JPH066075B2 - Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 - Google Patents
Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法Info
- Publication number
- JPH066075B2 JPH066075B2 JP27544886A JP27544886A JPH066075B2 JP H066075 B2 JPH066075 B2 JP H066075B2 JP 27544886 A JP27544886 A JP 27544886A JP 27544886 A JP27544886 A JP 27544886A JP H066075 B2 JPH066075 B2 JP H066075B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- phenylalanine
- reaction
- dehydrogenase
- phenylalanine dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、並び
にフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピル
ビン酸の定量法に関する。Ｌ−フェニルアラニンの定量
は、特にアミノ酸代謝異常症であるフェニルケトン尿症
の早期発見のための新生児マススクリーニングにおいて
広く行なわれている。また、フェニルピルビン酸及び４
−ヒドロキシフェニルピルビン酸の定量を行なうことに
より、それぞれフェニルケトン尿症や、チロシン血症等
の診断及び治療に有用な情報が得られると期待される。
にフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピル
ビン酸の定量法に関する。Ｌ−フェニルアラニンの定量
は、特にアミノ酸代謝異常症であるフェニルケトン尿症
の早期発見のための新生児マススクリーニングにおいて
広く行なわれている。また、フェニルピルビン酸及び４
−ヒドロキシフェニルピルビン酸の定量を行なうことに
より、それぞれフェニルケトン尿症や、チロシン血症等
の診断及び治療に有用な情報が得られると期待される。
従来、Ｌ−フェニルアラニンやＬ−チロシンを酵素を用
いて定量分析するには、フェニルアラニンアンモニアリ
アーゼを用いる方法〔バーグマイヤーら、Methods of E
nzymatic Analysis,3rded.8,405(1985)〕、Ｌ−アミノ
酸デカルボキシラーゼを用いる方法〔アデンフレンド、
Journal of Biological Chemistry,２０３，９５３（１
９５３）〕、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる方法
〔ギルバート、Handbook of Enzymatic Methods of Ana
lysis,p217(1976)〕、フェニルアラニンオキシダーゼを
用いる方法〔コヤマ、Clinica Chimica Acta136,131(19
84)〕等がある。しかしながら、これらの方法は、Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を用いる方法ではない。
いて定量分析するには、フェニルアラニンアンモニアリ
アーゼを用いる方法〔バーグマイヤーら、Methods of E
nzymatic Analysis,3rded.8,405(1985)〕、Ｌ−アミノ
酸デカルボキシラーゼを用いる方法〔アデンフレンド、
Journal of Biological Chemistry,２０３，９５３（１
９５３）〕、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを用いる方法
〔ギルバート、Handbook of Enzymatic Methods of Ana
lysis,p217(1976)〕、フェニルアラニンオキシダーゼを
用いる方法〔コヤマ、Clinica Chimica Acta136,131(19
84)〕等がある。しかしながら、これらの方法は、Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を用いる方法ではない。
特開昭57-146597及びコヤマ、Clinica Chimica Acta13
6,131(1984)には、フェニルアラニンオキシダーゼを用
いるＬ−フェニルアラニンの定量法が記載されている。
また、特開昭61-234795には芳香族アミノ酸デカルボキ
シラーゼを用いる芳香族アミノ酸の定量方法が記載され
ている。しかしながら、これらの方法もＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いる本発明の方法とは異る。
6,131(1984)には、フェニルアラニンオキシダーゼを用
いるＬ−フェニルアラニンの定量法が記載されている。
また、特開昭61-234795には芳香族アミノ酸デカルボキ
シラーゼを用いる芳香族アミノ酸の定量方法が記載され
ている。しかしながら、これらの方法もＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いる本発明の方法とは異る。
特開昭59-198972には、ブレビバクテリウム(Brevibacte
rium)属細菌の生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素をＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンの定量、並
びにフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸の定量に用いることが示唆されている。しかし
ながら、この文献にはいかにして反応平衡を破って正確
な定量を行うかについてはなんら示唆されていない。ま
た、スポロサルシナ属およびバシルス属細菌の生産しう
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が、それらの
化合物の定量に用いられることは全く示唆されていな
い。
rium)属細菌の生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素をＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンの定量、並
びにフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸の定量に用いることが示唆されている。しかし
ながら、この文献にはいかにして反応平衡を破って正確
な定量を行うかについてはなんら示唆されていない。ま
た、スポロサルシナ属およびバシルス属細菌の生産しう
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が、それらの
化合物の定量に用いられることは全く示唆されていな
い。
従って、本発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
用いるＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、並びに
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸の新規な定量法を提供しようとするものである。
用いるＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、並びに
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸の新規な定量法を提供しようとするものである。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素はＬ−フェニルアラニ
ンに作用してこれをフェニルピルビン酸に酸化する反応
及びこの逆反応を触媒する酵素であって、この反応を利
用することによりＬ−フェニルアラニン及びそれと類似
の構造を有するＬ−チロシン、並びにこれらに対応する
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸を測定することができる可能性がある。特に本発明
者はすでにスポロサルシナ属又はバシルス属細菌が生産
するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造方
法、並びに該酵素を使用するＬ−アミノ酸の製造方法の
発明を完成しており（特願昭60-080293、特願昭60-1271
18、及び特願昭60-272494）、これらの酵素の基質特異
性を酸化的脱アミノ化について測定した場合、Ｌ−フェ
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めて僅かしか反応しない。
ンに作用してこれをフェニルピルビン酸に酸化する反応
及びこの逆反応を触媒する酵素であって、この反応を利
用することによりＬ−フェニルアラニン及びそれと類似
の構造を有するＬ−チロシン、並びにこれらに対応する
フェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸を測定することができる可能性がある。特に本発明
者はすでにスポロサルシナ属又はバシルス属細菌が生産
するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造方
法、並びに該酵素を使用するＬ−アミノ酸の製造方法の
発明を完成しており（特願昭60-080293、特願昭60-1271
18、及び特願昭60-272494）、これらの酵素の基質特異
性を酸化的脱アミノ化について測定した場合、Ｌ−フェ
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めて僅かしか反応しない。
従って、この酵素を用いることによって、極めて高い特
異性をもってＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、
並びにフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸を定量することが可能である。
異性をもってＬ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン、
