼の反応系ではクレアチニンアミドヒドロラーゼ、水分子、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、マグネシウムイオンが挙げられ、▲２▼の反応系ではクレアチニンアミドヒドロラーゼ、水分子、クレアチンアミドヒドロラーゼ、尿素、ウレイドアミドヒドロラーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、また生体試料としてクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては▲１▼の反応系ではクレアチニン、水分子、クレアチンキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、▲２▼の反応系ではクレアチニン、水分子、クレアチンアミドヒドロラーゼ、尿素、ウレイドアミドヒドロラーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００３４】
【化７】
【００３５】
生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンデイミナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてクレアチニンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチニンデイミナーゼ、水分子、Ｎ−メチルヒダントインナーゼが挙げられ、生体試料としてクレアチニンデイミナーゼ活性測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチニン、水分子、Ｎ−メチルヒダントインナーゼが挙げられる。
【００３６】
【化８】
【００３７】
生体試料としてクレアチンまたはクレアチンキナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてクレアチンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチンキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、また生体試料としてクレアチンキナーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチン、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００３８】
【化９】
【００３９】
なお、反応式９のクレアチンは、上記反応式７に基づいて遊離されたクレアチンであってもよい。
生体試料としてグリセロールまたはグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてグリセロールを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはグリセロールキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００４０】
【化１０】
【００４１】
なお、グリセロールは、トリグリセリドやモノまたはジグリセリドにリパーゼや膵リパーゼ（但し、活性化剤としてＣｏ−リパーゼを適宜添加する）を作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、また、ホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよい。
特に、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを合成基質とした膵リパーゼ活性測定の目的に好適である。
【００４２】
例えば、生体試料としてトリグリセリド定量の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはリパーゼ、水分子、グリセロールキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。また、膵リパーゼ活性測定の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては、トリグリセリドやジグリセリドの合成基質、水分子、グリセロールキナーゼ、マグネシウムイオン、適宜Ｃｏ−リパーゼ、合成基質の可溶化剤としての界面活性剤が挙げられる。
【００４３】
生体試料としてコリンまたはコリンキナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。
【００４４】
【化１１】
【００４５】
なお、コリンはホスファチジルコリン（リン脂質成分）にホスリパーゼＤを作用せしめて遊離されたコリンやコリンエステル、例えばベンゾイルコリンまたはオルトトルオイルコリンなどの合成基質にコリンエステラーゼを作用させて遊離されたコリンであってもよい。
特に、生化学検査項目としてのリン脂質成分定量の目的、合成基質を用いたコリンエステラーゼ活性測定の目的に好適である。
【００４６】
このリン脂質成分定量の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはホスリパーゼＤ、水分子、マグネシウムイオンが挙げられ、またコリンエステラーゼ活性測定の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては例えばベンゾイルコリンまたはオルトトルオイルコリンなどの合成基質、水分子、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００４７】
以下、同様に、生体試料として基質またはＡＤＰを生成する酵素の一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。
また、本発明の測定法の完成に基づき、本発明における反応に関与する成分の反応試薬は、上記および下記の種々反応式から明白なものであり、測定すべき被検液によって適宜選択、調製が可能であることも明らかであり、さらにまたこれらの反応試薬は記載のものに何ら限定されるものではない。
【００４８】
【化１２】
【００４９】
【化１３】
【００５０】
【化１４】
【００５１】
【化１５】
【００５２】
【化１６】
【００５３】
【化１７】
【００５４】
【化１８】
【００５５】
【化１９】
【００５６】
【化２０】
【００５７】
【化２１】
【００５８】
【化２２】
【００５９】
【化２３】
【００６０】
【化２４】
【００６１】
【化２５】
【００６２】
【化２６】
【００６３】
【化２７】
【００６４】
【化２８】
【００６５】
【化２９】
【００６６】
なお、上記反応式におけるアンモニアとしては、前記反応式６にて例示される尿素とウレアアミドヒドロラーゼとの反応によって生成されたアンモニアであってもよく、また反応式７にて例示される▲２▼の反応系におけるクレアチニンとクレアチニンアミドヒドロラーゼとの反応によって生成されたアンモニアであってもよく、反応式８のクレアチニンとクレアチニンデイミナーゼのための前段の反応によって生成されたアンモニアであってもよいもので、このアンモニアとしては何ら限定されるものではない。
【００６７】
【化３０】
【００６８】
【化３１】
【００６９】
【化３２】
【００７０】
【化３３】
【００７１】
【化３４】
【００７２】
【化３５】
【００７３】
【化３６】
【００７４】
上記反応において、特にＧＯＴ活性測定として好適である。
【００７５】
【化３７】
【００７６】
上記反応において、特にＧＰＴ活性測定として好適である。
これらの反応において、添加するＡＴＰの量は例えば０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。また、基質を定量する場合に、添加する酵素量は１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。さらに、酵素活性を測定する場合の添加する基質は１〜１００ｍＭ程度である。これらの基質や酵素以外の反応に関与する成分の反応試薬においては、基質と反応して消費される成分は上記基質の使用量と同量ないしそれの２倍量程度でよく、マグネシウムイオンの濃度としては好適には塩化マグネシウムとして０．１〜５０ｍＭ程度、好適には０．５〜１０ｍＭ程度であるが、特に反応において阻害を受けない限りこれらより過剰量を使用することを除外するものではない。
【００７７】
またこれらの反応は、前記反応式４および５とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよいが、好ましくは同一反応系となすことである。
特に、好適な例を述べると、尿素の場合は既存測定法は
【００７８】
【化３８】
【００７９】
上記反応式３８に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の減少法であり、そのため、
（８）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（９）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量により制限される（測定レンジが狭い）。
（１０）還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量を変える必要がある。
（１１）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤ（Ｐ）が不安定である。
（１２）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
【００８０】
さらに、この測定法は原理的にアンモニアを測定する方法であるために、
（１３）検体や試薬中のアンモニアを消去する必要がある。
それに対して、本発明の測定法は
【００８１】
【化３９】
【００８２】
【化４０】
【００８３】
【化４１】
【００８４】
上記反応式３９、４０、４１に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに、アンモニアの消去も必要としない優れた測定法であった。
クラアチンキナーゼの場合は既存測定法は
【００８５】
【化４２】
【００８６】
上記反応式４２に示した。この反応系では基質となるクレアチンリン酸が非常に高価で測定試薬の値段が高くなる欠点があった。
それに対して、本発明の測定法は
【００８７】
【化４３】
【００８８】
【化４４】
【００８９】
【化４５】
【００９０】
上記反応式４３、４４、４５に示す通り、基質としてクレアチンを用いるため測定試薬を安価に提供することができた。
クレアチニンの場合は既存測定法は
【００９１】
【化４６】
【００９２】
上記反応式４６に示す通り、オキシダーゼ法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるために測定値が不正確となり、さらにザルコシンオキシダーゼがプロリンに作用し、検体中のプロリンの影響を受ける等の欠点を有する。
それに対して、本発明の測定法は
【００９３】
【化４７】
【００９４】
【化４８】
【００９５】
【化４９】
【００９６】
【化５０】
【００９７】
【化５１】
【００９８】
【化５２】
【００９９】
上記反応式４７、４８、４９および５０、５１、５２に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）やプロリンの影響を全く受けない。
トリグリセリドの場合は既存測定法は
【０１００】
【化５３】
【０１０１】
上記反応式５３に示す通り、オキシダーゼ法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、本発明の測定法は
【０１０２】
【化５４】
【０１０３】
【化５５】
【０１０４】
【化５６】
【０１０５】
上記反応式５４、５５、５６に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、検体中の還元物質の影響を全く受けない。
なお、上記反応式５４のトリグリセリドの代わりにジグリセリドやモノグリセリド（これらの場合２分子または１分子の水分子を消費して２分子または１分子の脂肪酸を遊離する反応式となる）の場合も同様である。
【０１０６】
ホスファチジルコリンの場合は既存測定法は
【０１０７】
【化５７】
【０１０８】
上記反応式５７に示す通り、オキシダーゼ法であり検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、本発明の測定法は
【０１０９】
【化５８】
【０１１０】
【化５９】
【０１１１】
【化６０】
【０１１２】
上記反応式５８、５９、６０に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり検体中の還元物質の影響を受けない。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）の場合の既存測定法は
【０１１３】
【化６１】
【０１１４】
上記反応式６１に示す通り、還元型ＮＡＤの減少法であり、そのため、
（１４）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（１５）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される（測定レンジが狭い）。
（１６）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（１７）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
（１８）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
さらに、この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、正確に測定することができない方法であった。
【０１１５】
それに対して、本発明での測定方法は
【０１１６】
【化６２】
【０１１７】
【化６３】
【０１１８】
【化６４】
【０１１９】
上記反応式６２、６３、６４に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去も必要としない優れた測定法であった。
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）の場合の既存測定法は
【０１２０】
【化６５】
【０１２１】
上記反応式６５に示す通り、還元型ＮＡＤの減少法であり、
（１９）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２０）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。（測定レンジが狭い）
（２１）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（２２）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
（２３）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
さらに、この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、正確に測定することができない方法であった。
それに対して、本発明での測定法は
【０１２２】
【化６６】
【０１２３】
【化６７】
【０１２４】
【化６８】
【０１２５】
上記反応式６６、６７、６８に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去も必要としない優れた測定法であった。
以下、本発明の生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の測定方法を例をもって具体的に説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものでない。
【０１２６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例、参考例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例、参考例によって限定されるものではない。
【０１２７】
【参考例】
ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
０．０２５％ ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＨ）
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
ＡＤＰ−ＨＫの取得
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＷＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．１％ システイン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。
【０１２８】
ＡＤＰ−ＨＫの精製
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【０１２９】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
【０１３０】
その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【０１３１】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【０１３２】
【化６９】
【０１３３】
（２）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１０００００±５０００であった。
（３）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
【０１３４】
（４）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫと認められた。
【０１３５】
【実施例１】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときの尿素の定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
３０Ｕ／ｍｌ ウレアアミドリアーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＫＨＣＯ3
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
尿素を２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、尿素サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに尿素サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１に示すように尿素が定量的に測定できた。
【０１３６】
【実施例２】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量（１）
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１００Ｕ／ｍｌ クレアチニンアミドヒドロラーゼ
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図２に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１３７】
【実施例３】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量（２）
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌ クレアチニンデイミナーゼ
１０Ｕ／ｍｌ Ｎ−メチルヒダントイナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．７ｍＭ、５．３ｍＭ、７．９ｍＭ，１０．５ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図３に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１３８】
【実施例４】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図４に示すようにクレアチンが定量的に測定できた。
【０１３９】
【実施例５】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロールの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グリセロールを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、グリセロールサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグリセロールサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図５に示すようにグリセロールを定量的に測定できた。また、トリグセリドにリパーゼを作用させ遊離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用させ遊離するグリセロールも測定することができた。
【０１４０】
【実施例６】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのコリンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ コリンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
塩化コリンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、塩化コリンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに塩化コリンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図６に示すようにコリンを定量的に測定できた。また、リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、遊離するコリンも測定することができた。
【０１４１】
【実施例７】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＬ−グルタミン酸の測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌ グルタミンシンセターゼ
１０ｍＭ ＮＨ4 Ｃｌ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定法方
Ｌ−グルタミン酸を２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ、１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調製し、Ｌ−グルタミン酸サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＬ−グルタミン酸サンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照として、測定した。図７に示すようにＬ−グルタミン酸が定量的に測定できた。また、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＧＯＴ）やアラニントランスフェラーゼ（ＧＰＴ）の作用によって遊離するＬ−グルタミン酸も測定することができた。
【０１４２】
【実施例８】
３７℃でコバルトイオンを用いたときの尿素の定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
３０Ｕ／ｍｌ ウレアアミドリアーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＫＨＣＯ3
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＣｏＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
尿素を２．３ｍＭ、４．６ｍＭ、６．９ｍＭ，９．２ｍＭ、１１．５ｍＭの水溶液に調整し、尿素サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに尿素サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図８に示すように尿素が定量的に測定できた。
【０１４３】
【実施例９】
３７℃でマンガンイオンを用いたときのクレアチニンの定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１００Ｕ／ｍｌ クレアチニンアミドヒドロラーゼ
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ，１０．０ｍＭ、１２．５ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図９に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１４４】
【実施例１０】
２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチンを２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、８．４ｍＭ，１１．２ｍＭ、１４ｍＭの水溶液に調整し、クレアチンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加え、２０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図１０に示すようにクレアチンが定量的に測定できた。
【０１４５】
【実施例１１】
４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロールの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グリセロールを２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．１ｍＭ，１０．８ｍＭ、１３．５ｍＭの水溶液に調整し、グリセロールサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグリセロールサンプル２０μｌを加え、４０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図１１に示すようにグリセロールを定量的に測定できた。また、トリグセリドにリパーゼを作用させ遊離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用させ遊離するグリセロールも測定することができた。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明の測定方法では、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて生体物質を測 定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっている還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を測定するので、測定値の信頼性が高い。更に、本発明の測定方法は、検体中の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。従って、本発明によれば、生体試料中のＡＤＰを生成する酵素とその基質を簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときの尿素測定の検量線を示す。
【図２】図２は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニン測定（１）の検量線を示す。
【図３】図３は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニン測定（２）の検量線を示す。
【図４】図４は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチン測定の検量線を示す。
【図５】図５は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロール測定の検量線を示す。
【図６】図６は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのコリン測定の検量線を示す。
【図７】図７は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグルタミン酸測定の検量線を示す。
【図８】図８は、３７℃でコバルトイオンを用いたときの尿素測定の検量線を示す。
【図９】図９は、３７℃でマンガンイオンを用いたときのクレアチニン測定の検量線を示す。
【図１０】図１０は、２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチン測定の検量線を示す。
【図１１】図１１は、４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロール測定の検量線を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を含有する被検液を少なくともＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）〔酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕類の生成量に基づいて測定する方法に関し、臨床検査などの分野で用いられ、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中のＡＤＰ生成する酵素またはその基質を測定する目的である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を測定する方法としては酵素反応による基質の反応生成物に作用する他の脱水素酵素または酸化酵素と組み合わせて測定する方法（例えば、グリセロールとグリセロールキナーゼの場合、グリセロールにＡＴＰの存在下、グリセロールキナーゼを作用させてＡＤＰおよびグリセロールリン酸を生成せしめ、このグリセロールリン酸をグリセロールリン酸脱水素酵素またはグリセロールリン酸オキシダーゼを用いて測定する方法）や酵素反応によって生成するＡＤＰを種々の方法で測定する方法が知られている。
【０００３】
しかし、他の脱水素酵素や酸化酵素と組み合わせて、測定する方法はＡＤＰを生成する酵素によって、それぞれ、組み合わせの酵素を変えなければならず、汎用性に欠け、また、測定しようとする基質や酵素によっては組み合わせの酵素が存在しない場合もある。
また、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定する方法としては液体クロマトグラフィーを用いて測定する方法が知られているが液体クロマトグラフィー法は操作性が煩雑であるという欠点を有している。
【０００４】
さらに、操作性に優れるＡＤＰ測定酵素法としてピルビン酸キナーゼ〔ＰＫ（ＥＣ ２．７．１．４０）〕と乳酸脱水素酵素〔ＬＤＨ（ＥＣ １．２．３．３）〕を用いた還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ＋Ｈ+ ）の減少法（反応式１）、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いたオキシダーゼ法（反応式２）やピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）〔ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+ 〕の増加法（反応式３）が知られている（特開平７−８２９７号公報）。
【０００５】
これらの反応式を以下に示す。下記式中のＰＥＰはホスホエノールピルビン酸、Ｐｉはリン酸、ＰＤＣはピルビン酸脱炭酸酵素、ＡｌＤＨはアルデヒド脱水素酵素、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を意味する。
【０００６】
【化１】
【化２】
【化３】
しかしながら、還元型ＮＡＤの減少法においては、前もって所定量の還元型ＮＡＤを反応液内に存在させ、反応の終了後、反応液内に残存する還元型ＮＡＤの量を測定する減少法であるために、
（１）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。
【００１０】
（３）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（４）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
等の問題点がある。
また、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸オキシダーゼを用いて生ずる過酸化水素の発色指示薬系を用いて測定するピルビン酸の定量法が広く利用されているが、（５）この方法は生体試料中の干渉物質（還元物質）（尿酸、アスコルビン酸等）や着色物質（ビリルビン、ヘモグロビン等）の影響を受けるので測定値の正確さにおいて必ずしも十分満足できる方法とはいえない。
【００１１】
また、ピルビン酸キナーゼとピルビン酸脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素を用いた還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法は用いる酵素の反応の数が多く、繁雑な手法にすぎなっかた。
また、本発明に使用されるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼとしては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８）菌株の菌体内に存在することが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１７５３７−１７５４１）が、該菌株の生育温度が９０℃〜１０５℃であるため、その由来する酵素の至適温度が９０℃以上であり、活性測定に用いているＧ６ＰＤＨは酵母由来でその熱安定性を考慮して、活性測定を５０℃で行っているもので、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度と異なる温度条件にて活性測定を行ったものにすぎず、ＡＤＰ−ＨＫの至適温度に照らして一般の臨床診断の温度条件とは全く異なる測定条件であった。かつ、５０℃の反応温度で測定を行うことに関して、臨床診断の分野では反応温度として５０℃で行うと（６）組み合わせの酵素の失活によって正確に測定できない。（７）検体となる生体成分の熱変性がおこり、にごりが生じる。などの問題点があり正確な測定が不可能であった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
まず、本発明者らはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株を培養し、ＡＤＰ−ＨＫを精製し、該酵素の反応の至適温度を調べた結果、至適温度は８０〜１００℃であった。さらに３７℃における相対活性は１００℃の場合の１０％程度であり、一般的にこのような性質の酵素を用いて３７℃で反応を行わせると正確な定量反応を行わせることは不可能であると思われた。しかし、意外にも本発明者らは３７℃で該酵素反応を用いた定量実験を実施して、該酵素反応３７℃を含む生体成分の一般的定量における通常の反応温度条件である１５〜４５℃の温度条件でも生体成分としての基質または酵素活性の測定が可能であることを見いだした。
【００１３】
さらに、本発明者らは、下記酵素反応（反応式４、５）を用いて生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を測定する方法において、生体試料がＡＤＰを生成する酵素の活性測定を目的とする被検液の場合にはその酵素の基質とＡＴＰの存在下にＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬を用いて、または生体試料が基質の量の測定を目的とする被検液の場合にはその基質に作用してＡＤＰを生成する酵素とＡＴＰの存在下にＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬を用いて、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンに基づく反応により、ＡＤＰをＡＭＰを生成せしめるとともに酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を還元型ＮＡＤ（Ｐ）類に還元する反応を行い、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいた生体中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の定量方法が極めて有用であり、かかる反応が生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質に普遍的に利用できる酵素反応であることを見い出して、本発明を完成した。
【００１４】
即ち、本発明は被検液としての生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を、ＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する反応試薬を用いるとともに、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下に反応せしめて簡便かつ高精度に測定することのできる方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を含有する被検液を少なくともＡＤＰを生成する酵素とその基質に基づく反応に関与する成分の反応試薬、ＡＴＰ、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫ、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類の存在下、１５〜４５℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法である。
【００１６】
本発明で用いられる、グルコース、ＡＤＰ−ＨＫおよび酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、Ｇ６ＰＤＨおよびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの存在下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を生成する酵素反応は下記反応式４及び５で示される。
【００１７】
【化４】
【化５】
以下、本発明をより詳細に説明する。
上記反応式４で示されるＡＤＰ−ＨＫとしては、グルコースを基質とし、ＡＤＰを消費してグルコース−６−リン酸およびＡＭＰを生成するＡＤＰ−ＨＫであればなんら限定されるものではなく、例えばこのＡＤＰ−ＨＫ生産菌としては超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレン・ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られた高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫが好ましい。
【００２０】
また、上記反応式５で示される酵素反応に用いられるＧ６ＰＤＨは市販されており（ベーリンガーマンハイム社：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来、シグマ社：パン酵母、Ｂａｃｉｌｌｕｓ・ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ・ｍｅｓｅｎｔｏｒｏｉｄｅｓ由来）、容易に入手可能である。
【００２１】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応（反応式４）に使用するマグネシウムイオンの代わりにコバルトイオンまたはマンガンイオンを放出しうるいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化コバルト、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２２】
酵素反応式５に示されるように、上記Ｇ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ＮＡＤ、酸化型ＮＡＤＰを含む酸化型ＮＡＤ（Ｐ）の他に酸化型チオ−ＮＡＤ、酸化型チオ−ＮＡＤＰを含む酸化型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）、酸化型３−アセチルＮＡＤ、酸化型３−アセチルＮＡＤＰを含む酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノＮＡＤ、酸化型デアミノＮＡＤＰを含む酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明において、酵素反応４および５で示される酵素反応のＡＤＰ−ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測定対象となる被検液中の物質の種類、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよびＧ６ＰＤＨの濃度は０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜５０Ｕ／ｍｌ程度である。グルコース、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、グルコースは０．５〜１００ｍＭ程度、好ましくは１〜５０ｍＭ程度、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類は０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンの濃度としては０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２４】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）（例えばｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ６．５〜８）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。
【００２５】
測定対象となる被検液としてはＡＤＰを生成するかまたは形成されたＡＤＰを含有する生体試料が挙げられ、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。このような被検液としては通常５〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２６】
用いた酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類から形成される還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよく、例えば還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ、還元型チオ−ＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍの波長が選択される。また還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００２７】
本発明における生体試料である被検液中のＡＤＰを生成する酵素の基質またはその酵素活性の一方の測定において、ＡＴＰの存在下に、ＡＤＰを生成する酵素またはの基質を被検液とする場合、各種生体試料中のキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼとその基質となる物質がキナーゼ、シンセターゼ、ヒドロラーゼまたはカルボキシラーゼの作用によってＡＤＰに導くことができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反応４および５で示される酵素反応系を共役させることにより生体試料中のＡＤＰに誘導されるは酵素活性またはその基質の量を、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量として測定することができる。これらの例として基質と使用する酵素の関係として表１に示し、その反応に関与する基質や酵素活性いずれか一方の測定をなし、その反応に関与する他方の成分（但し、関与する他方の成分として、ＡＴＰは包含、意味しないものとする）を反応に関与するの成分の反応試薬として使用すればよい。
【００２８】
【表１】
以下にこれらの反応式を示す。
生体試料として尿素またはウレアアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分としての反応試薬を使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。なお、反応に関与する成分の反応試薬（但し、関与する他方の成分として、ＡＴＰは包含、意味しないものとする：以下同様である）としては、下記反応式中の左側および矢印下段に記載の成分を意味する（以下、同様である）もので、生体試料として尿素を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはウレアアミドヒドロラーゼ、水分子、マグネシウムイオン（塩化マグネシウム）、炭酸水素カリウムが挙げられ、また生体試料としてウレアアミドヒドロラーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては尿素、水分子、マグネシウムイオン（塩化マグネシウム）、炭酸水素カリウムが挙げられ、但し水分子は反応媒体の分子にて代替される。
【００３０】
【化６】
生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示す。なお、このような逐次酵素反応の場合、反応式中の左側の成分と右側の成分とが同一の場合には逐次反応での生成成分の逐次反応物であることから反応に関与する成分であるが反応試薬として別途に添加するものではないことは明白である（以下、同様である）。
【００３２】
また、下記反応式における▲１▼、▲２▼について、生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンアミドヒドロラーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、酵素反応にて生成されるクレアチンを▲１▼の反応にて生成されるＡＤＰとして測定してもよく、または酵素反応にて生成されるクレアチンを▲２▼以下の反応にて生成されるＡＤＰとして測定してもよいことを意味する。
【００３３】
生体試料としてクレアチニンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては▲１▼の反応系ではクレアチニンアミドヒドロラーゼ、水分子、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、マグネシウムイオンが挙げられ、▲２▼の反応系ではクレアチニンアミドヒドロラーゼ、水分子、クレアチンアミドヒドロラーゼ、尿素、ウレイドアミドヒドロラーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、また生体試料としてクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては▲１▼の反応系ではクレアチニン、水分子、クレアチンキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、▲２▼の反応系ではクレアチニン、水分子、クレアチンアミドヒドロラーゼ、尿素、ウレイドアミドヒドロラーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００３４】
【化７】
生体試料としてクレアチニンまたはクレアチニンデイミナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてクレアチニンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチニンデイミナーゼ、水分子、Ｎ−メチルヒダントインナーゼが挙げられ、生体試料としてクレアチニンデイミナーゼ活性測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチニン、水分子、Ｎ−メチルヒダントインナーゼが挙げられる。
【００３６】
【化８】
生体試料としてクレアチンまたはクレアチンキナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてクレアチンを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチンキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられ、また生体試料としてクレアチンキナーゼ活性を測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはクレアチン、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００３８】
【化９】
なお、反応式９のクレアチンは、上記反応式７に基づいて遊離されたクレアチンであってもよい。
生体試料としてグリセロールまたはグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。この場合、生体試料としてグリセロールを測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはグリセロールキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００４０】
【化１０】
なお、グリセロールは、トリグリセリドやモノまたはジグリセリドにリパーゼや膵リパーゼ（但し、活性化剤としてＣｏ−リパーゼを適宜添加する）を作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、また、ホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよい。
特に、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを合成基質とした膵リパーゼ活性測定の目的に好適である。
【００４２】
例えば、生体試料としてトリグリセリド定量の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはリパーゼ、水分子、グリセロールキナーゼ、マグネシウムイオンが挙げられる。また、膵リパーゼ活性測定の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては、トリグリセリドやジグリセリドの合成基質、水分子、グリセロールキナーゼ、マグネシウムイオン、適宜Ｃｏ−リパーゼ、合成基質の可溶化剤としての界面活性剤が挙げられる。
【００４３】
生体試料としてコリンまたはコリンキナーゼの一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。
【００４４】
【化１１】
なお、コリンはホスファチジルコリン（リン脂質成分）にホスリパーゼＤを作用せしめて遊離されたコリンやコリンエステル、例えばベンゾイルコリンまたはオルトトルオイルコリンなどの合成基質にコリンエステラーゼを作用させて遊離されたコリンであってもよい。
特に、生化学検査項目としてのリン脂質成分定量の目的、合成基質を用いたコリンエステラーゼ活性測定の目的に好適である。
【００４６】
このリン脂質成分定量の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としてはホスリパーゼＤ、水分子、マグネシウムイオンが挙げられ、またコリンエステラーゼ活性測定の目的として測定する場合の反応に関与する成分の反応試薬としては例えばベンゾイルコリンまたはオルトトルオイルコリンなどの合成基質、水分子、マグネシウムイオンが挙げられる。
【００４７】
以下、同様に、生体試料として基質またはＡＤＰを生成する酵素の一方を含有してこの一方を測定する方法において、その反応に関与する成分を反応試薬として使用した場合の反応式を下記に示し、酵素反応によって生成するＡＤＰを測定すればよい。
また、本発明の測定法の完成に基づき、本発明における反応に関与する成分の反応試薬は、上記および下記の種々反応式から明白なものであり、測定すべき被検液によって適宜選択、調製が可能であることも明らかであり、さらにまたこれらの反応試薬は記載のものに何ら限定されるものではない。
【００４８】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
なお、上記反応式におけるアンモニアとしては、前記反応式６にて例示される尿素とウレアアミドヒドロラーゼとの反応によって生成されたアンモニアであってもよく、また反応式７にて例示される▲２▼の反応系におけるクレアチニンとクレアチニンアミドヒドロラーゼとの反応によって生成されたアンモニアであってもよく、反応式８のクレアチニンとクレアチニンデイミナーゼのための前段の反応によって生成されたアンモニアであってもよいもので、このアンモニアとしては何ら限定されるものではない。
【００６７】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
上記反応において、特にＧＯＴ活性測定として好適である。
【００７５】
【化３７】
上記反応において、特にＧＰＴ活性測定として好適である。
これらの反応において、添加するＡＴＰの量は例えば０．１〜５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。また、基質を定量する場合に、添加する酵素量は１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。さらに、酵素活性を測定する場合の添加する基質は１〜１００ｍＭ程度である。これらの基質や酵素以外の反応に関与する成分の反応試薬においては、基質と反応して消費される成分は上記基質の使用量と同量ないしそれの２倍量程度でよく、マグネシウムイオンの濃度としては好適には塩化マグネシウムとして０．１〜５０ｍＭ程度、好適には０．５〜１０ｍＭ程度であるが、特に反応において阻害を受けない限りこれらより過剰量を使用することを除外するものではない。
【００７７】
またこれらの反応は、前記反応式４および５とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよいが、好ましくは同一反応系となすことである。
特に、好適な例を述べると、尿素の場合は既存測定法は
【００７８】
【化３８】
上記反応式３８に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の減少法であり、そのため、
（８）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（９）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量により制限される（測定レンジが狭い）。
（１０）還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤ（Ｐ）の量を変える必要がある。
（１１）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤ（Ｐ）が不安定である。
（１２）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
【００８０】
さらに、この測定法は原理的にアンモニアを測定する方法であるために、
（１３）検体や試薬中のアンモニアを消去する必要がある。
それに対して、本発明の測定法は
【００８１】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
上記反応式３９、４０、４１に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに、アンモニアの消去も必要としない優れた測定法であった。
クラアチンキナーゼの場合は既存測定法は
【００８５】
【化４２】
上記反応式４２に示した。この反応系では基質となるクレアチンリン酸が非常に高価で測定試薬の値段が高くなる欠点があった。
それに対して、本発明の測定法は
【００８７】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
上記反応式４３、４４、４５に示す通り、基質としてクレアチンを用いるため測定試薬を安価に提供することができた。
クレアチニンの場合は既存測定法は
【００９１】
【化４６】
上記反応式４６に示す通り、オキシダーゼ法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるために測定値が不正確となり、さらにザルコシンオキシダーゼがプロリンに作用し、検体中のプロリンの影響を受ける等の欠点を有する。
それに対して、本発明の測定法は
【００９３】
【化４７】
【化４８】
【化４９】
【化５０】
【化５１】
【化５２】
上記反応式４７、４８、４９および５０、５１、５２に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）やプロリンの影響を全く受けない。
トリグリセリドの場合は既存測定法は
【０１００】
【化５３】
上記反応式５３に示す通り、オキシダーゼ法であり、検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、本発明の測定法は
【０１０２】
【化５４】
【化５５】
【化５６】
上記反応式５４、５５、５６に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、検体中の還元物質の影響を全く受けない。
なお、上記反応式５４のトリグリセリドの代わりにジグリセリドやモノグリセリド（これらの場合２分子または１分子の水分子を消費して２分子または１分子の脂肪酸を遊離する反応式となる）の場合も同様である。
【０１０６】
ホスファチジルコリンの場合は既存測定法は
【０１０７】
【化５７】
上記反応式５７に示す通り、オキシダーゼ法であり検体中の還元物質（アスコルビン酸等）の影響を受けるので測定値が不正確となる。
それに対して、本発明の測定法は
【０１０９】
【化５８】
【化５９】
【化６０】
上記反応式５８、５９、６０に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり検体中の還元物質の影響を受けない。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）の場合の既存測定法は
【０１１３】
【化６１】
上記反応式６１に示す通り、還元型ＮＡＤの減少法であり、そのため、
（１４）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（１５）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される（測定レンジが狭い）。
（１６）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（１７）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
（１８）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
さらに、この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、正確に測定することができない方法であった。
【０１１５】
それに対して、本発明での測定方法は
【０１１６】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
上記反応式６２、６３、６４に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去も必要としない優れた測定法であった。
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）の場合の既存測定法は
【０１２０】
【化６５】
上記反応式６５に示す通り、還元型ＮＡＤの減少法であり、
（１９）測定対象の成分が少ない場合には測定値が不正確である。
（２０）測定できる成分の上限値が定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量により制限される。（測定レンジが狭い）
（２１）還元型ＮＡＤの量の測定に使用する分光光度計の機種に応じて、定量前に反応液内に存在させる還元型ＮＡＤの量を変える必要がある。
（２２）分析用試薬中に含有される還元型ＮＡＤが不安定である。
（２３）ドライ用試薬への対応が不可能である。等の欠点を有する。
さらに、この測定法は検体中の乳酸脱水素酵素の影響を受け、正確に測定することができない方法であった。
それに対して、本発明での測定法は
【０１２２】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
上記反応式６６、６７、６８に示す通り、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の増加法であり、減少法により生じる欠点は全く無く、さらに検体中の乳酸脱水素酵素の消去も必要としない優れた測定法であった。
以下、本発明の生体試料中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の測定方法を例をもって具体的に説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものでない。
【０１２６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例、参考例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例、参考例によって限定されるものではない。
【０１２７】
【参考例】
ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
０．０２５％ ＮＢＴ（ニトロテトラゾニウムブルー）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＨ）
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
ＡＤＰ−ＨＫの取得
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3 ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＷＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 ＭｏＯ4
０．１％ システイン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。
【０１２８】
ＡＤＰ−ＨＫの精製
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【０１２９】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
【０１３０】
その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【０１３１】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【０１３２】
【化６９】
（２）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１０００００±５０００であった。
（３）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
【０１３４】
（４）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性ＡＤＰ−ＨＫと認められた。
【０１３５】
【実施例１】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときの尿素の定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
３０Ｕ／ｍｌ ウレアアミドリアーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＫＨＣＯ3
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
尿素を２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、尿素サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに尿素サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１に示すように尿素が定量的に測定できた。
【０１３６】
【実施例２】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量（１）
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１００Ｕ／ｍｌ クレアチニンアミドヒドロラーゼ
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図２に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１３７】
【実施例３】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニンの定量（２）
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌ クレアチニンデイミナーゼ
１０Ｕ／ｍｌ Ｎ−メチルヒダントイナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．７ｍＭ、５．３ｍＭ、７．９ｍＭ，１０．５ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図３に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１３８】
【実施例４】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、クレアチンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図４に示すようにクレアチンが定量的に測定できた。
【０１３９】
【実施例５】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロールの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グリセロールを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、グリセロールサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグリセロールサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図５に示すようにグリセロールを定量的に測定できた。また、トリグセリドにリパーゼを作用させ遊離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用させ遊離するグリセロールも測定することができた。
【０１４０】
【実施例６】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのコリンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ コリンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
塩化コリンを２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ，１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調整し、塩化コリンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに塩化コリンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図６に示すようにコリンを定量的に測定できた。また、リン脂質にホスホリパーゼＤを作用させ、遊離するコリンも測定することができた。
【０１４１】
【実施例７】
３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのＬ−グルタミン酸の測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ＰＨ７．５）
１０Ｕ／ｍｌ グルタミンシンセターゼ
１０ｍＭ ＮＨ4 Ｃｌ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定法方
Ｌ−グルタミン酸を２．６ｍＭ、５．２ｍＭ、７．８ｍＭ、１０．４ｍＭ、１３ｍＭの水溶液に調製し、Ｌ−グルタミン酸サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにＬ−グルタミン酸サンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照として、測定した。図７に示すようにＬ−グルタミン酸が定量的に測定できた。また、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＧＯＴ）やアラニントランスフェラーゼ（ＧＰＴ）の作用によって遊離するＬ−グルタミン酸も測定することができた。
【０１４２】
【実施例８】
３７℃でコバルトイオンを用いたときの尿素の定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
３０Ｕ／ｍｌ ウレアアミドリアーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＫＣｌ
８ｍＭ ＫＨＣＯ3
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＣｏＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
尿素を２．３ｍＭ、４．６ｍＭ、６．９ｍＭ，９．２ｍＭ、１１．５ｍＭの水溶液に調整し、尿素サンプルを作成した。測定試薬１ｍｌに尿素サンプル２０μｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図８に示すように尿素が定量的に測定できた。
【０１４３】
【実施例９】
３７℃でマンガンイオンを用いたときのクレアチニンの定量
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１００Ｕ／ｍｌ クレアチニンアミドヒドロラーゼ
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチニンを２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、７．５ｍＭ，１０．０ｍＭ、１２．５ｍＭの水溶液に調整し、クレアチニンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図９に示すようにクレアチニンが定量的に測定できた。
【０１４４】
【実施例１０】
２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチンの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ クレアチンキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
クレアチンを２．８ｍＭ、５．６ｍＭ、８．４ｍＭ，１１．２ｍＭ、１４ｍＭの水溶液に調整し、クレアチンサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加え、２０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図１０に示すようにクレアチンが定量的に測定できた。
【０１４５】
【実施例１１】
４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロールの測定
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５Ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ
２ｍＭ ＡＴＰ
２０ｍＭ グルコース
５Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グリセロールを２．７ｍＭ、５．４ｍＭ、８．１ｍＭ，１０．８ｍＭ、１３．５ｍＭの水溶液に調整し、グリセロールサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグリセロールサンプル２０μｌを加え、４０℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照として、測定した。図１１に示すようにグリセロールを定量的に測定できた。また、トリグセリドにリパーゼを作用させ遊離するグリセロールやホスファチジルグリセロールにホスホリパーゼＤを作用させ遊離するグリセロールも測定することができた。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明の測定方法では、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて生体物質を測 定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっている還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を測定するので、測定値の信頼性が高い。更に、本発明の測定方法は、検体中の還元物質などの影響を受けないという利点を有する。従って、本発明によれば、生体試料中のＡＤＰを生成する酵素とその基質を簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときの尿素測定の検量線を示す。
【図２】図２は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニン測定（１）の検量線を示す。
【図３】図３は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチニン測定（２）の検量線を示す。
【図４】図４は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチン測定の検量線を示す。
【図５】図５は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロール測定の検量線を示す。
【図６】図６は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのコリン測定の検量線を示す。
【図７】図７は、３７℃でマグネシウムイオンを用いたときのグルタミン酸測定の検量線を示す。
【図８】図８は、３７℃でコバルトイオンを用いたときの尿素測定の検量線を示す。
【図９】図９は、３７℃でマンガンイオンを用いたときのクレアチニン測定の検量線を示す。
【図１０】図１０は、２０℃でマグネシウムイオンを用いたときのクレアチン測定の検量線を示す。
【図１１】図１１は、４０℃でマグネシウムイオンを用いたときのグリセロール測定の検量線を示す。
Claims (16)
- 酵素反応を用いて被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質の一方を測定する方法において、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質のいずれか一方を含有する被検液を、以下１）〜７）の存在下、２０〜４０℃の温度条件にて反応させ、被検液中のＡＤＰを生成する酵素またはその基質を反応によって生成されるＡＭＰとともに、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量に基づいて測定する方法。
１）ＡＤＰを生成する酵素とその基質のうち、測定対象と異なる他方を含む反応試薬
２）ＡＴＰ
３）グルコース
４）ピロコッカス・フリオサス由来ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
５）酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類
６）グルコース−６−リン酸脱水素酵素
７）マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類 - ＡＤＰを生成する酵素がウレアアミドヒドラーゼであり、その基質がウレアである請求項１記載の測定する方法。
- ＡＤＰを生成する酵素がクレアチンキナーゼであり、その基質がクレアチンである請求項１記載の測定する方法。
- クレアチンが、クレアチニンにクレアチニナーゼを作用させて遊離されたクレアチンである請求項３記載の測定する方法。
- ＡＤＰを生成する酵素がＮ−メチルヒダントイナーゼであり、その基質がＮ−メチルヒダントインである請求項１記載の測定する方法。
- Ｎ−メチルヒダントインが、クレアチニンにクレアチニンデイミナーゼを作用させて遊離されたＮ−メチルヒダントインである請求項５記載の測定する方法。
- ＡＤＰを生成する酵素がグリセロールキナーゼであり、その基質がグリセロールである請求項１記載の測定する方法。
- グリセロールが、リパーゼの作用によってトリグリセリド、ジグリセリドまたはモノグリセリドから遊離されたグリセロールまたはホスホリパーゼＤの作用によるホスファチジルグリセロールから遊離されたグリセロール請求項７記載の測定する方法。
- ＡＤＰを生成する酵素がコリンキナーゼであり、その基質がコリンである請求項１記載の測定する方法。
- コリンが、ホスホリパーゼＤの作用によるホスファチジルコリンまたはコリンエステラーゼの作用によるコリンエステルから遊離されるコリンである請求項９記載の測定する方法。
- ＡＤＰを生成する酵素がグルタミンシンターゼまたはグルタミン酸キナーゼであり、その基質がＬ−グルタミン酸である請求項１記載の測定する方法。
- Ｌ−グルタミン酸が、Ｌ−アスパラギン酸及びα−ケトグルタル酸からアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの作用により形成されるＬ−グルタミン酸である請求項１１記載の測定する方法。
- Ｌ−グルタミン酸が、Ｌ−アラニン及びα−ケトグルタル酸からアラニンアミノトランスフェラーゼの作用により形成されるＬ−グルタミン酸である請求項１１記載の測定する方法。
- 以下１）〜７）を含有することを特徴とする、ＡＤＰを生成する酵素またはその基質のいずれか一方の測定用組成物。
１）ＡＤＰを生成する酵素とその基質のうち、測定対象と異なる他方を含む反応試薬
２）ＡＴＰ
３）グルコース
４）ピロコッカス・フリオサス由来ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
５）酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類
６）グルコース−６−リン酸脱水素酵素
７）マグネシウムイオン、コバルトイオンまたはマンガンイオンのいずれか１種または２種以上のイオン放出性塩類 - ＡＤＰを生成する酵素がウレアミドヒドラーゼであり、その基質がウレアである請求項１４記載の組成物。
- ＡＤＰを生成する酵素がクレアチンキナーゼであり、その基質がクレアチンである請求項１４記載の組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01614497A JP4155415B2 (ja) | 1996-02-19 | 1997-01-30 | 生体試料の測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-30352 | 1996-02-19 | ||
| JP3035296 | 1996-02-19 | ||
| JP01614497A JP4155415B2 (ja) | 1996-02-19 | 1997-01-30 | 生体試料の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09285297A JPH09285297A (ja) | 1997-11-04 |
| JP4155415B2 true JP4155415B2 (ja) | 2008-09-24 |
Family
ID=26352406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01614497A Expired - Fee Related JP4155415B2 (ja) | 1996-02-19 | 1997-01-30 | 生体試料の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4155415B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7195884B2 (en) | 2002-07-19 | 2007-03-27 | Promega Corp. | Methods and kits for transferases |
| JP2011103826A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐまたは酵素反応でａｄｐを発生する特定物質のドライケミストリーによる測定方法およびそれに用いる検査器具 |
| WO2011136063A1 (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | 日東紡績株式会社 | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット |
| CN107075558B (zh) | 2014-09-26 | 2021-09-24 | 旭化成制药株式会社 | 使用激酶的新型测定方法及组合物 |
| JP6989300B2 (ja) * | 2016-10-25 | 2022-01-05 | アークレイ株式会社 | アンモニアの定量方法、定量試薬キット、試験片及びアンモニアの定量装置 |
| JP7328739B2 (ja) * | 2017-08-10 | 2023-08-17 | アークレイ株式会社 | グルタミン合成酵素反応を効率よく行う方法、及び該方法を利用したアンモニア定量方法、並びにグルタミン合成酵素反応用試薬及びそれを含むアンモニア定量用試薬キット |
| WO2020080249A1 (ja) | 2018-10-19 | 2020-04-23 | 旭化成ファーマ株式会社 | 酵素的測定方法及び酵素的測定用試薬 |
-
1997
- 1997-01-30 JP JP01614497A patent/JP4155415B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09285297A (ja) | 1997-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4155415B2 (ja) | 生体試料の測定法 | |
| EP0881301B1 (en) | Method for assaying vital sample | |
| EP0575610B1 (en) | Highly sensitive determination of ammonia, alpha-amino acid or alpha-keto acid and composition therefor | |
| JP4140929B2 (ja) | １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 | |
| JP3885977B2 (ja) | 生体試料を測定する方法 | |
| JP3049217B2 (ja) | Ａｄｐの測定法 | |
| JPH0234599B2 (ja) | ||
| JPH0373276B2 (ja) | ||
| EP0089210A2 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| JPH10225300A (ja) | グルコースまたはａｄｐの高感度測定法 | |
| EP0685561B1 (en) | Reagent for assaying creatine kinase | |
| JP2818696B2 (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| JP3586737B2 (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| JP3852991B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法および用途 | |
| JP2001252095A (ja) | 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物 | |
| JPH0422560B2 (ja) | ||
| JPH04346796A (ja) | 乳酸またはピルビン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP4029609B2 (ja) | 生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬キット | |
| JP4001658B2 (ja) | キナーゼ | |
| JP3743534B2 (ja) | 新規な塩素イオン測定方法およびその試薬 | |
| JPS5915637B2 (ja) | ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法 | |
| JPH0686693A (ja) | 生体物質の測定方法 | |
| JPS63129996A (ja) | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 | |
| JPH04126099A (ja) | ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP2000032980A (ja) | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060530 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060720 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061205 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061213 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20061213 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080423 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080609 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080702 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080703 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110718 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110718 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120718 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130718 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |