JPS63129996A - Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、並び
にフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピル
ビン酸の定量法に関する。Ｌ−フェニルアラニンの定量
は、特にアミノ酸代謝異常症であるフェニルケトン尿症
の早期発見のための新生児マススクリーニングにおいて
広く行なわれている。また、フェニルピルビン酸及び４
−ヒドロキシフェニルピルビン酸の定量を行なうことに
より、それぞれフェニルケトン尿症や、チロシン血症等
の診断及び治療に有用な情報が得られると期待される。

〔従来の技術〕

従来、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−チロシンを酵素を用
いて定量分析するには、フェニルアラニンアンモニアリ
アーゼを用いる方法〔ハーグマイヤーら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍａｔｉｃ　Ａｎａｌ　ｓｉｓ、　
３ｒｄｅｄ、　８．４０５　（１９８５）　）　、Ｌ−
アミノ酸デカルボキシラーゼを用いる方法〔アゾンフレ
ンド、Ｊｏｕｒｎａ　１ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　２０３．９５３　（１９５３）
）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる方法〔ギルバー
ト、１ｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｎｚ　ｍａｔｉｃ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆハ旦Ｌｎ、　ｐ２１７　（１９７
６）　〕、７　ニー１−ルアラニンオキシダーゼを用い
る方法〔コヤマ、Ｃ１ｉｎＣ１１ｎｉｃａＣｈｉ　Ａｃ
ｔａ　１３６．１３１　（１９８４））等がある。しか
しながら、これらの方法は、Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素を用いる方法ではない。

特開昭５７−１４６５９７及びコヤマ、Ｃ１１ｎｉｃａ
　Ｃｈｉｍｉｃａ知田、１３６．１３１　（１９８４）
には、フェニルアラニンオキシダーゼを用いるＬ−フェ
ニルアラニンの定量法が記載されている。また、特開昭
６１−２３４７９５には芳香族アミノ酸デカルボキシラ
ーゼを用いる芳香族アミノ酸の定量方法が記載されてい
る。しかしながら、これらの方法もＬ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素を用いる本発明の方法とは異る。

特開昭５９−１９８９７２には、ブレビバクテリウム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の生産するＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素をＬ−フェニルアラニン及
び■、−チロシンの定量、並びにフェニルピルビン酸及
び４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の定ｆｆｉに用い
ることが示唆されている。しかしながら、この文献には
いかにして反応平衡を破って正確な定量を行うかについ
てはなんら示唆されていない。

また、スポロサルシナ属およびバシルス属細菌の生産し
うる新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が、それら
の化合物の定量に用いられることは全く示唆されていな
い。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
用いるＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、並びに
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸の新規な定量法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素はＬ−フェニルアラニ
ンに作用してこれをフェニルピルビン酸に酸化する反応
及びこの逆反応を触媒する酵素であって、この反応を利
用することによりＬ−フェニルアラニン及びそれと類似
の構造を有するＬ−チロシン、並びにこれらに対応する
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸を測定することができる可能性がある。特に本発明
者はすでにスポロサルシナ属又はハシルス属細菌が生産
するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法
、並びに該酵素を使用するし一アミノ酸の製造方法の発
明を完成しており（特願昭６０−０８０２９３、特願昭
６０−１２７１１８、及び特願昭６Ｏ−２７２４９４）
　、これらの酵素の基質特異性を酸化的脱アミノ化につ
いて測定した場合、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロ
シン以外のＬ−アミノ酸には極めて僅かしか反応しない
。

従って、この酵素を用いることによって、極めて高い特
異性をもってＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、
並びにフェニルピルビンＭ及ヒ４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸を定量することが可能である。

しかしながら、他方において、この反応はＬ−アミノ酸
とα−ケト酸との比率が所定の値に達した所で平衡にな
るため、正確な定量のためにはこの平衡を破っていずれ
かの方向に実質上完全に反応を進行せしめる必要がある
。本発明者は種々検討の結果、このための有効な手段を
見出し、本発明を完成した。

従って、本発明は、フェニルアラニン脱水素酵素、水素
受容体、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含む
被検試料、及びα−ケト酸を除去する物質を含んで成る
反応系において還元された水素受容体の増加、α−ケト
酸に由来する物質の増加又はアンモニウムイオンの増加
を測定することを特徴とするＬ−フェニルアラニン又は
■５−ヂロシンの１方法；並びにフェニルアラニン脱水
素酵素、水素供与体、フェニルピルビン酸又は４−ヒド
ロキシフェニルピルビン酸を含む被検試料、及びフェニ
ルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に
対して２５０倍モルＹ以上のアンモニウムイオンを含ん
で成る反応系において水素供与体の減少を測定すること
を特徴とするフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフ
ェニルピルビン酸の定量方法を提供するものである。

Ｃ具体的な説明〕 Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を利用したＬ−フェニ
ルアラニンの測定方法は、本酵素が触媒する以下の可逆
反応を利用している。

■、−アミノ酸＋水素受容体＋８２０−ヨα−ケト酸＋
Ｊス元された水素受容体＋ＮＨ，”式中、■７−アミノ
酸は、Ｌ−フェニルアラニンあるいはＩ７−チロシンで
あり、α−ケト酸は、フェニルピルビン酸あるいは４−
ヒドロキシフェニルピルビン酸である。本発明はＬ−フ
ェニルアラニン又はＬ−チロシンを含有する分析対象物
に、水素受容体を加え、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を作用させ、生成物である還元された水素受容体の増
加、α−ケト酸に由来する物質の増加、又はアンモニウ
ムイオンの増加を測定することにより、Ｌ−フェニルア
ラニン又はＬ−チロシンの微量分析を可能にするもので
ある。又、フェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸を含有する分析対象物に、水素供与体を
加え、Ｌ〜フェニルアラニン脱水素酵素を作用させ、水
素供与体の減少を定量することにより、フェニルピルビ
ン酸あるいは４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の微量
分析を可能にするものである。

本発明のＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの定量
法についてより具体的に説明する。本発明におけるＩ７
−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの定量はＬ−フェ
ニルアラニン脱水素ｆγ素と水素受容体を適当な溶媒中
に共存させ、適当な温度で、Ｌ−フェニルアラニン又は
Ｌ−チロシンと反応させる。反応は、１７−フェニルア
ラニン脱水素酵素が安定に活性を示す条件をｉｘべばよ
く、溶媒として、水又は、好ましくは、リン酸、トリス
−Ｉｔ（１、グリシン−ＮａＯｌｌ、グリシン−ＭＣＩ
−ＫＯＨｌＢＴＣＩＮＥ−ＮａＯＩＩ、ビロリン酸ナト
リウム−ＩＩｃ　ｆｆ、ジェタノールアミン−〇（Ｊ！
、はう酸、炭酸水素ナトリウム等から選ばれる緩衝液を
用いることができる。

この反応において、分析対象物中のし一アミノ酸を実質
上すべて反応せしめる必要があり、このためには生成す
るα−ケト酸を反応の系外に除去する必要がある。本発
明においては、この口約のためにアミン類又はα−ケト
酸の分解に関与する酵素を添加する。アミン類としては
例えばヒドラジン、フェニルヒドラジン又はその誘導体
、セミカルバジド又はその誘導体、ヒドロキシルアミン
又はそのｍＲ一体等を使用することができ、ヒドラジン
としてはヒドラジン・−水和物試薬を用いることができ
る。α−ケト酸の分解に関与する酵素としては例えばフ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素、又はフェニルピルビン酸
脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素との組合わせを使用
することができる。

反応系中のアミン類の量は、α−ケト酸１モルに対して
１００〜１０，０００モル程度とするのが好ましい。

反応系中のフェニルピルビン酸脱炭酸酵素の量は、生成
したフェニルピルビン酸が完全に脱炭酸される量であり
、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素１ユニツトに対して
０．２〜１０ユニツトとするのが好ましい。アルデヒド
脱水素酵素を併用する場合、この酵素の量は、フェニル
ピルビン酸脱炭酸酵素により生成したフェニルアセトア
ルデヒドを完全に分解することができる量であり、フェ
ニルピルビン酸脱炭酸酵素１ユニツトに対して約Ｏ１７
〜／ρユニットとするのが好ましい。

反応系のｐＨとしては、反応系にアミン類を添加する場
合にはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の反応ｐｌ＋を
使用し、通常ｐＨ７〜１２、より好ましくはｐＨ８〜１
１である。反応系にα−ケト酸の分解に関与する酵素を
使用する場合には、反応系のｐＨとしてＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の反応ｐＨ及びα−ケト酸の分解に関
与する酵素の反応ｐＨの両者に共通する範囲のｐＨを使
用する必要があり、例えばα−ケト酸を分解する酵素と
してフェニルピルビン酸脱炭酸素酵素を使用する場合に
は、反応系のｐＨは通常７〜１０、さらに好ましくは８
〜９である。

水素受容体としては、ＮＡＤ＋や３−アセチルピリジン
アデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジンＮＡＤ
’″）を用いることが出来る。

以下、１ｍｌの反応液を用いる時の分析条件について述
べる。定量するＬ−フェニルアラニンあるいは、Ｌ−チ
ロシンの量は、通常０〜０．２μｍｏｌの範囲である。

Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の量は、加えたＬ−フ
ェニルアラニンあるいは、Ｌ−チロシンが完全に変換さ
れる酵素量であり、通常０．１〜１０単位加えればよい
。α−ケト酸を除去する物質としてヒドラジン・１水和
物を使用する場合その量は１０〜５００μｍｏｌの範囲
である。

反応温度は、使用する酵素が安定に活性を示す温度であ
り、２０〜３７℃が好ましい。反応時間は、反応が完結
するまでとし、通常０．１分間〜１０時間である。なお
、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の酵素活性単位の定
義は、特願昭６０−０８０２９３に示したとおりである
が、ｐＨ０，５においてＬ−フェニルアラニンを基質と
して１分間にｌμｎ＋ｏｌのＮＡＤＨを生成する酵素量
とする。フェニルピルビン酸脱炭酸酵素、又はこれとア
ルデヒド脱水素酵素との組合わせを用いる場合には、通
常、前者を０．１〜ｌＯユニノ）　、ｉ者ヲ０．０１−
１ユニツト（フェニルアセトアルデヒドを基質とした場
合）を使用する。

反応の進行は、水素受容体の増加、α−ケト酸に由来す
る物質の増加、又はアンモニウムイオンの増加により測
定する。水素受容体としてＮＡＤ”を使用する場合には
その還元形であるＮＡＤＨの増加を３４０１における吸
収により測定することができ、水素受容体として３−ア
セチルピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチル
ピリジンＮＡＤ”　）を使用する場合にはその還元形で
ある３−アセチルピリジンＮＡＤＨの増加を３６５１１
における吸収により測定することができる。また、蛍光
法、ジアホラーゼと２，６−シクロロフエノールインド
フエノールとの組合せ、又はフェナジンメトサルフェー
トとニトロブルーテトラゾリウムとの組合わせ等により
可視部の吸収として測定することもできる。α−ケト酸
に由来する物質は、Ｌ−フェニルアラニン等から生じた
フェニルピルビン酸等と２゜４−ジニトロフェニルヒド
ラジンや塩酸３−メチル−２−ベンゾチアプリノンヒド
ラゾン等との反応生成物であり、これらの生成物はその
色度により測定することができる〔生化学実験法講座１
１゜２３５頁（１９７６）　）。２．４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンや塩酸３−メチル−２−ペンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン等は、反応系に添加することによりα−
ケト酸を除去する物質として機能する。アンモニウムイ
オンは、アンモニア電極、インドフェノール法、ネスラ
ー法、酵素法〔生体成分の酵素的分析法１０８頁（１９
８５）　）等により測定することができる。

フェニルピルビン酸脱炭酸酵素によりフェニルピルビン
酸から生成したフェニルアセトアルデヒドを、ＮＡＤ”
とアルデヒド脱水素酵素を共存させることによりさらに
分解する場合、フェニルアセトアルデヒドと等量のＮＡ
Ｄ”が還元されてＮＡＤＨが生成するので、Ｌ−フェニ
ルアラニン１当量より合計２当量のＮＡＤＩ＋が生成す
ることとなり、Ｎ　Ａ　Ｄ　１１の量を測定する際に感
度が２倍になる。

一方、フェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の触媒
する上述の反応の逆反応を行なわせしめることにより定
量することが出来る。すなわち、フェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸は、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素の存在下に、水素供与体及びアンモ
ニウムイオンと反応してそれぞれに対応するし一アミノ
酸に変換される。

この方法における反応条件は基本的にはＬ−フェニルア
ラニン又はＬ−チロシンを定量するための曲記の条件と
同一であるが、α−ケト酸を分解する物質を反応系に添
加しないことは言うまでもない。また、この方法におい
ては分析対象物中のフェニルピルビン酸又は４−ヒドロ
キシフェニルピルビン酸を実質上すべて反応せしめる必
要があり、本発明においてはこのための手段として反応
系に大過剰のアンモニウムイオンを加える。このアンモ
ニウムイオンの量は３、フェニルピルビン酸又は４−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸の型に対して約２５０倍モ
ル量以上であり、好ましくは１０００倍モル量以上であ
る。すなわち、本発明者等は、必要なアンモニウムイオ
ンの量を決定するために、本発明の実施例５〜８に示す
ものと同様な反応系において、アンモニウムイオン温度
を種々変えて実験を行った。この結果反応系１ｒ＠１中
のアンモニウムイオン量が２００μｍｏ１　（２００ｍ
Ｍｇｉ度）であれば２〜３分間で反応が実質的に１００
％完了し、アンモニウムイオン量が１００μｍｏｌ　（
１００ｍＭ濃度）であれば約１０分間後に反応が実質的
に１００％完了し、アンモニウムイオン量が５０μｍｏ
ｌ（５０ｍＭ？二度）であれば数１０分後に反応が完了
するが、アンモニウムイオン量をさらに減少すれば基質
であるフェニルピルビン酸が完全には転換されず、定量
分析が困難となることを見出した。

使用した系においてフェニルピルビン酸の定量限界が約
０．２μｍｏｌであることから、分析対象中のα−ケト
酸の量に対するアンモニウムイオンの必要量はおよそ２
５０倍モル量であると推定され、短時間で定量を完了す
るためには１０００倍モル量以上であることが望ましい
。実際の反応系においては分析対象中のα−ケト酸の濃
度は未知であるから、反応系中のアンモニウムイオンの
４度を１００ｍＭ以上としておくのが好ましい。なお、
上記反応系においてｌ　Ｑ　ｍａ＋ｏｌのアンモニウム
イオンを加えても定量結果に問題がなかった。このアン
モニウムイオンはアンモニウム塩、例えば塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の形で添
加される。

水素供与体として例えばＮＡＤＨ又は還元型３−アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリ
ジンＮＡＤＩＩ）を用いることができる。

本発明のフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニ
ルピルビン酸の定量法についてより具体的に説明する。

本発明におけるフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸の定量はＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素と水素供与体、及びアンモニウムイオンを適当な
溶媒中に共存させ、適当な温度でフェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸と反応させればよ
い。

以下、１ｍｌの反応液を用いる時の分析条件について述
べる。反応はＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が安定に
活性を示す条件を選べばよいが、溶媒として、水、好ま
しくは、リン酸、トリス−Ｈ（Ｊ、グリシン−ＮａＯＨ
、グリシン−にＣＩ　−ＫＯＨ、ＢＩＣＩＮＥＮ　ａ　
ＯＨ％　ピロリン酸ナトリウム−ＨＣＮ　、ジエタノ−
ルアミノ−〇Ｃｊ！　、はう酸、炭酸水素ナトリウム等
から選ばれる緩衝液を用いることができる。反応ｐＨは
、通常ｐＨ７〜１１、より好ましくは、ｐＨ８−１０，
５である。定量するフェニルピルビン酸又は４−ヒドロ
キシフェニルピルビン酸の量は、通常０〜０．２μｍｏ
ｌの範囲である。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の量
は、加えたフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸が完全に変換される酵素量であり、通常
０．１〜ｌＯ単位加えればよい。アンモニウムイオンの
量は、通常１００μｍｏｌ　〜Ｉ　ｎ＋ｍｏｌ　％より
好ましくは、２００〜４００μｍｏｌの範囲である。反
応温度は、使用する酵素が安定に活性を示す温度であり
、２０〜３７℃が好ましい。反応時間は、反応が完結す
るまでとし、通常０．１分間〜ｌＯ時間である。

反応の進行の測定は、水素供与体の減少を、例えば前記
のようにして測定することができる。

以上述べたのは、反応が完結した後に生成物を測定する
エンドポイントアッセイによる定量法であるが、反応速
度を測定するレイトアッセイによる測定をおこなっても
よい。この場合は、反応組成は上記の通りであり、反応
時間は、通常５分以内でよく、反応速度を測定する。こ
の反応速度の測定は、例えば、反応経過中２以上の時間
で反応の程度を測定するか、又は反応の進行を連続的に
記録することにより行うことができる。

本発明においては、種々のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素を使用することができ、例えばスポロサルシナ属又
はバシルス属に属する細菌の生産するＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を使用することができる。

スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエ（Ｓ　ｏｒｏｓａｒｃｉｎａ　ｕｒｅａ
ｅ）を挙げることが出来る。具体的な菌株として、スポ
ロサルシナ・ウレアエＩＰ０１２６９Ｂ　、スポロサル
シナ・ウレアエＩＦＯ１２６９９（ＡＴＣＣ６４７３）
、及び本発明者が分離したスポロサルシナ・ウレアエ５
ＣＲＣ−ＲＯ４を挙げることが出来る。前記の保存菌は
それぞれ前記寄託番号のもとにｒＦＱ又は、ＡＴＣＣか
ら自由に入手することができ、またスポロサルシナ・ウ
レアエ５ＣＲＣ−１７０４は、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第１０１２号 （ＦＥＲＭ　ＢＰ−１０１２）として寄託されている。

その菌学的性質は、特願昭６０−０８０２９３に記され
ている。

ハシルスに属する微生物としては、例えば、バシルス・
ハディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ）ＩＡＭ
　１１０５９（ＡＴＣＣ１４５７４）微工研菌寄第８５
２９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８５２９）　、バシルス　ｓｐ
、　５ＣＲＣ−Ｒ５３ｂ、バシルスｓｐ、　５ＣＲＣ−
Ｒ７９ａ　　微工研条寄第１０１３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−１０１３）　、バシルスｓｐ、　５ＣＲＣ−１０１Ａ
、バシルスｓｐ。

５ＣＲＣ−１１４０微工研条寄第１０１１号（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１０１１）、バシルス・スフエリカス（ｈ虹旦
■」畦憇亘匹ＵＩＡＭ　１２２８　、及びバシルス・チ
アミノリティカスＩＡＭ　１０３４を挙げることができ
る。バシルス・バディウスＩＡＭ　１１０５９は、前記
寄託番号のもとにＪＦＣＣや＾ＴＣＣカタログに記載さ
れており、自由に人手することができる。その他のバシ
ルス属細菌の菌学的性質は、特願昭６０−０８０２９３
に記されている。

前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当
っては前記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェ
ニルアラニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニ
ルアラニンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株
の性質等により異なるがおよそ０．０１−１ｗ／Ｖ％で
ある。培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いても
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振盪培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下で
培養を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜４
５℃である。ｐＨは６〜１１、好ましくは７〜１０の範
囲である。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べ
ば良いが好ましくは６〜４８時間である。次に得られた
培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が
採取されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さら
にこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを
加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー等を行ない、さらに硫酸アンモニ
ウム等の塩やポリエチレングリコール等の添加による結
晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵素標品を華離
することが出来る。

フェニルピルビン酸脱炭酸酵素は、アシネトバクタ−（
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌から、超
音波処理、プロタミン硫酸処理、硫安分画、ブチルトヨ
パールカラム、ヒドロキシアパタイトカラム、セファデ
ックスＧ−２００カラムなどの方法により精製して用い
ることができる。具体的な菌株としては、アシネトバク
タ−・カルコアセティカス（八ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｃａｌｃｏａｃｅＬｉｃｕｓ）ＩＦＯ１２５５２をあ
げることができる。

アルデヒド脱水素酵素は市販品を用いてもよく、またア
シネトバクタ−属細菌から部分精製したフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素中にはこの酵素活性が混在しているので
、これをそのまま用いてもよい。　次に実施例により、
この発明をさらに具体的に説明する。

夫施拠土・ グリシン−にＣ１−に叶緩衝液（ｐＨｌｏ、４）　１０
０ｐ　ｍｏ　ｌ　、Ｎ　Ａ　Ｄ　”２．５　ｐ　１１１
０１　％ヒドラジン・ｌＨ２Ｏ２００μｍｏｌ　、　ｒ
−−フェニルアラニン脱水素酵素（スポロサルシナ・ウ
レアエ５ＣＲＣ−ＲＯ４よりの均一精製酵素）０．６単
位、及びＬ−フェニルアラニン０．０２０〜０．１００
μｍｏｌを含む１、Ｏｍｌの反応液を２５℃で１０分間
反応し、３４０ｎｍにおける吸光度変化を読み取った。

前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
除いたものを対照とした。この結果を第１表に示す。こ
れから検量線を作成したところ、第１図Ａに示す直線が
得られた。このように、試料中に加えたＬ−フェニルア
ラニン量と反応後に測定されるＮＡＤＨの生成量が一致
した。

０．０２００　　　　　　　　０．０１９５　　、　　
　　　９７．５０．０４００　　　　　　　　０．０４
０４　　　　　　１０１０．０６００　　　　　　　　
０．０５６９　　　　　　９４．８０．０８００　　　
　　　　　０．０８０３　　　　　　１０００、１００
　　　　　　　　　０．０９９４　　　　　　９９．４
去意桝叢− グリシン”ＭＣＩ　−ＫＯＨ緩特賞夜（ｐＨ１０，４）
　１００μｍ１１０１　％ＮＡＤ”　２．５　μｍｏｌ
　、ヒドラジン・目１，０２００μｍｏｌ　、　Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・スフエリカス５
ＣＲＣＲ７９ａよりの均一精製酵素）０．６単位、及び
Ｌ−フェニルアラニン０．０２〜０、１００　ｐ　ｍｏ
ｌを含む１．Ｏｍｌの反応液を２５℃で１０分間反応し
、３４０ｎｍにおける吸光度変化を読み取った。前記反
応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いた
ものを対照とした。この結果を第２表に示す。これから
検量線を作成したところ、第１図Ｂに示す直線が得られ
た。このように、試料中に加えたＬ−フェニルアラニン
挺と反応後に測定されるＮＡＤＨの生成量が一致した。

０．０２００　　　　　　　　０．０２０１　　　　　
　１０１０、０４００　　　　　　　　０．０３９７　
　　　　　９９．２０．０６００　　　　　　　　０．
０６０９　　　　　　１０２０．０８００　　　　　　
　　０，０８１４　　　　　　１０２０、１００　　　
　　　　　　０．０９８６　　　　　　９８．６１隻炭
１− グリシン−ＫＣＩ　−ＫＯＨＩＩ衝液（ｐＨ１０，４）
　１００　ｐ　ｍｏｌ、ＮＡＤ”　２．５　μｍｏｌ　
、ヒドラジン−Ｉ　Ｈ２Ｏ２００ｐｍｏｌ　、　Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・バディウスＩＡ
Ｍ　１１０５９よりの均一精製酵素）０、５　、＃位、
及びＩ７−フェニルアラニン０．０２０〜０、１００　
ｕ　ｍｏｌを含む１．０ｍｌの反応液を２５℃で５分間
反応し、３４０ｎｍにおける吸光度変化を読み取った。

前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
除いたものを対照とした。この結果を第３表に示す。こ
れから検量線を作成したところ、第１図Ｃに示す直線が
得られた。このように、試料中に加えた■７〜フェニル
アラニン量と反応後に測定されるＮＡＤＨの生成量が一
致した。

０．０２００　　　　　　　　０．０２０２　　　　　
　１０１０．０４００　　　　　　　　０．０３９３　
　　　　　９８．３０．０６００　　　　　　　　０．
０６００　　　　　　１０００．０８００　　　　　　
　　　Ｑ、　０７９７　　　　　　９９．７０、１００
　　　　　　　　　０．１０１　　　　　　１０１実Ｊ
１例」２− グリシン−ＫＣＩ　−ＫＯＪＩ　１１衝）夜（ｐＨ１０
，４）　１００ｐＮＡＤ”　２．５　ｐｍｏｌ　、ヒド
ラジン−　１　１１ＺＯ　２００μｍｏｌ　、Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素（バシルス・スフエリカス５Ｃ
ＲＣ　−　Ｒ７９ａよりの均−精’Ｗｆｉｌ素）２単位
、及びＬ−チｏ　シン０．０２０　〜０．１００　ｐｍ
ｏｌを含む１．０ｍｌの反応液を２５°Ｃで１０分間反
応し、３４０ｎｍにおける吸光度変化を読み取った。

前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
除いたものを対照とした。この結果を第４表に示す。こ
れから検量線を作成したところ、第１図りに示す直線が
得られた。このように、試料中に加えたし一チロシン量
と反応後に測定されるＮＡＤｌｌの生成量が一致した。

以下余白 茅−二し一表 ０、０２００　　　　　　　　　　　　　　０．０１９
９　　　　　　　　　　９９．３０、０４００　　　　
　　　　　　　　　　０．０３８４　　　　　　　　　
　　９６．１０、０６００　　　　　　　　　　　　　
　０．０５６４　　　　　　　　　　　９４．ＱＯ．０
８００　　　　　　　　　　　　　　０．０８０６　　
　　　　　　　　１０１０、１００　　　　　　　　　
　　　　　０．１０７　　　　　　　　　　　１０７天
淘Ｊｉｍ グリシン−ＫＣＩ　−に０１（緩衝液（ｐＨ１０．４）
　１００１００ｕ　　、　　ＮＡＤ）Ｉ　　Ｏ．２　　
、ｌＪ＋ｗｏｌ　　、　ＮｔｌａＣｌ　　２００　　ｐ
ｍｏｌ　　、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（スポロ
サルシナ・ウレアエ５ＣＲＣ　−　ＲＯ４よりの均一精
製酵素）０、１単位、及びフェニルピルビン酸０．０１
５０〜０、０９００　ｐ　ｍｏｌを含む１．０ｍｌの反
応液を２５℃で５分間反応し、３４０ｎｍにおける吸光
度変化を読み取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素を除いたものを対照とした。この結
果を第５表に示す。これから検量線を作成したところ、
第１図Ｅに示す直線が得られた。このように、試料中に
加えたフェニルピルビン酸と反応後ニ測定されるＮＡＤ
ｌｌの減少量が一致した。

０、０１５０　　　　　　　　　　０．０１６７　　　
　　　　１１１０、０３００　　　　　　　　　　０．
０３０７　　　　　　　１０２０、０４５０　　　　　
　　　　　０．０４６９　　　　　　　１０４０、０６
００　　　　　　　　　０．０５９４　　　　　　　　
９９．００、０７５０　　　　　　　　　　０．０８４
５　　　　　　　１１３０、０９００　　　　　　　　
　　０．０９０９　　　　　　　１０１尖施汎ｉ− グリシ７−ＫＣＩ　−にＯｌｌ　緩神ｊ？夜（ｐＨ１０
．４）　１００μｍｏｆ　、　ＮＡＤＨ　０．　２　ｐ
ｍｏｌ　、Ｎ１１４ＣＩ　２００　ｐｍｏｌ　、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・フェリカス５Ｃ
ＲＣ　−　Ｒ７９ａよりの均一精製酵素）Ｏ．ｉ単位、
及びフェニルピルビン酸０．０１５０　〜０．０９００
　、ｌｊ　ｍｏｌを含む１．Ｏｎ＋ｌの反応液を２５℃
で５分間反応し、３４０ｎ−における吸光度変化を読み
取った。前記反応組成から、１．−フェニルアラニン脱
水素酵素を除いたものを対照とした。この結果を第６表
に示す。これから検量線を作成したところ、第１図Ｆに
示す直線が得られた。このように、試料中に加えたフェ
ニルピルビン酸と反応後に測定されるＮＡｒｏｌ＋の残
少￥が一致した。

０．０１５０　　　　　　　　０．０＋６７　　　　　
　１７１０．０３００　　　　　　　　０．０３０７　
　　　　　１０２０、０４５０　　　　　　　　０．０
４Ｇ９　　　　　　１０４０．０６００　　　　　　　
　０．０５９４　　　　　　９９．００．０７５０　　
　　　　　　０．０８４５　　　　　　１１３０．０９
００　　　　　　　　０．０９０９　　　　　　１０１
実−！１例ｊ− グリンンーＭＣＩ　−ＫＯＩＩ　＄１衝液（ｐｌｔｌｏ
、４）　１００μｍｏｌ　、ＮＡＤＩＩ　Ｏ，２、ｃｒ
ｍｏｌ　、Ｎｌｌ、ＣＩ　２００　／／１１１０１、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・バディウス
ＪＡＭ　１１０５９よりの均−情調酵素）０．１単位、
及びフェニルピルビン酸０．０２００〜０．１００　ｕ
　ｍｏｌを含む１．０ｍｌの反応液を２５℃で５分間反
応し、３４０ｎｍにおける吸光度変化を読み取った。前
記反応組成から、し−フェニルアラニン脱水素酵素を除
いたものを対照とした。この結果を第７表に示す。これ
から検量線を作成したところ、第１図Ｇに示す直線が得
られた。このように、試料中に加えたフェニルピルビン
酸と反応後に測定されるＮＡＤｌｌの減少量が一致した
。

０．０２００　　　　　　　　　０．０２０５　　　　
　　１０３０．０４００　　　　　　　　　０．０４１
３　　　　　　１０３０．０６００　　　　　　　　　
０．０６１１　　　　　　１０２０．０８００　　　　
　　　　　０．０８１６　　　　　　１０２０、１００
　　　　　　　　　０．１０１　　　　　　　１０１ス
１」ＬＬ＝ グリシン−ＭＣＩ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，４）　１
００μｍｏｌ　　、　　ＮＡＤＩＩ　　Ｏ，２１ｗｏｌ
　　、ＮＨ４Ｃｌ　　２００　　μｍｏｌ　　。

Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・スフエリ
カス５ＣＲＣ−Ｒ７９ａよりの均一精製酵素）１単位、
及び４−ヒドロキシフェニルピルビン酸０．０２０〜０
．１００　、ｃｒｍｏｌを含む１．０ｍｌの反応液を２
５℃で５分間反応し、３４０ｎｍにおける吸光度変化を
読み取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を除いたものを対照とした。この結果を第８
表に示す。これから検量線を作成したところ、第１図Ｈ
に示す直線が得られた。このように、試料中に加えた４
−ヒドロキシフェニルピルビン酸と反応後に測定される
ＮＡＤＨの減少量が一致した。

以下余白 芽−」Ｌ−表 ０．０４００　　　　　　　　　　　０．０３９０　　
　　　　　　９７．５０．０６００　　　　　　　　　
　　０．０５７４　　　　　　　　　９５．６０．０８
００　　　　　　　　　　　　０．０７７５　　　　　
　　　　９６．９０、１００　　　　　　　　　　　　
０．０９５５　　　　　　　　　９５．５スＪ［ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）　１００　μｍｏ
ｌ　。

ＮＡＤ”　２．５　μｍｏｌ　％チアミンピロリン酸０
．２　ｐａＡｏｌ、塩化マグネシウム２μｍｏｌ　、［
、−フェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・バディウ
スＩＡＭ１１０５９よりの均一精製酵素）０．５単位、
フェニルピルビン酸脱炭酸酵素（アシネトバクタ−・カ
ルコアセティカスＩＦＯ１２５５２よりの部分精製酵素
、アルデヒド脱水素酵素活性を含む）０．２単位（０，
０ａ単位）、及びＬ−フェニルアラニンｏ、ｏ５μｍｏ
ｌを含む１．０ｍｌの反応液を２５℃で１５分間反応し
、３４０ｎＩｌにおけるＩｊ＋）光度変化を読み取った
。

１１；１記反応（１１成から、■７−）Ｔ、ニルアラニ
ン脱水素酵素をド、ｆいたものをχＩＩ、ｒ（とじた。

この結果を表９に示す。このように、ム（ｕ中の１．−
フェニルアラニン〒と反応後にＪす定されるＮＡＤＩ＋
の増加購の半Ｖが−ＩＩた。

０．０５００　　　０．０９４９　　　　　　０．０４
７５　　９５ブンｂ１例−１−Ｏ− グリソンーＭＣＩ−ＫＯ＋１緩衝液（ｐＨ１０，４）　
１００１００１ｚ　、Ｎ　Ａ　Ｉ）２．５　、ｕｍｏｌ
　　ｌ＝−フェールアラニン脱水素酵素（ハソルス・フ
ェリカス５ＣＲＣ−Ｒ７９ａよりの部分精製酵素）０．
１単位、及び［２−フェニルアラニン０．０１０〜０．
０５０）１ｍ０１　を含む１．Ｏｍｌの反応液を２５°
Ｃで反応し、３４０ｎｍにおける吸光度の経時変化を連
続的に記録した。前記反応組成から、■、−フェニルア
ラニン脱水素酵素を除いたものを対照とした。その結果
、反応速度は反応開始１分後までほぼ一定であった。反
応開始から１分後までの吸光度変化を第１０表に示す。

これから検量線を作成したところ、図９に示す直線が得
られた。このことから、本発明はレート法によっても実
施できることが明らかである。

０．０１０　　　　　　　０．００５６０．０２０　　
　　　　　０．０１２００．０３０　　　　　　　０．
０１７９０．０４０　　　　　　　０．０２３８０．０
５０　　　　　　　０．０２８８

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の検量線の例を示し、この図中Ａ
は、実施例１において得られた、５ＣＲＣ−ＲＯＡ株由
来Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ
−フェニルアラニン定量用検量線であり； Ｂは、実施例２において得られた、５ＣＲＣ−７９ａ株
山来Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合の
Ｌ−フェニルアラニン定量用検量線であり； Ｃは、実施例３において得られた、ＩＡＭ　１１０５９
株由来の■、−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した
場合のＬ−フェニルアラニン定量用検量線であり； Ｄは、実施例４において得られた、５ＣＲＣ−ＲＯ４株
由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合
のし一チロシン定量用検量線であり；Ｅは、実施例５に
おいて得られた、５ＣＲＣ−ＲＯ４株由来の■７−フェ
ニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェニルピル
ビン酸定量用検量線であり； Ｆは、実施例６において得られた、５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ
株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場
合のフェニルピルビン酸定量用検量線であり； Ｇは、実施例７において得られた、ＩＡＭ　１１０５９
株由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場
合のフェニルピルビン酸定量用検量線であり；そして Ｈは、実施例８において得られた、５ＣＲＣ−ＲＯ４株
由来の１．−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場
合の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸定量用検看線で
ある。 第２図は、本発明のレート法における検量図の一例を示
すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フェニルアラニン脱水素酵素、水素受容体、Ｌ−フ
   ェニルアラニン又はＬ−チロシンを含む被検試料、及び
   α−ケト酸を除去する物質を含んで成る反応系において
   還元された水素受容体の増加、α−ケト酸に由来する物
   質の増加又はアンモニウムイオンの増加を測定すること
   を特徴とするＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの
   定量方法。 ２、前記フェニルアラニン脱水素酵素がバシルス（Ｂａ
   ｃｉｌｌｕｓ）属細菌又はスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏ
   ｓａｒｃｉｎａ）属細菌により生産されるＬ−フェニル
   アラニン脱水素酵素である特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ３、前記水素受容体がＮＡＤ＾＋又は３−アセチルピリ
   ジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジンＮ
   ＡＤ＾＋）である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、前記α−ケト酸を除去する物質がアミン類又はα−
   ケト酸の分解に関与する酵素である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ５、前記アミン類がヒドラジン、フェニルヒドラジンも
   しくはその誘導体、セミカルバジドもしくはその誘導体
   、又はヒドロキシルアミンもしくはその誘導体である特
   許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記α−ケト酸の分解に関与する酵素がフェニルピ
   ルビン酸脱炭酸酵素、又はフェニルピルビン酸脱炭酸酵
   素とアルデヒド脱水素酵素との組み合わせである特許請
   求の範囲第４項に記載の方法。 ７、エンドポイント法又はレート法で行う特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ８、フェニルアラニン脱水素酵素、水素供与体、フェニ
   ルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸を
   含む被検試料、及びフェニルピルビン酸又は４−ヒドロ
   キシフェニルピルビン酸に対して２５０倍モル量以上の
   アンモニウムイオンを含んで成る反応系において水素供
   与体の減少を測定することを特徴とするフェニルピルビ
   ン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の定量方法
   。 ９、前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素がバシルス（
   Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌又はスポロサルシナ（Ｓｐｏ
   ｒｏｓａｒｕｃｉｎａ）属細菌により生産されるＬ−フ
   ェニルアラニン脱水素酵素である特許請求の範囲第８項
   に記載の方法。 １０、前記水素供与体がＮＡＤＨ又は還元型アセチルピ
   リジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジン
   ＮＡＤＨ）である特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １１、エンドポイント法又はレート法で行う特許請求の
   範囲第８項に記載の方法。