並びにフェニルピルビン酸及び４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸を定量することが可能である。
しかしながら、他方において、この反応はＬ−アミノ酸
とα−ケト酸との比率が所定の値に達した所で平衡にな
るため、正確な定量のためにはこの平衡を破っていずれ
かの方向に実質上完全に反応を進行せしめる必要があ
る。本発明者は種々検討の結果、このための有効な手段
を見出し、本発明を完成した。
とα−ケト酸との比率が所定の値に達した所で平衡にな
るため、正確な定量のためにはこの平衡を破っていずれ
かの方向に実質上完全に反応を進行せしめる必要があ
る。本発明者は種々検討の結果、このための有効な手段
を見出し、本発明を完成した。
従って、本発明は、フェニルアラニン脱水素酵素、水素
受容体、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含む
被検試料、及びα−ケト酸を除去する物質を含んで成る
反応系において還元された水素受容体の増加、α−ケト
酸に由来する物質の増加又はアンモニウムイオンの増加
を測定することを特徴とするＬ−フェニルアラニン又は
Ｌ−チロシンの定量方法；並びにフェニルアラニン脱水
素酵素、水素供与体、フェニルピルビン酸又は４−ヒド
ロキシフェニルピルビン酸を含む被検試料、及びフェニ
ルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に
対して250倍モル量以上のアンモニウムイオンを含んで
成る反応系において水素供与体の減少を測定することを
特徴とするフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸の定量方法を提供するものである。
受容体、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含む
被検試料、及びα−ケト酸を除去する物質を含んで成る
反応系において還元された水素受容体の増加、α−ケト
酸に由来する物質の増加又はアンモニウムイオンの増加
を測定することを特徴とするＬ−フェニルアラニン又は
Ｌ−チロシンの定量方法；並びにフェニルアラニン脱水
素酵素、水素供与体、フェニルピルビン酸又は４−ヒド
ロキシフェニルピルビン酸を含む被検試料、及びフェニ
ルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に
対して250倍モル量以上のアンモニウムイオンを含んで
成る反応系において水素供与体の減少を測定することを
特徴とするフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェ
ニルピルビン酸の定量方法を提供するものである。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を利用したＬ−フェニ
ルアラニンの測定方法は、本酵素が触媒する以下の可逆
反応を利用している。
ルアラニンの測定方法は、本酵素が触媒する以下の可逆
反応を利用している。
Ｌ−アミノ酸＋水素受容体＋H2O α−ケト酸＋還元された水素受容体＋NH4 + 式中、Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニンあるいは
Ｌ−チロシンであり、α−ケト酸は、フェニルピルビン
酸あるいは４−ヒドロキシフェニルピルビン酸である。
本発明はＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含有
する分析対象物に、水素受容体を加え、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を作用させ、生成物である還元された
水素受容体の増加、α−ケト酸に由来する物質の増加、
又はアンモニウムイオンの増加を測定することにより、
Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの微量分析を可
能にするものである。又、フェニルピルビン酸又は４−
ヒドロキシフェニルピルビン酸を含有する分析対象物
に、水素供与体を加え、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を作用させ、水素供与体の減少を定量することによ
り、フェニルピルビン酸あるいは４−ヒドロキシフェニ
ルピルビン酸の微量分析を可能にするものである。
Ｌ−チロシンであり、α−ケト酸は、フェニルピルビン
酸あるいは４−ヒドロキシフェニルピルビン酸である。
本発明はＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含有
する分析対象物に、水素受容体を加え、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素を作用させ、生成物である還元された
水素受容体の増加、α−ケト酸に由来する物質の増加、
又はアンモニウムイオンの増加を測定することにより、
Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの微量分析を可
能にするものである。又、フェニルピルビン酸又は４−
ヒドロキシフェニルピルビン酸を含有する分析対象物
に、水素供与体を加え、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を作用させ、水素供与体の減少を定量することによ
り、フェニルピルビン酸あるいは４−ヒドロキシフェニ
ルピルビン酸の微量分析を可能にするものである。
本発明のＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンの定量
法についてより具体的に説明する。本発明におけるＬ−
フェニルアラニン又はＬ−チロシンの定量はＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素と水素受容体を適当な溶媒中に共
存させ、適当な温度で、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−
チロシンと反応させる。反応は、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素が安定に活性を示す条件を選べばよく、溶媒
として、水又は、好ましくは、リン酸、トリス−HC、
グリシン−NaOH、グリシン−KCl−KOH、BIC INE−NaO
H、ピロリン酸ナトリウム−HC、ジエタノールアミン
−HC、ほう酸、炭酸水素ナトリウム等から選ばれる緩
衝液を用いることができる。
法についてより具体的に説明する。本発明におけるＬ−
フェニルアラニン又はＬ−チロシンの定量はＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素と水素受容体を適当な溶媒中に共
存させ、適当な温度で、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−
チロシンと反応させる。反応は、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素が安定に活性を示す条件を選べばよく、溶媒
として、水又は、好ましくは、リン酸、トリス−HC、
グリシン−NaOH、グリシン−KCl−KOH、BIC INE−NaO
H、ピロリン酸ナトリウム−HC、ジエタノールアミン
−HC、ほう酸、炭酸水素ナトリウム等から選ばれる緩
衝液を用いることができる。
この反応において、分析対象物中のＬ−アミノ酸を実質
上すべて反応せしめる必要があり、このためには生成す
るα−ケト酸を反応の系外に除去する必要がある。本発
明においては、この目的のためにアミン類又はα−ケト
酸の分解に関与する酵素を添加する。アミン類としては
例えばヒドラジン、フェニルヒドラジン又はその誘導
体、セミカルバジド又はその誘導体、ヒドロキシルアミ
ン又はその誘導体等を使用することができ、ヒドラジン
としてはヒドラジン・−水和物試薬を用いることができ
る。α−ケト酸の分解に関与する酵素としては例えばフ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素、又はフェニルピルビン酸
脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素との組合わせを使用
することができる。反応系中のアミン類の量は、α−ケ
ト酸１モルに対して100〜10,000モル程度とするのが好
ましい。反応系中のフェニルピルビン酸脱炭酸酵素の量
は、生成したフェニルピルビン酸が完全に脱炭酸される
量であり、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素１ユニット
に対して0.2〜１０ユニットとするのが好ましい。アル
デヒド脱水素酵素を併用する場合、この酵素の量は、フ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素により生成したフェニルア
セトアルデヒドを完全に分解することができる量であ
り、フェニルピルビン酸脱炭酸酵素１ユニットに対して
約0.1〜１０ユニットとするのが好ましい。
上すべて反応せしめる必要があり、このためには生成す
るα−ケト酸を反応の系外に除去する必要がある。本発
明においては、この目的のためにアミン類又はα−ケト
酸の分解に関与する酵素を添加する。アミン類としては
例えばヒドラジン、フェニルヒドラジン又はその誘導
体、セミカルバジド又はその誘導体、ヒドロキシルアミ
ン又はその誘導体等を使用することができ、ヒドラジン
としてはヒドラジン・−水和物試薬を用いることができ
る。α−ケト酸の分解に関与する酵素としては例えばフ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素、又はフェニルピルビン酸
脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素との組合わせを使用
することができる。反応系中のアミン類の量は、α−ケ
ト酸１モルに対して100〜10,000モル程度とするのが好
ましい。反応系中のフェニルピルビン酸脱炭酸酵素の量
は、生成したフェニルピルビン酸が完全に脱炭酸される
量であり、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素１ユニット
に対して0.2〜１０ユニットとするのが好ましい。アル
デヒド脱水素酵素を併用する場合、この酵素の量は、フ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素により生成したフェニルア
セトアルデヒドを完全に分解することができる量であ
り、フェニルピルビン酸脱炭酸酵素１ユニットに対して
約0.1〜１０ユニットとするのが好ましい。
反応系のpHとしては、反応系にアミン類を添加する場合
にはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の反応pHを使用
し、通常pH7〜１２、より好ましくはpH8〜１１である。
反応系にα−ケト酸の分解に関与する酵素を使用する場
合には、反応系のpHとしてＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素の反応pH及びα−ケト酸の分解に関与する酵素の反
応pHの両者に共通する範囲のpHを使用する必要があり、
例えばα−ケト酸を分解する酵素としてフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素を使用する場合には、反応系のpHは通常
７〜１０、さらに好ましくは８〜９である。
にはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の反応pHを使用
し、通常pH7〜１２、より好ましくはpH8〜１１である。
反応系にα−ケト酸の分解に関与する酵素を使用する場
合には、反応系のpHとしてＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素の反応pH及びα−ケト酸の分解に関与する酵素の反
応pHの両者に共通する範囲のpHを使用する必要があり、
例えばα−ケト酸を分解する酵素としてフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素を使用する場合には、反応系のpHは通常
７〜１０、さらに好ましくは８〜９である。
水素受容体としては、ＮＡＤ+や３−アセチルピリジン
アデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジンＮＡＤ
+）を用いることが出来る。
アデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジンＮＡＤ
+）を用いることが出来る。
以下、１mlの反応液を用いる時の分析条について述べ
る。定量するＬ−フェニルアラニンあるいは、Ｌ−チロ
シンの量は、通常０〜0.2μmolの範囲である。Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素の量は、加えたＬ−フェニルア
ラニンあるいは、Ｌ−チロシンが完全に変換される酵素
量であり、通常0.1〜１０単位加えればよい。α−ケト
酸を除去する物質としてヒドラジン・１水和物を使用す
る場合その量は10〜500μmolの範囲である。反応温度
は、使用する酵素が安定に活性を示す温度であり、20〜
37゜Cが好ましい。反応時間は、反応が完結するまでと
し、通常0.1分間〜１０時間である。なお、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の酵素活性単位の定義は、特願昭
60-080293に示したとおりであるが、pH10.5においてＬ
−フェニルアラニンを基質として１分間に１μmolのNAD
Hを生成する酵素量とする。フェニルピルビン酸脱炭酸
酵素、又はこれとアルデヒド脱水素酵素との組合わせを
用いる場合には、通常、前者を0.1〜１０ユニット、後
者を0.01〜１ユニット（フェニルアセトアルデヒドを基
質とした場合）を使用する。
る。定量するＬ−フェニルアラニンあるいは、Ｌ−チロ
シンの量は、通常０〜0.2μmolの範囲である。Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素の量は、加えたＬ−フェニルア
ラニンあるいは、Ｌ−チロシンが完全に変換される酵素
量であり、通常0.1〜１０単位加えればよい。α−ケト
酸を除去する物質としてヒドラジン・１水和物を使用す
る場合その量は10〜500μmolの範囲である。反応温度
は、使用する酵素が安定に活性を示す温度であり、20〜
37゜Cが好ましい。反応時間は、反応が完結するまでと
し、通常0.1分間〜１０時間である。なお、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の酵素活性単位の定義は、特願昭
60-080293に示したとおりであるが、pH10.5においてＬ
−フェニルアラニンを基質として１分間に１μmolのNAD
Hを生成する酵素量とする。フェニルピルビン酸脱炭酸
酵素、又はこれとアルデヒド脱水素酵素との組合わせを
用いる場合には、通常、前者を0.1〜１０ユニット、後
者を0.01〜１ユニット（フェニルアセトアルデヒドを基
質とした場合）を使用する。
反応の進行は、水素受容体の増加、α−ケト酸に由来す
る物質の増加、又はアンモニウムイオンの増加により測
定する。水素受容体としてＮＡＤ+を使用する場合には
その還元形であるNADHの増加を340mmにおける吸収によ
り測定することができ、水素受容体として３−アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジ
ンＮＡＤ+）を使用する場合にはその還元形である３−
アセチルピリジンNADHの増加を365mmにおける吸収によ
り測定することができる。また、蛍光法、ジアホラーゼ
と２，６−ジクロロフェノールインドフェノールとの組
合せ、又はフェナジンメトサルフェートとニトロブル−
テトラゾリウムとの組合わせ等により可視部の吸収とし
て測定することもできる。α−ケト酸に由来する物質
は、Ｌ−フェニルアラニン等から生じたフェニルピルビ
ン酸等と２，４−ジニトロフェニルヒドラジンや塩酸３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等との反
応生成物であり、これらの生成物はその色度により測定
することができる〔生化学実験法講座11，235頁(197
6)〕。２，４−ジニトロフェニルヒドラジンや塩酸３−
メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等は、反応
系に添加することによりα−ケト酸を除去する物質とし
て機能する。アンモニウムイオンは、アンモニア電極、
インドフェノール法、ネスラー法、酵素法〔生体成分の
酵素的分析法108頁(1985)〕等により測定することがで
きる。
る物質の増加、又はアンモニウムイオンの増加により測
定する。水素受容体としてＮＡＤ+を使用する場合には
その還元形であるNADHの増加を340mmにおける吸収によ
り測定することができ、水素受容体として３−アセチル
ピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジ
ンＮＡＤ+）を使用する場合にはその還元形である３−
アセチルピリジンNADHの増加を365mmにおける吸収によ
り測定することができる。また、蛍光法、ジアホラーゼ
と２，６−ジクロロフェノールインドフェノールとの組
合せ、又はフェナジンメトサルフェートとニトロブル−
テトラゾリウムとの組合わせ等により可視部の吸収とし
て測定することもできる。α−ケト酸に由来する物質
は、Ｌ−フェニルアラニン等から生じたフェニルピルビ
ン酸等と２，４−ジニトロフェニルヒドラジンや塩酸３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等との反
応生成物であり、これらの生成物はその色度により測定
することができる〔生化学実験法講座11，235頁(197
6)〕。２，４−ジニトロフェニルヒドラジンや塩酸３−
メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン等は、反応
系に添加することによりα−ケト酸を除去する物質とし
て機能する。アンモニウムイオンは、アンモニア電極、
インドフェノール法、ネスラー法、酵素法〔生体成分の
酵素的分析法108頁(1985)〕等により測定することがで
きる。
フェニルピルビン酸脱炭酸酵素によりフェニルピルビン
酸から生成したフェニルアセトアルデヒドを、ＮＡＤ+
とアルデヒド脱水素酵素を共存させることによりさらに
分解する場合、フェニルアセトアルデヒドと等量のＮＡ
Ｄ+が還元されてNADHが生成するので、Ｌ−フェニルア
ラニン１当量より合計２当量のNADHが生成することとな
り、NADHの量を測定する際に感度が２倍になる。
酸から生成したフェニルアセトアルデヒドを、ＮＡＤ+
とアルデヒド脱水素酵素を共存させることによりさらに
分解する場合、フェニルアセトアルデヒドと等量のＮＡ
Ｄ+が還元されてNADHが生成するので、Ｌ−フェニルア
ラニン１当量より合計２当量のNADHが生成することとな
り、NADHの量を測定する際に感度が２倍になる。
一方、フェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の触媒
する上述の反応の逆反応を行なわせしめることにより定
量することが出来る。すなわち、フェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸は、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素の存在下に、水素供与体及びアンモ
ニウムイオンと反応してそれぞれに対応するＬ−アミノ
酸に変換される。
ピルビン酸は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の触媒
する上述の反応の逆反応を行なわせしめることにより定
量することが出来る。すなわち、フェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸は、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素の存在下に、水素供与体及びアンモ
ニウムイオンと反応してそれぞれに対応するＬ−アミノ
酸に変換される。
この方法における反応条件は基本的にはＬ−フェニルア
ラニン又はＬ−チロシンを定量するための前記の条件と
同一であるが、α−ケト酸を分解する物質を反応系に添
加しないことは言うまでもない。また、この方法におい
ては分析対象物中のフェニルピルビン酸又は４−ヒドロ
キシフェニルピルビン酸を実質上すべて反応せしめる必
要があり、本発明においてはこのための手段として反応
系に大過剰のアンモニウムイオンを加える。このアンモ
ニウムイオンの量は、、フェニルピルビン酸又は４−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸の量に対して約250倍モル
量以上であり、好ましくは1000倍モル量以上である。す
なわち、本発明者等は、必要なアンモニウムイオンの量
を決定するために、本発明の実施例５〜８に示すものと
同様な反応系において、アンモニウムイオン濃度を種々
変えて実験を行った。この結果反応系１m中のアンモ
ニウムイオン量が200μmol（200ｍＭ濃度）であれば２
〜３分間で反応が実質的に100％完了し、アンモニウム
イオン量が100μmol（100ｍＭ濃度）であれば約１０分
間後に反応が実質的に100％完了し、アンモニウムイオ
ン量が５０μmol（５０ｍＭ濃度）であれば数１０分後
に反応が完了するが、アンモニウムイオン量をさらに減
少すれば基質であるフェニルピルビン酸が完全には転換
されず、定量分析が困難となることを見出した。使用し
た系においてフェニルピルビン酸の定量限界が約0.2μm
olであることから、分析対象中のα−ケト酸の量に対す
るアンモニウムイオンの必要量はおよそ250倍モル量で
あると推定され、短時間で定量を完了するためには1,00
0倍モル量以上であることが望ましい。実際の反応系に
おいては分析対象中のα−ケト酸の濃度は未知であるか
ら、反応系中のアンモニウムイオンの濃度を100ｍＭ以
上としておくのが好ましい。なお、上記反応系において
１０mmolのアンモニウムイオンを加えても定量結果に問
題がなかった。このアンモニウムイオンはアンモニウム
塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム等の形で添加される。
ラニン又はＬ−チロシンを定量するための前記の条件と
同一であるが、α−ケト酸を分解する物質を反応系に添
加しないことは言うまでもない。また、この方法におい
ては分析対象物中のフェニルピルビン酸又は４−ヒドロ
キシフェニルピルビン酸を実質上すべて反応せしめる必
要があり、本発明においてはこのための手段として反応
系に大過剰のアンモニウムイオンを加える。このアンモ
ニウムイオンの量は、、フェニルピルビン酸又は４−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸の量に対して約250倍モル
量以上であり、好ましくは1000倍モル量以上である。す
なわち、本発明者等は、必要なアンモニウムイオンの量
を決定するために、本発明の実施例５〜８に示すものと
同様な反応系において、アンモニウムイオン濃度を種々
変えて実験を行った。この結果反応系１m中のアンモ
ニウムイオン量が200μmol（200ｍＭ濃度）であれば２
〜３分間で反応が実質的に100％完了し、アンモニウム
イオン量が100μmol（100ｍＭ濃度）であれば約１０分
間後に反応が実質的に100％完了し、アンモニウムイオ
ン量が５０μmol（５０ｍＭ濃度）であれば数１０分後
に反応が完了するが、アンモニウムイオン量をさらに減
少すれば基質であるフェニルピルビン酸が完全には転換
されず、定量分析が困難となることを見出した。使用し
た系においてフェニルピルビン酸の定量限界が約0.2μm
olであることから、分析対象中のα−ケト酸の量に対す
るアンモニウムイオンの必要量はおよそ250倍モル量で
あると推定され、短時間で定量を完了するためには1,00
0倍モル量以上であることが望ましい。実際の反応系に
おいては分析対象中のα−ケト酸の濃度は未知であるか
ら、反応系中のアンモニウムイオンの濃度を100ｍＭ以
上としておくのが好ましい。なお、上記反応系において
１０mmolのアンモニウムイオンを加えても定量結果に問
題がなかった。このアンモニウムイオンはアンモニウム
塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム等の形で添加される。
水素供与体として例えばNADH又は還元型３−アセチルピ
リジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジン
NADH）を用いることができる。
リジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリジン
NADH）を用いることができる。
本発明のフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニ
ルピルビン酸の定量法についてより具体的に説明する。
本発明におけるフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸の定量はＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素と水素供与体、及びアンモニウムイオンを適当な
溶媒中に共存させ、適当な温度でフェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸と反応させればよ
い。以下、１mlの反応液を用いる時の分析条件について
述べる。反応はＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が安定
に活性を示す条件を選べばよいが、溶媒として、水、好
ましくは、リン酸、トリス−HC、グリシン−NaOH、グ
リシン−KCl−KOH、BICINE−NaOH、ピロリン酸ナトリウ
ム−HC、ジエタノールアミン−HC、ほう酸、炭酸水
素ナトリウム等から選ばれる緩衝液を用いることができ
る。反応pHは、通常pH7〜１１、より好ましくは、pH8−
10.5である。定量するフェニルピルビン酸又は４−ヒド
ロキシフェニルピルビン酸の量は、通常０〜0.2μmolの
範囲である。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の量は、
加えたフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸が完全に変換される酵素量であり、通常0.1
〜１０単位加えればよい。アンモニウムイオンの量は、
通常100μmol〜１mmol、より好ましくは、200〜400μmo
lの範囲である。反応温度は、使用する酵素が安定に活
性を示す温度であり、20〜37゜Cが好ましい。反応時間
は、反応が完結するまでとし、通常0.1分間〜１０時間
である。
ルピルビン酸の定量法についてより具体的に説明する。
本発明におけるフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸の定量はＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素と水素供与体、及びアンモニウムイオンを適当な
溶媒中に共存させ、適当な温度でフェニルピルビン酸又
は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸と反応させればよ
い。以下、１mlの反応液を用いる時の分析条件について
述べる。反応はＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が安定
に活性を示す条件を選べばよいが、溶媒として、水、好
ましくは、リン酸、トリス−HC、グリシン−NaOH、グ
リシン−KCl−KOH、BICINE−NaOH、ピロリン酸ナトリウ
ム−HC、ジエタノールアミン−HC、ほう酸、炭酸水
素ナトリウム等から選ばれる緩衝液を用いることができ
る。反応pHは、通常pH7〜１１、より好ましくは、pH8−
10.5である。定量するフェニルピルビン酸又は４−ヒド
ロキシフェニルピルビン酸の量は、通常０〜0.2μmolの
範囲である。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の量は、
加えたフェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニル
ピルビン酸が完全に変換される酵素量であり、通常0.1
〜１０単位加えればよい。アンモニウムイオンの量は、
通常100μmol〜１mmol、より好ましくは、200〜400μmo
lの範囲である。反応温度は、使用する酵素が安定に活
性を示す温度であり、20〜37゜Cが好ましい。反応時間
は、反応が完結するまでとし、通常0.1分間〜１０時間
である。
反応の進行の測定は、水素供与体の減少を、例えば前記
のようにして測定することができる。以上述べたのは、
反応が完結した後に生成物を測定するエンドポイントア
ッセイによる定量法であるが、反応速度を測定するレイ
トアッセイによる測定をおこなってもよい。この場合
は、反応組成は上記の通りであり、反応時間は、通常５
分以内でよく、反応速度を測定する。この反応速度の測
定は、例えば、反応経過中２以上の時間で反応の程度を
測定するか、又は反応の進行を連続的に記録することに
より行うことができる。
のようにして測定することができる。以上述べたのは、
反応が完結した後に生成物を測定するエンドポイントア
ッセイによる定量法であるが、反応速度を測定するレイ
トアッセイによる測定をおこなってもよい。この場合
は、反応組成は上記の通りであり、反応時間は、通常５
分以内でよく、反応速度を測定する。この反応速度の測
定は、例えば、反応経過中２以上の時間で反応の程度を
測定するか、又は反応の進行を連続的に記録することに
より行うことができる。
本発明においては、種々のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素を使用することができ、例えばスポロサルシナ属又
はバシルス属に属する細菌の生産するＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を使用することができる。
酵素を使用することができ、例えばスポロサルシナ属又
はバシルス属に属する細菌の生産するＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素を使用することができる。
スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエ(Sporosarcina ureae)を挙げることが出
来る。具体的な菌株として、スポロサルシナ・ウレアエ
IFO 12698、スポロサルシナ・ウレアエIFO 12699(ATCC
6473)、及び本発明者が分離したスポロサルシナ・ウレ
アエSCRC-R04を挙げることが出来る。前記の保存菌はそ
れぞれ前記寄託番号のもとに、IFO又は、ATCCから自由
に入手することができ、またスポロサルシナ・ウレアエ
SCRC-R04は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第1012号 (FERM BP-1012)として寄託されている。その菌学的性質
は、特願昭60-080293に記されている。バシルスに属す
る微生物としては、例えば、バシルス・バディウス(Bac
illus badius)IAM 11059(ATCC 14574)微工研菌寄第8529
号(FERM P-8529)、バシルス sp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、微工研条寄第1013号(FERM BP-1013)、
バシルス sp.SCRC-101A、バシルス sp.SCRC-114D微工
研条寄第1011号(FERM BP-1011)、バシルス・シフェリカ
ス(Bacillus sphaericus)IAM 1228、及びバシルス・チ
アミノリティカスIAM 1034を挙げることができる。バシ
ルス・バディウスIAM 11059は、前記寄託番号のもとにJ
FCCやATCCカタログに記載されており、自由に入手する
ことができる。その他のバシルス属細菌の菌学的性質
は、特願昭60-080293に記されている。
シナ・ウレアエ(Sporosarcina ureae)を挙げることが出
来る。具体的な菌株として、スポロサルシナ・ウレアエ
IFO 12698、スポロサルシナ・ウレアエIFO 12699(ATCC
6473)、及び本発明者が分離したスポロサルシナ・ウレ
アエSCRC-R04を挙げることが出来る。前記の保存菌はそ
れぞれ前記寄託番号のもとに、IFO又は、ATCCから自由
に入手することができ、またスポロサルシナ・ウレアエ
SCRC-R04は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第1012号 (FERM BP-1012)として寄託されている。その菌学的性質
は、特願昭60-080293に記されている。バシルスに属す
る微生物としては、例えば、バシルス・バディウス(Bac
illus badius)IAM 11059(ATCC 14574)微工研菌寄第8529
号(FERM P-8529)、バシルス sp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、微工研条寄第1013号(FERM BP-1013)、
バシルス sp.SCRC-101A、バシルス sp.SCRC-114D微工
研条寄第1011号(FERM BP-1011)、バシルス・シフェリカ
ス(Bacillus sphaericus)IAM 1228、及びバシルス・チ
アミノリティカスIAM 1034を挙げることができる。バシ
ルス・バディウスIAM 11059は、前記寄託番号のもとにJ
FCCやATCCカタログに記載されており、自由に入手する
ことができる。その他のバシルス属細菌の菌学的性質
は、特願昭60-080293に記されている。
前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に
当っては前記基礎培地に、誘導物質としての少量のＬ−
フェニルアラニンを添加するのが好ましい。このＬ−フ
ェニルアラニンの添加量は、基礎培地の組成、培養する
菌株の性質等により異なるがおよそ0.01〜１w/v％であ
る。培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよ
いが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振盪培養、通気、攪拌培養等により好気的条件下で
培養を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45゜C
である。pHは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。次に得られた培養物
から本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が採取さ
れるが、精製法として通常の酵素精製法を用いることが
出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さらにこれ
に硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを加えて
処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム等
の塩やポリエチレングリコール等の添加による結晶化等
の公知の方法によって均一の結晶酵素標品を単離するこ
とが出来る。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に
当っては前記基礎培地に、誘導物質としての少量のＬ−
フェニルアラニンを添加するのが好ましい。このＬ−フ
ェニルアラニンの添加量は、基礎培地の組成、培養する
菌株の性質等により異なるがおよそ0.01〜１w/v％であ
る。培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよ
いが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振盪培養、通気、攪拌培養等により好気的条件下で
培養を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ
−フェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45゜C
である。pHは６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは６〜４８時間である。次に得られた培養物
から本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素が採取さ
れるが、精製法として通常の酵素精製法を用いることが
出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さらにこれ
に硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを加えて
処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム等
の塩やポリエチレングリコール等の添加による結晶化等
の公知の方法によって均一の結晶酵素標品を単離するこ
とが出来る。
フェニルピルビン酸脱炭酸酵素は、アシネトバクター(A
cinetobacter)属に属する細菌から、超音波処理、プロ
タミン硫酸処理、硫安分画、ブチルトヨパールカラム、
ヒドロキシアパタイトカラム、セファデックスＧ−200
カラムなどの方法により精製して用いることができる。
具体的な菌株としては、アシネトバクター・カルコアセ
テイカス(Acinetobactercalcoaceticus)IFO 12552をあ
げることができる。
cinetobacter)属に属する細菌から、超音波処理、プロ
タミン硫酸処理、硫安分画、ブチルトヨパールカラム、
ヒドロキシアパタイトカラム、セファデックスＧ−200
カラムなどの方法により精製して用いることができる。
具体的な菌株としては、アシネトバクター・カルコアセ
テイカス(Acinetobactercalcoaceticus)IFO 12552をあ
げることができる。
アルデヒド脱水素酵素は市販品を用いてもよく、またア
シネトバクター属細菌から部分精製したフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素中にはこの酵素活性が混在しているの
で、これをそのまま用いてもよい。次に実施例により、
この発明をさらに具体的に説明する。
シネトバクター属細菌から部分精製したフェニルピルビ
ン酸脱炭酸酵素中にはこの酵素活性が混在しているの
で、これをそのまま用いてもよい。次に実施例により、
この発明をさらに具体的に説明する。
実施例１． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（スポロサルシナ・ウレアエSCRC
- R04よりの均一精製酵素）0.6単位、及びＬ−フェニル
アラニン0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５
゜Cで１０分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み
取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素を除いたものを対照とした。この結果を第１表に
示す。これから検量線を作成したところ、第１図Ａに示
す直線が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フ
ェニルアラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が
一致した。
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（スポロサルシナ・ウレアエSCRC
- R04よりの均一精製酵素）0.6単位、及びＬ−フェニル
アラニン0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５
゜Cで１０分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み
取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素を除いたものを対照とした。この結果を第１表に
示す。これから検量線を作成したところ、第１図Ａに示
す直線が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フ
ェニルアラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が
一致した。
実施例２． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・フェリカスSCRC R79
aよりの均一精製酵素）0.6単位、及びＬ−フェニルアラ
ニン0.02〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで
１０分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取っ
た。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を除いたものを対照した。この結果を第２表に示す。
これから検量線を作成したところ、第１図Ｂに示す直線
が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フェニル
アラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が一致し
た。
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・フェリカスSCRC R79
aよりの均一精製酵素）0.6単位、及びＬ−フェニルアラ
ニン0.02〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで
１０分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取っ
た。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を除いたものを対照した。この結果を第２表に示す。
これから検量線を作成したところ、第１図Ｂに示す直線
が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フェニル
アラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が一致し
た。
実施例３． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・バディウスIAM 1105
9よりの均一精製酵素）0.5単位、及びＬ−フェニルアラ
ニン0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで
５分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取っ
た。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を除いたものを対照とした。この結果を第３表に示
す。これから検量線を作成したところ、第１図Ｃに示す
直線が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フェ
ニルアラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が一
致した。
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・バディウスIAM 1105
9よりの均一精製酵素）0.5単位、及びＬ−フェニルアラ
ニン0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで
５分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取っ
た。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素を除いたものを対照とした。この結果を第３表に示
す。これから検量線を作成したところ、第１図Ｃに示す
直線が得られた。このように、試料中に加えたＬ−フェ
ニルアラニン量と反応後に測定されるNADHの生成量が一
致した。
実施例４． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・スフェリカスSCRC-R
79aよりの均一精製酵素）２単位、及びＬ−チロシン0.0
20〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで１０分
間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。前
記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除
いたものを対照とした。この結果を第４表に示す。これ
から検量線を作成したところ、第１図Ｄに示す直線が得
られた。このように、試料中に加えたＬ−チロシン量と
反応後に測定されるNADHの生成量が一致した。
+2.5μmol、ヒドラジン・１H2O 200μmol、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素（バシルス・スフェリカスSCRC-R
79aよりの均一精製酵素）２単位、及びＬ−チロシン0.0
20〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで１０分
間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。前
記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除
いたものを対照とした。この結果を第４表に示す。これ
から検量線を作成したところ、第１図Ｄに示す直線が得
られた。このように、試料中に加えたＬ−チロシン量と
反応後に測定されるNADHの生成量が一致した。
実施例５． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+0.2μmol、NH4C1 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱
水素酵素（スポロサルシナ・ウレアエSCRC R04よりの均
一精製酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0150
〜0.0900μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反
応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反
応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いた
ものを対照とした。この結果を第５表に示す。これから
検量線を作成したところ、第１図Ｅに示す直線が得られ
た。このように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と
反応後に測定されるNADHの減少量が一致した。
+0.2μmol、NH4C1 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱
水素酵素（スポロサルシナ・ウレアエSCRC R04よりの均
一精製酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0150
〜0.0900μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反
応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反
応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いた
ものを対照とした。この結果を第５表に示す。これから
検量線を作成したところ、第１図Ｅに示す直線が得られ
た。このように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と
反応後に測定されるNADHの減少量が一致した。
実施例６． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、NADH 0.2
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・フェリカスSCRC-R79aよりの均一精製
酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0150〜0.090
0μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反応し、3
40nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反応組成か
ら、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対
照とした。この結果を第６表に示す。これから検量線を
作成したところ、第１図Ｆに示す直線が得られた。この
ように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と反応後に
測定されるNADHの減少量が一致した。
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・フェリカスSCRC-R79aよりの均一精製
酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0150〜0.090
0μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反応し、3
40nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反応組成か
ら、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対
照とした。この結果を第６表に示す。これから検量線を
作成したところ、第１図Ｆに示す直線が得られた。この
ように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と反応後に
測定されるNADHの減少量が一致した。
実施例７． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、NADH 0.2
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・バディウスIAM 11059よりの均一精製
酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0200〜0.100
μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反応し、34
0nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反応組成か
ら、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対
照とした。この結果を第７表に示す。これから検量線を
作成したところ、第１図Ｇに示す直線が得られた。この
ように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と反応後に
測定されるNADHの減少量が一致した。
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・バディウスIAM 11059よりの均一精製
酵素）0.1単位、及びフェニルピルビン酸0.0200〜0.100
μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５分間反応し、34
0nmにおける吸光度変化を読み取った。前記反応組成か
ら、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対
照とした。この結果を第７表に示す。これから検量線を
作成したところ、第１図Ｇに示す直線が得られた。この
ように、試料中に加えたフェニルピルビン酸と反応後に
測定されるNADHの減少量が一致した。
実施例８． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、NADH 0.2
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・スフェリカスSCRC-R79aよりの均一精
製酵素）１単位、及び４−ヒドロキシフェニルピルビン
酸0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５
分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。
前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
除いたものを対照とした。この結果を第８表に示す。こ
れから検量線を作成したところ、第１図Ｈに示す直線が
得られた。このように、試料中に加えた４−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸と反応後に測定されるNADHの減少量
が一致した。
μmol、NH4Cl 200μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素（バシルス・スフェリカスSCRC-R79aよりの均一精
製酵素）１単位、及び４−ヒドロキシフェニルピルビン
酸0.020〜0.100μmolを含む1.0mlの反応液を２５゜Cで５
分間反応し、340nmにおける吸光度変化を読み取った。
前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を
除いたものを対照とした。この結果を第８表に示す。こ
れから検量線を作成したところ、第１図Ｈに示す直線が
得られた。このように、試料中に加えた４−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸と反応後に測定されるNADHの減少量
が一致した。
実施例９． リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)100μmol、ＮＡＤ+2.5μm
ol、チアミンピロリン酸0.2μmol、塩化マグネシウム２
μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・
バディウスIAM 11059よりの均一精製酵素）0.5単位、フ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素（アシネトバクター・カル
コアセティカスIFO 12552よりの部分精製酵素、アルデ
ヒド脱水素酵素活性を含む）0.2単位、(0.03単位)、及
びＬ−フェニルアラニン0.05μmolを含む1.0mlの反応液
を２５゜Cで１５分間反応し、340nmにおける吸光度変化
を読み取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素を除いたものを対照した。この結果を表９
に示す。このように、試料中のＬ−フェニルアラニン量
と反応後に測定されるNADHの増加量の半量が一致した。
ol、チアミンピロリン酸0.2μmol、塩化マグネシウム２
μmol、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（バシルス・
バディウスIAM 11059よりの均一精製酵素）0.5単位、フ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素（アシネトバクター・カル
コアセティカスIFO 12552よりの部分精製酵素、アルデ
ヒド脱水素酵素活性を含む）0.2単位、(0.03単位)、及
びＬ−フェニルアラニン0.05μmolを含む1.0mlの反応液
を２５゜Cで１５分間反応し、340nmにおける吸光度変化
を読み取った。前記反応組成から、Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素を除いたものを対照した。この結果を表９
に示す。このように、試料中のＬ−フェニルアラニン量
と反応後に測定されるNADHの増加量の半量が一致した。
実施例10． グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH10.4)100μmol、ＮＡＤ
+2.5μmol Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（バシル
ス・フェリカスSCRC-R79aよりの部分精製酵素）0.1単
位、及びＬ−フェニルアラニン0.010〜0.050μmolを含
む1.0mlの反応液を２５゜Cで反応し、340nmにおける吸光
度の経時変化を連続的に記録した。前記反応組成から、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対照と
した。その結果、反応速度は反応開始１分後までほぼ一
定であった。反応開始から１分後までの吸光度変化をを
第１０表に示す。これから検量線を作成したところ、図
９に示す直線が得られた。このことから、本発明はレー
ト法によっても実施できることが明らかである。
+2.5μmol Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素（バシル
ス・フェリカスSCRC-R79aよりの部分精製酵素）0.1単
位、及びＬ−フェニルアラニン0.010〜0.050μmolを含
む1.0mlの反応液を２５゜Cで反応し、340nmにおける吸光
度の経時変化を連続的に記録した。前記反応組成から、
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を除いたものを対照と
した。その結果、反応速度は反応開始１分後までほぼ一
定であった。反応開始から１分後までの吸光度変化をを
第１０表に示す。これから検量線を作成したところ、図
９に示す直線が得られた。このことから、本発明はレー
ト法によっても実施できることが明らかである。
第１図は本発明の方法の検量線の例を示し、この図中Ａ
は、実施例１において得られた、SCRC-R04株由来Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−フェニ
ルアラニン定量用検量線であり； Ｂは、実施例２において得られた、SCRC-79a株由来Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−フェ
ニルアラニン定量用検量線であり； Ｃは、実施例３において得られた、IAM 11059株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−
フェニルアラニン定量用検量線であり； Ｄは、実施例４において得られた、SCRC-R04株由来のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−チ
ロシン定量用検量線であり； Ｅは、実施例５において得られた、SCRC-R04株由来Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェニル
ピルビン酸定量用検量線であり； Ｆは、実施例６において得られた、SCRC-R79a株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェ
ニルピルビン酸定量用検量線であり； Ｇは、実施例７において得られた、IAM 11059株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェ
ニルピルビン酸定量用検量線であり；そして Ｈは、実施例８において得られた、SCRC-R04株由来のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合の４−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸定量用検量線である。 第２図は、本発明のレート法における検量図の一例を示
すグラフである。
は、実施例１において得られた、SCRC-R04株由来Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−フェニ
ルアラニン定量用検量線であり； Ｂは、実施例２において得られた、SCRC-79a株由来Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−フェ
ニルアラニン定量用検量線であり； Ｃは、実施例３において得られた、IAM 11059株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−
フェニルアラニン定量用検量線であり； Ｄは、実施例４において得られた、SCRC-R04株由来のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のＬ−チ
ロシン定量用検量線であり； Ｅは、実施例５において得られた、SCRC-R04株由来Ｌ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェニル
ピルビン酸定量用検量線であり； Ｆは、実施例６において得られた、SCRC-R79a株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェ
ニルピルビン酸定量用検量線であり； Ｇは、実施例７において得られた、IAM 11059株由来の
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合のフェ
ニルピルビン酸定量用検量線であり；そして Ｈは、実施例８において得られた、SCRC-R04株由来のＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素を使用した場合の４−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸定量用検量線である。 第２図は、本発明のレート法における検量図の一例を示
すグラフである。
Claims (11)
- 【請求項１】フェニルアラニン脱水素酵素、水素受容
体、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを含む被検
試料、及びα−ケト酸を除去する物質を含んで成る反応
系において還元された水素受容体の増加、α−ケト酸に
由来する物質の増加又はアンモニウムイオンの増加を測
定することを特徴とするＬ−フェニルアラニン又はＬ−
チロシンの定量方法。 - 【請求項２】前記フェニルアラニン脱水素酵素がバシル
ス(Bacillus)属細菌又はスポロサルシナ(Sporosarcina)
属細菌により生産されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記水素受容体がＮＡＤ+又は３−アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリ
ジンＮＡＤ+）である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項４】前記α−ケト酸を除去する物質がアミン類
又はα−ケト酸の分解に関与する酵素である特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項５】前記アミン類がヒドラジン、フェニルヒド
ラジンもしくはその誘導体、セミカルバジドもしくはそ
の誘導体、又はヒドロキシルアミンもしくはその誘導体
である特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】前記α−ケト酸の分解に関与する酵素がフ
ェニルピルビン酸脱炭酸酵素、又はフェニルピルビン酸
脱炭酸酵素とアルデヒド脱水素酵素との組み合わせであ
る特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項７】エンドポイント法又はレート法で行う特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項８】フェニルアラニン脱水素酵素、水素供与
体、フェニルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピ
ルビン酸を含む被検試料、及びフェニルピルビン酸又は
４−ヒドロキシフェニルピルビン酸に対して250倍モル
量以上のアンモニウムイオンを含んで成る反応系におい
て水素供与体の減少を測定することを特徴とするフェニ
ルピルビン酸又は４−ヒドロキシフェニルピルビン酸の
定量方法。 - 【請求項９】前記Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素がバ
シルス(Bacillus)属細菌又はスポロサルシナ(Sporosaru
cina)属細菌により生産されるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素である特許請求の範囲第８項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記水素供与体がNADH又は還元型アセチ
ルピリジンアデニンジヌクレオチド（３−アセチルピリ
ジンNADH）である特許請求の範囲第８項に記載の方法。 - 【請求項１１】エンドポイント法又はレート法で行う特
許請求の範囲第８項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27544886A JPH066075B2 (ja) | 1986-11-20 | 1986-11-20 | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27544886A JPH066075B2 (ja) | 1986-11-20 | 1986-11-20 | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63129996A JPS63129996A (ja) | 1988-06-02 |
| JPH066075B2 true JPH066075B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=17555667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27544886A Expired - Lifetime JPH066075B2 (ja) | 1986-11-20 | 1986-11-20 | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066075B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4029296A1 (de) * | 1990-09-17 | 1992-03-19 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren und anordnung zur enzymatischen bestimmung von substanzen mit nichtendstaendigen nad(pfeil hoch)+(pfeil hoch)-abhaengig enzymatisch umsetzbaren gruppen, insb. von aspartam |
| DE69832909T2 (de) * | 1998-07-16 | 2006-09-14 | Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory, Sapporo | Verfahren zum bestimmen von l-phenylalanin und ein l-phenylalaninsensor |
| JP2012183027A (ja) * | 2011-03-04 | 2012-09-27 | Toyama Prefecture | Ｌ−チロシンの定量方法 |
-
1986
- 1986-11-20 JP JP27544886A patent/JPH066075B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63129996A (ja) | 1988-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3907644A (en) | Creatinine amidohydrolase composition and process for the determination of creatinine | |
| JPH031949B2 (ja) | ||
| JPH0646846A (ja) | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 | |
| US4202941A (en) | Glycerol oxidase and process for the production thereof and method for the quantitative determination of glycerol by glycerol oxidase | |
| EP0204283B1 (en) | Uricase and a method for the preparation thereof | |
| US4810640A (en) | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol | |
| SE445928B (sv) | Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur | |
| US5871949A (en) | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay | |
| EP0016845B1 (en) | Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof | |
| US4341868A (en) | Method and test composition for the determination of the substrate for xanthine oxidase | |
| JPH0234599B2 (ja) | ||
| JPH0324200B2 (ja) | ||
| JPH066075B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 | |
| US4954445A (en) | Novel NAD(P)H oxidase | |
| JPH0373276B2 (ja) | ||
| JPS6214272B2 (ja) | ||
| JPH0544273B2 (ja) | ||
| JP3586485B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬 | |
| WO1989007137A1 (en) | Nucleoside oxidase and analytical method using same | |
| JP2001120273A (ja) | タンパク質の改変方法および改変タンパク質 | |
| JPH07114713B2 (ja) | フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 | |
| JP3490184B2 (ja) | 新規Ｎ−アルキルグリシンオキシダーゼ、その製造方法、この酵素を用いたＮε−カルボキシメチルリジンの定量用試薬及びその定量方法 | |
| JPH04117281A (ja) | ベタインアルデヒド脱水素酵素の製造方法 | |
| JPH04346796A (ja) | 乳酸またはピルビン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP3929576B2 (ja) | リン酸化１，５−アンヒドログルシトールに作用する酵素を産生する微生物、当該微生物が産生する酵素及びそれを使用したリン酸化１，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |