JPH0544273B2 - - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、ヌクレオシドの酸化反応を触媒する
新しい酵素、詳しくはヌクレオシドと分子状酸素
との反応よつてヌクレオシド−5′−アルデヒドを
経てヌクレオシド−5′−カルボン酸を生成する
が、過酸化水素は副生しない新規ヌクレオシドオ
キシダーゼYT−１及び該酵素を利用した新規な
分析法に関する。 従来の技術 ヌクレオシドに作用する酵素としては、その加
水分解酵素や脱アミノ酵素と共に、次式に示され
る酸化反応を触媒する酵素（ヌクレオシドオキシ
ダーゼ）が知られている。 上記ヌクレオシドオキシダーゼは、従来より例
えば代表的にはシユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida等の微生物から単離、精
製され、ヌクレオシド−5′−カルボン酸類の製造
や、ヌクレオシド類の定量、更には反応によつて
ヌクレオシドが生成したり減少したりする酵素類
の活性測定系等に種々利用されている。 しかるに、オキシダーゼの利用によれば酸化反
応系においてH2O2の発生が必然的に起こり、例
えば上記ヌクレオシド−5′−カルボン酸類の製造
においては、反応系にカタラーゼ等を添加して上
記H2O2を分解させる必要があり、また上記反応
系内に生成するH2O2量の測定によつてヌクレオ
シドを測定、定量する方法では、パーオキシダー
ゼの利用が必須となる不利がある。しかも上記測
定法では、測定系が繁雑となる等の弊害がある
（例えば特開昭57−58883号公報、特開昭57−
68794号公報、特開昭57−94300号公報等参照）。 発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、以前から各種微生物起源等のヌ
クレオシドオキシダーゼにつき、鋭意研究を重ね
てきたが、その過程で、新たに土壌から単離した
シユードモナス属に属する一菌株が、従来のヌク
レオシドオキシダーゼとは異なる酸化反応を触媒
する酵素の産生能を有することを見出すと共に、
該酵素の単離精製、その性質等の解明に成功し、
更に該酵素の利用による新しい分析、測定技術の
開発に成功し、ここに本発明を完成するに至つ
た。 問題点を解決するための手段 即ち、本発明はヌクレオシドの酸化反応を触媒
する酵素であつて、後述する性質を有し且つ上記
ヌクレオシドと分子状酸素との反応によつてヌク
レオシド−5′−アルデヒドを経てヌクレオシド−
5′−カルボン酸を生成するが、過酸化水素は副生
しないことを特徴とする新規ヌクレオシドオキシ
ダーゼYT−１、並びにヌクレオシドを含有する
か又はこれを生成させる系を被検液とし、酸化に
より発色する発色試薬と上記検液との混合物に上
記ヌクレオシドオキシダーゼYT−１を作用さ
せ、被検液のヌクレオシド量変化に比例する上記
発色試薬の発色度合を測定するとを特徴とする被
検液の分析法に係わる。 本発明酵素の触媒する上記ヌクレオシドの酸化
反応は、次式(1)及び(2)で示され、これまで知られ
ているヌクレオシドオキシダーゼの酸化反応とは
明確に区別される。勿論、従来かかる式(1)及び(2)
で示される反応を触媒するヌクレオシドオキシダ
ーゼは全く知られていない。 また、本発明のヌクレオシドオキシダーゼYT
−１は、後記に詳述する通り、上記式で示される
該ヌクレオシドの酸化反応と同時に、該ヌクレオ
シド量に応じてラツカーゼ様活性を示すという該
酵素に特有の性質を有しており、この点において
も従来のヌクレオシドオキシダーゼとは全く異な
つている。本発明の分析法は、該酵素に特有の上
記ラツカーゼ様活性を利用して、発色試薬の発色
度合を例えば吸光度測定により行なうものであ
り、従来のヌクレオシドオキシダーゼの利用で
は、かる分析は実施できない。 以下、本発明酵素の製造法、その性質及びこれ
を利用した本発明の分析法につき順次説明する。 本発明酵素は、シユードモナス属に属する該酵
素生産菌を用いて製造できる。ここで用いられる
上記酵素の生産菌としては、例えば本発明者らが
新たに単離した以下の性質を有する菌株を例示で
きる。 菌学的性質 (A) 形態学的性質 細胞は桿菌であり、大きさは0.5×1.5〜
1.7μmである。 運動性を有し、ベん毛は極べん毛である。 胞子は形成されない。 グラム染色においては陰性である。 (B) 培養所見 肉汁寒天平板培養 生育は中庸であり、集落は円形で、表面は滑か
で黄色である。 肉汁寒天斜面培養 生育は中庸であり、表面は滑かで黄色である。 肉汁液体培養 表面に生育し、生育は中庸である。 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面部分に生育し、ゼラチンを液化する
（Stratiform）。 (C) 生理的性質 硝酸塩の還元 陰性 脱窒反応 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 澱粉の加水分解 陰性 硝酸塩の利用 陰性 アンモニウム塩の利用 陽性 色素の生成 蛍光色素、ピオシアニン、キサントモナジンは
いずれも生成しない。肉汁寒天培地では褐色の
拡散性色素を生産することがある。 ウレアーゼ 陰性 オキシダーゼ 陰性〜弱陽性 カタラーゼ 陽性 生育の範囲 PH4.5で生育しない。４℃及び41℃で生育しな
い。生育PHは５〜８の範囲が適当であり、温度
は35℃が最適である。 酵素に対する態度 好気性である Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法） 酸化的 糖類からの酸の生成 Ｄ−グルコス 陽性 Ｄ−フルクトース 陽性 Ｄ−マルトース 陽性 Ｄ−ガラクトース 陽性 Ｄ−キシロース 陽性 Ｄ−マンニトール 陰性 シヨ糖 陰性 乳糖 陽性 エスクリンの分解 陽性 アルギニンジヒドラーゼ 陰性 リジンデカルボキシラゼ 陽性 オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 フエニルアラニンデアミナーゼ 陰性 卵黄反応 陰性 ツイーン20の分解 陽性 〓〓 ツイーン80の分解 陽性 ポリベーターヒドロキシ酪酸の蓄積 陰性 〓〓 栄養要求性 メチオニン或いはシスチンを要求する。 以上の各性質をもとに、本菌株の検索をバージ
〔Bergey’ｓ Manual of Systematic
Bacteriology（1984）〕に従つて行なうと、本菌
株はグラム陰性の桿菌であり、胞子を形成しな
いこと、カタラーゼ陽性あること、極べん毛
で運動すること、グルコースを酸化的に分解す
ること、PH7.0の普通寒天培地によく生育する
こと等の特徴を有していることより、シユードモ
ナス属（Pseudomonas属）に属すると認められ
た。更にシスチン或いはメチオニンを生育に要
求すること、アルギニンジヒドロラーゼ陰性で
あること、ポリベーターヒドロキシ酪酸を蓄積
しないこと、コロニーが黄色であること、キ
サントモナジンを産生しないこと、オキシダー
ゼ反応が微弱であること等、シユードモナス マ
ルトフイリア（Pseudomonas maltophilia）の
特徴とよく一致した。 以上の結果より、本発明者らは本菌株をシユー
ドモナス マルトフイリアの一菌株と同定し、こ
れをシユードモナス マルトフイリアLB−86
（Pseudomonas maltophilia LB−86）と命名し
た。該菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に上記表示にて、微工研菌寄第9813号
（FERM Ｐ−9813）として寄託された。 本発明のヌクレオシドオキシダーゼYT−１
は、上記LB−86株、その変異株等を含むシユー
ドモナス属に属し、上記ヌクレオシドオキシダー
ゼYT−１の産生能を有する微生物を培養するこ
とにより製造できる。 上記微生物の培養は、適当な栄養含有培地中で
実施できる。この培地としては、シユードモナス
属に属する微生物の培養に通常使用される各種の
炭素源、窒素源、無機物等を含有する合成培地、
半合成培地及び天然培地のいずれをも使用するこ
とができる。上記炭素源としては具体的には例え
ば高級脂肪酸、スターチ分解物（デキストリン）、
マルトース、乳糖、ブドウ糖、糖密、果糖等の微
生物が同化可能な各種炭素化合物が単独で又は２
種以上組合せて用いられる。窒素源としては、例
えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、
綿実粉、コンステイープリカー等を例示できる。
無機物としては、例えば食塩の他、カリウム、ナ
トリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄
等の無機金属リン酸塩類や硫酸塩類等の無機塩類
が必要に応じて適宜利用され得る。 上記微生物の培養は、液体培養でも、固体培養
でも実施でき、通常通気撹拌条件下に、好気的に
行なわれるのが望ましい。培地のPH、培養温度、
培養時間等の培養条件は、培養する微生物の発育
に適しており、しかも目的とする酵素の生産量を
できるだけ多くする条件から選択されるのがよ
い。例えば培地のPHは約６〜８の範囲、培養温度
は約20〜35℃の範囲から選択されるのが好適であ
る。培養時間は目的とする酵素の生産積量が最高
に達する時間を選べばよく、通常は約12〜48時間
の範囲から選択される。勿論、上記培養の各条件
や培養方法等は、用いる微生物の種類や培養のた
めの外的条件等に応じて適宜変化させ得る。 かくして得られる培養物中には、通常その菌体
区分に、目的とする酵素が蓄積される。この酵素
の採取及びその精製は、従来より微生物を利用し
て酵素等を製造する方法に採用されている通常の
各種方法に従うことができる。上記精製手段とし
ては、例えば溶媒に対する溶解性を利用する手
段、イオン結合力の差を利用する手段、分子量の
差を利用する手段、等電点の差を利用する手段、
疎水性の差を利用する手段等をそれぞれ単独で又
は適宜組合せて採用することができる。 上記菌体区分からの目的酵素の採取につき詳述
すれば、これは例えば遠心分離等の常法に従い集
めて得られる湿潤菌体を、リン酸緩衝液やトリス
緩衝液等に懸濁させ、超音波処理、フレンチプレ
ス、リゾチーム処理等の種々の菌体処理手段を適
宜組合せ採用することにより行なわれ、かくして
粗製酵素含有液を得ることができる。 上記粗製酵素含有液は、これを更に通常の方法
により精製して精製酵素標品を得ることができ
る。この精製手段としては、例えばエタノール、
アセトン等の有機溶媒による分別沈澱法、硫安、
硫酸アルミニウム等を用いた塩析法等により、ま
ず上記粗製酵素含有液から沈澱を回収し、次いで
該沈澱を、ジエチルアミノエチルデキストラン等
のイオン交換体、ポリアクリルアミドゲル等のゲ
ル過剤によるクロマトグラフイー操作に付する
ことにより実施でき、またかくして得られる精製
酵素標品は、更に凍結乾燥等の操作によつて精製
粉末標品とすることもできる。 以上のようにして得られる本発明酵素は、前記
した式(1)及び(2)で示される酸化反応を触媒する酵
素作用を有する点において特徴づけられる他、以
下に示す物理化学的性質等を有する点においても
また特徴付けられる。 (1) 基質特異性： イノシン等の各種ヌクレオシドに作用する。ヒ
ポキサンチン等の塩基、イノノシン酸等ヌクレ
オシド、リボース等には作用しない。 (2) 温度及びPH安定性： PH6.0、60℃、15分で95％以上残存し、70℃、
15分では失活する。 また、37℃、60分の処理ではPH5.0〜6.0で95％
以上残存する。 (3) 至適PH：PH5.0〜6.0である。 (4) 分子量：約130000である。 （ゲル過法による） (5) 等電点：PH5.3である。 (6) 阻害剤の影響：シアン酸カリウム、アジ化ナ
トリウムによつて阻害される。 (7) 可視部吸収：リン酸緩衝液等の中性緩衝液中
においては450nm以上に吸収極大がない。基
質、亜ニチオン（ハイドロサルフアイトナトリ
ウム）等によつて還元されていない酸化型酵素
は450nm以上に吸収極大がない。 (8) 金属含量：鉄を含む。 上記各物理化学的性質及びその他の性質につい
ては、後記実施例において詳述する。 以上の性質を有する本発明酵素ヌクレオシドオ
キシダーゼYT−１は、従来のヌクレオシドオキ
シダーゼと同様にヌクレオシドの定量に利用する
ことができる。即ち、本発明酵素はヌクレオシド
を分子状酵素を電子受容体として酸化するので、
酸素消費量の測定によりヌクレオシドの定量に利
用できる。この方法によれば、本発明酵素の利用
によりヌクレオシドを基質とする反応系やヌクレ
オシドを生成する反応系で該ヌクレオシドを測定
でき、これにより例えば5′−ヌクレオチダーゼ等
のヌクレオシドを生成する反応を触媒する酵素等
の各種酵素の活性の測定等を行ない得る。また例
えば魚介類の抽出液中のヌクレオシド量の測定に
より、該魚介類の鮮度の測定も行なうことがで
き、更に例えばヌクレオシド−5′−カルボン酸の
製造等にも有用である。 特に、本発明酵素は上記ヌクレオシドの酸化反
応と同時に、該ヌクレオシド存在下においてヌク
レオシド量に応じたラツカーゼ反応示すという該
酵素に特有の性質を有している。しかもこのラツ
カーゼ様活性はヌクレオシド量と完全に比例して
おり、従つてこの性質の利用によれば、例えばハ
イドロキノンのような代表的ラツカーゼ基質を酸
化させることができる他、ポリポラス・ベルシカ
ラー（Polyporus versicolor）起源のラツカーゼ
のように、４−アミノアンチリンとフエノールや
アニリン系の物質等を酸化的にカツプリングさせ
てキノンイミン等の色素を生成させるとができ、
この色素生成量の測定によつてヌクレオシド量を
定量することができる。更に本発明酵素の利用に
よれば、ヌクレオシドを遊離させる酵素反応の初
速度を分光光学的に正確且つ簡便に測定すること
ができる。 本発明は上記本発明酵素に特有のラツカーゼ活
性を利用した新しい被検波の検定方法をも提供す
るものある。 この検定方法につき、詳述すれば、該方法はヌ
クレオシドを含有するか又はこれを生成させる系
を被検波とし、酸化により発色する発色試薬と上
記被検波との混合物に本発明のヌクレオシドオキ
シダーゼYT−１を作用させ、被検波のヌクレオ
シド量変化に比例する上記発色試薬の発色度合を
測定することにより実施される。 上記において用いられる被検波は、ヌクレオシ
ドを含有するか又はこれを遊離、生成させる系
（ヌクレオシド生成、遊離酵素反応系）であれば
いずれでもよい。上記被検波の代表例としては以
下の各液を例示できる。 (1) 5′−IMP、5′−AMP等の5′−ヌクレオチドに
5′−ヌクレオチダーゼを作用させてイノシン、
アデノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素
活性測定用試料液 (2) 3′−IMP、3′−AMP等の3′−ヌクレオチドに
3′−ヌクレオチダゼを作用させてイノシン、ア
デノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素活
性測定用試料液 (3) 生体成分の分解によつてヌクレオシドを生じ
これを含む例えば鮮魚、獣肉等の鮮度測定用試
料液 (4) RNA、DNA、オリゴヌクレオチド等にリボ
ヌクレアーゼやデオキシリボヌクレアーゼを作
用させ、生じるヌクレオシドに更にアルカリフ
オスフアターゼ等を作用させてヌクレオシドを
遊離させるリボヌクレアーゼやデオキシリボヌ
クレアーゼの活性測定用試料液 (5) アデノシン、デオキシウリジン、キサントシ
ン、チミジン、ウリジン、グアノシン、シチジ
ン、デオキシイノシン等のヌクレオシドの試薬
試料液 (6) イノシナーゼ等のヌクレオシドを基質としこ
れを加水分解する酵素の活性測定用試料液。 上記の内で特に、(1)に記載の酵素活性測定用試
料液、即ちヌクレオシド遊離酵素反応系として
は、人血清とヌクレオチドとを含有する系を具体
例として例示でき、該系に対して本発明の検定法
を実施する時には、上記人血清中の5′−ヌクレオ
チダーゼ活性が測定され、これは肝機能検査法と
して非常に有用である。しかして、従来上記人血
清中の5′−ヌクレオチダーゼの活性測定法として
は、5′−AMPを基質として遊離する無機リンを
測定する方法やアデノシンデアミナーゼ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼを利用した酵素法等が知
られているが、上記無機リンを測定する方法は、
反応時間が長く、操作が複雑であり、共存するア
ルカリフオスフアターゼ活性の補正が必要である
等の欠点があり、また上記酵素法でも測定系が複
雑であり、反応開始前に30分程度の予備反応が必
要である等の欠点があつたが、本発明検定法によ
れば非常に簡単な操作で、従来法より感度よく、
しかも通常約２〜５分程度の非常に短時間で、目
的とする人血清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を
測定することができる。 また、本発明検定法において用いられる酸化に
より発色する発色試薬としては、単独の化合物で
酸化されて可視部に吸収を示す試薬及び２種以上
の化合物の組合せで酸化されて縮合し可視部に吸
収を示す試薬が包含される。上記単独化合物の例
としては、各種のラツカーゼ基質、例えばｏ−ト
リジン、ｏ−トルイジン、ｏ−ジアニシジン、10
−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−10−Ｈ−フエノチアジン、ビス〔３−ビス
（４−クロロフエニル）−メチル−４−ジメチルア
ミノフエニル〕アミン等のアニリン系物質等を例
示できる。また、上記２種以上の化合物の組合せ
としては、従来より臨床診断薬として汎用されて
いる４−アミノアンチピリン及びフエノールで代
表されるように、所謂カツプラーとトリンダ試薬
（水素供与体）との組合せを挙げることができる。
上記カツプラーの具体例としては、４−アミノア
ンチピリン（４−AA）の他、２，６−ジブロモ
アミノフエノール、３−メチル−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン等を、またトリンダー試薬（水素
供与体）の具体例としては、フエノールの他、β
−クロロフエノール、２，４−ジクロロフエノー
ル、２，６−ジクロロフエノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン（DMA）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−ｍ−アニ
シジン（ADOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルフオプロピル）−アニリン
（ALOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルフオプロピル）−ｍ−トルイジン
（TOOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピル）
−ｍ−アニシジン（ADPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルフオプロピルアニリン（ALPS）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルフオプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン・ナトリウム塩（DAPS）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルルフオプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム
塩（DAOS）、Ｎ−スルフオプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン（HDAPS）、Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルフオプロピル）−３，５−ジメ
トキシアニリン（HDAOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−３，
５−ジメチルアニリン（MAOS）、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルフオプロピル−３，５−ジメチルアニリ
ン（MAPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピ
ル−ｍ−トルイジン（TOPS）、N2−エチル−N2
−（３−メチルフエニル）−N′−アセチルエチレ
ンジアミン（EMAE）等を例示できる。 本発明検定法によれば、まず上記被検液と発色
試薬との混合物に本発明酵素を作用させる。これ
は通常被検液に発色試薬を添加し、更に本発明酵
素を添加するか又は発色試薬に本発明酵素を添加
した液に、被検液を添加し、その後混合物を所定
温度下に所定時間放置することにより実施され、
かくして酵素反応によつて、発色試薬の発色が認
められる。上記において、被検液は適当に希釈し
て利用できる。ここで用いられる希釈液としては
例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の各種
の緩衝液や水等を例示できる。また、上記酵素反
応系における各試薬の使用量は、任意に決定され
特に限定されるものではないが、通常発色試薬は
反応系における度が約0.1〜10mM程度の範囲と
なる量で、本発明酵素は反応液１ml当たり約0.05
〜10ユニツトの範囲で、また被検液は該液中のヌ
クレオシド濃度が反応液において約０〜0.2mM
以下の濃度の範囲となる量でそれぞれ用いられる
のが好適である。また酵素反応系の反応条件は、
特に制限限されるものではないが、通常約20〜40
の温度条件を採用するのがよく、反応時間は使用
する本発明酵素の量、反応温度、PH等に応じて適
宜決定でき、一般には非常に短く、約20分以内で
反応は完結する。更に上記酵素反応系のPHは通常
約３〜10の範囲内であれば充分に良好に反応は進
行するが、一般にはPH約４〜８の範囲とするのが
好適である。 本発明方法では次いで上記酵素反応混合液の発
色度合を測定することによつて被検液のヌクレオ
シド量変化を測定することができる。この発色度
合の測定は、通常の方法に従つて、酵素反応によ
り生じる色素等の可視部に吸収を示す物質の該可
視部吸収を分光学的に測定することにより行ない
得る。例えば４−アミノアンチピリンとフエノー
ルとからキノンイミン色素を生成する系では分光
光度計を用いて、500nmの吸光度を測定すること
により、その発色度合を測定できる。その他の系
の代表例及び之等各系における吸光度測定の実例
は後記実施例において詳述する。 更に本発明の上記分析法において、被検液とし
てヌクレオシドを遊離させる酵素反応系、例えば
ヌクレオチダーゼ等を含有する液を用いる場合
は、上記本発明酵素による反応を分光光度計のセ
ル中で行ない、単位時間当たりの吸光度の増加を
求めることによつて、上記ヌクレオチダーゼ等の
酵素活性を測定することもできる。 以上の通り、本発明によれば本発明酵素を利用
してなる、ヌクレオシドの定量やヌクレオシドを
生成、遊離する系等における各種酵素の活性測定
に極めて有効な新しい分析法が提供される。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例
を挙げる。 尚、ヌクレオシドオキシダーゼ活性は、以下の
方法により測定した。 ＜ヌクレオシドオキシダーゼ活性測定法＞ 7mMイノシンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
6.0）１mlを酵素電極のセルルに入れ、酵素標品
5μを添加し、25℃において酵素消費の初速度
を測定する。即ち、25℃における飽和浴存酸素量
約250μMからの溶存酸素量の減少を酸素電極に
より経時的に測定し、１分間当たり1μモルの酸
素を消費させた場合を１ユニツト(U)とする。 実施例 １ シユードモナス マルトフイリアLB−86
（Pseudomonas maltophilia LB−86、微工研菌
寄第9813号）を、ブイヨン培地（肉エキス１％、
ペプトン１％及びNaCl0.5％、以下同じ）100ml
を500ml容の坂口フラスコに入れたものに接種し、
25℃で12時間振盪培養（110rpm）して種培養物
を得る。 得られた種培養物を、予め10容量のジヤーフ
アーメンターに殺菌した６のブイヨン培地及び
消泡剤「アデカノール」（旭電化工業社製）0.07
％を添加したものの中に接種（接種量：２％）す
る。培養温度25℃、撹拌250rpm、通気量６／
分の条件で12時間培養し、培養終了後、集菌し、
１のリン酸緩衝液（PH6.0）に菌体を懸濁させ、
20KHz、200Wの条件で15分間超音波処理を行な
う。かくして菌体抽出液を得る。 このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、
1.2U／mlであつた。 実施例 ２ シユードモナス マルトフイリアLB−86（微工
研菌寄第9813号）を、ブイヨン培地100mlを500ml
容の坂口フラスコに入れたものに接種し、25℃で
12時間振盪培養（110rpm）して種培養物を得る。 得られた種培養物を、予め500ml容量の坂口フ
ラスコに殺菌した100mlの酵母エキス・グルコー
ス培地（酵母エキス2.5％、グルコース３％、
KCl0.1％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O0.05
％、PH7.2）を入れたものの中に接種（接種量：
２％）する。培養温度25℃、撹拌110rpmの条件
で24時間培養し、培養終了後、集菌し、フラスコ
１本当たり30mlのリン酸緩衝液（PH7.0）に菌体
を懸濁させ、以後実施例１と同条件下に超音波処
理を行なう。かくして菌体抽出液を得る。 このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、
7.0U／mlであつた。 実施例 ３ 実施例２と同様にして得られた菌体抽出液272
mlに、20％ストレプトマイシン硫酸塩60mlを添加
して生じた沈澱を遠心除去した後、硫安を35％飽
和になるように添加する。生じた沈澱を除去した
後、更に硫安を60％飽和になるまで添加する。冷
所に一夜放置して沈澱を生成させた後、これを集
め、20mMリン酸緩衝液（PH6.0）に溶解させる。
これとを透析チユーブに入れ、一日透析した後、
予め20mMリン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化した
DEAE−トヨパール650Mカラム（トーソー社製）
にかけ、同緩衝液で充分洗浄後、食塩０〜0.5M
リニアグラジエントにて溶出させる。 活性画分を分画分子量20000のアミコン膜（ア
ミコン社製）を用いて濃縮し、更に20mMリン酸
緩衝液（PH6.0）で平衡化したセフアクリールＳ
−200カラム（フアルマシア社製）にチヤージし
てゲル過を行なう。溶出してくる活性画分を集
め、再び分画分子量20000のアミコン膜で濃縮し、
セフアクリールＳ−200によるゲル過を繰返す。 上記で溶出してくる活性画分を集め、凍結乾燥
を行なうことにより、精製ヌクレオシドオキシダ
ーゼYT−１を得る。 この精製品は、デイスク電気泳動的に単一であ
つた。 上記、精製結果をまとめて下記第１表に示す。
新しい酵素、詳しくはヌクレオシドと分子状酸素
との反応よつてヌクレオシド−5′−アルデヒドを
経てヌクレオシド−5′−カルボン酸を生成する
が、過酸化水素は副生しない新規ヌクレオシドオ
キシダーゼYT−１及び該酵素を利用した新規な
分析法に関する。 従来の技術 ヌクレオシドに作用する酵素としては、その加
水分解酵素や脱アミノ酵素と共に、次式に示され
る酸化反応を触媒する酵素（ヌクレオシドオキシ
ダーゼ）が知られている。 上記ヌクレオシドオキシダーゼは、従来より例
えば代表的にはシユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida等の微生物から単離、精
製され、ヌクレオシド−5′−カルボン酸類の製造
や、ヌクレオシド類の定量、更には反応によつて
ヌクレオシドが生成したり減少したりする酵素類
の活性測定系等に種々利用されている。 しかるに、オキシダーゼの利用によれば酸化反
応系においてH2O2の発生が必然的に起こり、例
えば上記ヌクレオシド−5′−カルボン酸類の製造
においては、反応系にカタラーゼ等を添加して上
記H2O2を分解させる必要があり、また上記反応
系内に生成するH2O2量の測定によつてヌクレオ
シドを測定、定量する方法では、パーオキシダー
ゼの利用が必須となる不利がある。しかも上記測
定法では、測定系が繁雑となる等の弊害がある
（例えば特開昭57−58883号公報、特開昭57−
68794号公報、特開昭57−94300号公報等参照）。 発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、以前から各種微生物起源等のヌ
クレオシドオキシダーゼにつき、鋭意研究を重ね
てきたが、その過程で、新たに土壌から単離した
シユードモナス属に属する一菌株が、従来のヌク
レオシドオキシダーゼとは異なる酸化反応を触媒
する酵素の産生能を有することを見出すと共に、
該酵素の単離精製、その性質等の解明に成功し、
更に該酵素の利用による新しい分析、測定技術の
開発に成功し、ここに本発明を完成するに至つ
た。 問題点を解決するための手段 即ち、本発明はヌクレオシドの酸化反応を触媒
する酵素であつて、後述する性質を有し且つ上記
ヌクレオシドと分子状酸素との反応によつてヌク
レオシド−5′−アルデヒドを経てヌクレオシド−
5′−カルボン酸を生成するが、過酸化水素は副生
しないことを特徴とする新規ヌクレオシドオキシ
ダーゼYT−１、並びにヌクレオシドを含有する
か又はこれを生成させる系を被検液とし、酸化に
より発色する発色試薬と上記検液との混合物に上
記ヌクレオシドオキシダーゼYT−１を作用さ
せ、被検液のヌクレオシド量変化に比例する上記
発色試薬の発色度合を測定するとを特徴とする被
検液の分析法に係わる。 本発明酵素の触媒する上記ヌクレオシドの酸化
反応は、次式(1)及び(2)で示され、これまで知られ
ているヌクレオシドオキシダーゼの酸化反応とは
明確に区別される。勿論、従来かかる式(1)及び(2)
で示される反応を触媒するヌクレオシドオキシダ
ーゼは全く知られていない。 また、本発明のヌクレオシドオキシダーゼYT
−１は、後記に詳述する通り、上記式で示される
該ヌクレオシドの酸化反応と同時に、該ヌクレオ
シド量に応じてラツカーゼ様活性を示すという該
酵素に特有の性質を有しており、この点において
も従来のヌクレオシドオキシダーゼとは全く異な
つている。本発明の分析法は、該酵素に特有の上
記ラツカーゼ様活性を利用して、発色試薬の発色
度合を例えば吸光度測定により行なうものであ
り、従来のヌクレオシドオキシダーゼの利用で
は、かる分析は実施できない。 以下、本発明酵素の製造法、その性質及びこれ
を利用した本発明の分析法につき順次説明する。 本発明酵素は、シユードモナス属に属する該酵
素生産菌を用いて製造できる。ここで用いられる
上記酵素の生産菌としては、例えば本発明者らが
新たに単離した以下の性質を有する菌株を例示で
きる。 菌学的性質 (A) 形態学的性質 細胞は桿菌であり、大きさは0.5×1.5〜
1.7μmである。 運動性を有し、ベん毛は極べん毛である。 胞子は形成されない。 グラム染色においては陰性である。 (B) 培養所見 肉汁寒天平板培養 生育は中庸であり、集落は円形で、表面は滑か
で黄色である。 肉汁寒天斜面培養 生育は中庸であり、表面は滑かで黄色である。 肉汁液体培養 表面に生育し、生育は中庸である。 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面部分に生育し、ゼラチンを液化する
（Stratiform）。 (C) 生理的性質 硝酸塩の還元 陰性 脱窒反応 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 澱粉の加水分解 陰性 硝酸塩の利用 陰性 アンモニウム塩の利用 陽性 色素の生成 蛍光色素、ピオシアニン、キサントモナジンは
いずれも生成しない。肉汁寒天培地では褐色の
拡散性色素を生産することがある。 ウレアーゼ 陰性 オキシダーゼ 陰性〜弱陽性 カタラーゼ 陽性 生育の範囲 PH4.5で生育しない。４℃及び41℃で生育しな
い。生育PHは５〜８の範囲が適当であり、温度
は35℃が最適である。 酵素に対する態度 好気性である Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法） 酸化的 糖類からの酸の生成 Ｄ−グルコス 陽性 Ｄ−フルクトース 陽性 Ｄ−マルトース 陽性 Ｄ−ガラクトース 陽性 Ｄ−キシロース 陽性 Ｄ−マンニトール 陰性 シヨ糖 陰性 乳糖 陽性 エスクリンの分解 陽性 アルギニンジヒドラーゼ 陰性 リジンデカルボキシラゼ 陽性 オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 フエニルアラニンデアミナーゼ 陰性 卵黄反応 陰性 ツイーン20の分解 陽性 〓〓 ツイーン80の分解 陽性 ポリベーターヒドロキシ酪酸の蓄積 陰性 〓〓 栄養要求性 メチオニン或いはシスチンを要求する。 以上の各性質をもとに、本菌株の検索をバージ
〔Bergey’ｓ Manual of Systematic
Bacteriology（1984）〕に従つて行なうと、本菌
株はグラム陰性の桿菌であり、胞子を形成しな
いこと、カタラーゼ陽性あること、極べん毛
で運動すること、グルコースを酸化的に分解す
ること、PH7.0の普通寒天培地によく生育する
こと等の特徴を有していることより、シユードモ
ナス属（Pseudomonas属）に属すると認められ
た。更にシスチン或いはメチオニンを生育に要
求すること、アルギニンジヒドロラーゼ陰性で
あること、ポリベーターヒドロキシ酪酸を蓄積
しないこと、コロニーが黄色であること、キ
サントモナジンを産生しないこと、オキシダー
ゼ反応が微弱であること等、シユードモナス マ
ルトフイリア（Pseudomonas maltophilia）の
特徴とよく一致した。 以上の結果より、本発明者らは本菌株をシユー
ドモナス マルトフイリアの一菌株と同定し、こ
れをシユードモナス マルトフイリアLB−86
（Pseudomonas maltophilia LB−86）と命名し
た。該菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術
研究所に上記表示にて、微工研菌寄第9813号
（FERM Ｐ−9813）として寄託された。 本発明のヌクレオシドオキシダーゼYT−１
は、上記LB−86株、その変異株等を含むシユー
ドモナス属に属し、上記ヌクレオシドオキシダー
ゼYT−１の産生能を有する微生物を培養するこ
とにより製造できる。 上記微生物の培養は、適当な栄養含有培地中で
実施できる。この培地としては、シユードモナス
属に属する微生物の培養に通常使用される各種の
炭素源、窒素源、無機物等を含有する合成培地、
半合成培地及び天然培地のいずれをも使用するこ
とができる。上記炭素源としては具体的には例え
ば高級脂肪酸、スターチ分解物（デキストリン）、
マルトース、乳糖、ブドウ糖、糖密、果糖等の微
生物が同化可能な各種炭素化合物が単独で又は２
種以上組合せて用いられる。窒素源としては、例
えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、
綿実粉、コンステイープリカー等を例示できる。
無機物としては、例えば食塩の他、カリウム、ナ
トリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄
等の無機金属リン酸塩類や硫酸塩類等の無機塩類
が必要に応じて適宜利用され得る。 上記微生物の培養は、液体培養でも、固体培養
でも実施でき、通常通気撹拌条件下に、好気的に
行なわれるのが望ましい。培地のPH、培養温度、
培養時間等の培養条件は、培養する微生物の発育
に適しており、しかも目的とする酵素の生産量を
できるだけ多くする条件から選択されるのがよ
い。例えば培地のPHは約６〜８の範囲、培養温度
は約20〜35℃の範囲から選択されるのが好適であ
る。培養時間は目的とする酵素の生産積量が最高
に達する時間を選べばよく、通常は約12〜48時間
の範囲から選択される。勿論、上記培養の各条件
や培養方法等は、用いる微生物の種類や培養のた
めの外的条件等に応じて適宜変化させ得る。 かくして得られる培養物中には、通常その菌体
区分に、目的とする酵素が蓄積される。この酵素
の採取及びその精製は、従来より微生物を利用し
て酵素等を製造する方法に採用されている通常の
各種方法に従うことができる。上記精製手段とし
ては、例えば溶媒に対する溶解性を利用する手
段、イオン結合力の差を利用する手段、分子量の
差を利用する手段、等電点の差を利用する手段、
疎水性の差を利用する手段等をそれぞれ単独で又
は適宜組合せて採用することができる。 上記菌体区分からの目的酵素の採取につき詳述
すれば、これは例えば遠心分離等の常法に従い集
めて得られる湿潤菌体を、リン酸緩衝液やトリス
緩衝液等に懸濁させ、超音波処理、フレンチプレ
ス、リゾチーム処理等の種々の菌体処理手段を適
宜組合せ採用することにより行なわれ、かくして
粗製酵素含有液を得ることができる。 上記粗製酵素含有液は、これを更に通常の方法
により精製して精製酵素標品を得ることができ
る。この精製手段としては、例えばエタノール、
アセトン等の有機溶媒による分別沈澱法、硫安、
硫酸アルミニウム等を用いた塩析法等により、ま
ず上記粗製酵素含有液から沈澱を回収し、次いで
該沈澱を、ジエチルアミノエチルデキストラン等
のイオン交換体、ポリアクリルアミドゲル等のゲ
ル過剤によるクロマトグラフイー操作に付する
ことにより実施でき、またかくして得られる精製
酵素標品は、更に凍結乾燥等の操作によつて精製
粉末標品とすることもできる。 以上のようにして得られる本発明酵素は、前記
した式(1)及び(2)で示される酸化反応を触媒する酵
素作用を有する点において特徴づけられる他、以
下に示す物理化学的性質等を有する点においても
また特徴付けられる。 (1) 基質特異性： イノシン等の各種ヌクレオシドに作用する。ヒ
ポキサンチン等の塩基、イノノシン酸等ヌクレ
オシド、リボース等には作用しない。 (2) 温度及びPH安定性： PH6.0、60℃、15分で95％以上残存し、70℃、
15分では失活する。 また、37℃、60分の処理ではPH5.0〜6.0で95％
以上残存する。 (3) 至適PH：PH5.0〜6.0である。 (4) 分子量：約130000である。 （ゲル過法による） (5) 等電点：PH5.3である。 (6) 阻害剤の影響：シアン酸カリウム、アジ化ナ
トリウムによつて阻害される。 (7) 可視部吸収：リン酸緩衝液等の中性緩衝液中
においては450nm以上に吸収極大がない。基
質、亜ニチオン（ハイドロサルフアイトナトリ
ウム）等によつて還元されていない酸化型酵素
は450nm以上に吸収極大がない。 (8) 金属含量：鉄を含む。 上記各物理化学的性質及びその他の性質につい
ては、後記実施例において詳述する。 以上の性質を有する本発明酵素ヌクレオシドオ
キシダーゼYT−１は、従来のヌクレオシドオキ
シダーゼと同様にヌクレオシドの定量に利用する
ことができる。即ち、本発明酵素はヌクレオシド
を分子状酵素を電子受容体として酸化するので、
酸素消費量の測定によりヌクレオシドの定量に利
用できる。この方法によれば、本発明酵素の利用
によりヌクレオシドを基質とする反応系やヌクレ
オシドを生成する反応系で該ヌクレオシドを測定
でき、これにより例えば5′−ヌクレオチダーゼ等
のヌクレオシドを生成する反応を触媒する酵素等
の各種酵素の活性の測定等を行ない得る。また例
えば魚介類の抽出液中のヌクレオシド量の測定に
より、該魚介類の鮮度の測定も行なうことがで
き、更に例えばヌクレオシド−5′−カルボン酸の
製造等にも有用である。 特に、本発明酵素は上記ヌクレオシドの酸化反
応と同時に、該ヌクレオシド存在下においてヌク
レオシド量に応じたラツカーゼ反応示すという該
酵素に特有の性質を有している。しかもこのラツ
カーゼ様活性はヌクレオシド量と完全に比例して
おり、従つてこの性質の利用によれば、例えばハ
イドロキノンのような代表的ラツカーゼ基質を酸
化させることができる他、ポリポラス・ベルシカ
ラー（Polyporus versicolor）起源のラツカーゼ
のように、４−アミノアンチリンとフエノールや
アニリン系の物質等を酸化的にカツプリングさせ
てキノンイミン等の色素を生成させるとができ、
この色素生成量の測定によつてヌクレオシド量を
定量することができる。更に本発明酵素の利用に
よれば、ヌクレオシドを遊離させる酵素反応の初
速度を分光光学的に正確且つ簡便に測定すること
ができる。 本発明は上記本発明酵素に特有のラツカーゼ活
性を利用した新しい被検波の検定方法をも提供す
るものある。 この検定方法につき、詳述すれば、該方法はヌ
クレオシドを含有するか又はこれを生成させる系
を被検波とし、酸化により発色する発色試薬と上
記被検波との混合物に本発明のヌクレオシドオキ
シダーゼYT−１を作用させ、被検波のヌクレオ
シド量変化に比例する上記発色試薬の発色度合を
測定することにより実施される。 上記において用いられる被検波は、ヌクレオシ
ドを含有するか又はこれを遊離、生成させる系
（ヌクレオシド生成、遊離酵素反応系）であれば
いずれでもよい。上記被検波の代表例としては以
下の各液を例示できる。 (1) 5′−IMP、5′−AMP等の5′−ヌクレオチドに
5′−ヌクレオチダーゼを作用させてイノシン、
アデノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素
活性測定用試料液 (2) 3′−IMP、3′−AMP等の3′−ヌクレオチドに
3′−ヌクレオチダゼを作用させてイノシン、ア
デノシン等のヌクレオシドを遊離させる酵素活
性測定用試料液 (3) 生体成分の分解によつてヌクレオシドを生じ
これを含む例えば鮮魚、獣肉等の鮮度測定用試
料液 (4) RNA、DNA、オリゴヌクレオチド等にリボ
ヌクレアーゼやデオキシリボヌクレアーゼを作
用させ、生じるヌクレオシドに更にアルカリフ
オスフアターゼ等を作用させてヌクレオシドを
遊離させるリボヌクレアーゼやデオキシリボヌ
クレアーゼの活性測定用試料液 (5) アデノシン、デオキシウリジン、キサントシ
ン、チミジン、ウリジン、グアノシン、シチジ
ン、デオキシイノシン等のヌクレオシドの試薬
試料液 (6) イノシナーゼ等のヌクレオシドを基質としこ
れを加水分解する酵素の活性測定用試料液。 上記の内で特に、(1)に記載の酵素活性測定用試
料液、即ちヌクレオシド遊離酵素反応系として
は、人血清とヌクレオチドとを含有する系を具体
例として例示でき、該系に対して本発明の検定法
を実施する時には、上記人血清中の5′−ヌクレオ
チダーゼ活性が測定され、これは肝機能検査法と
して非常に有用である。しかして、従来上記人血
清中の5′−ヌクレオチダーゼの活性測定法として
は、5′−AMPを基質として遊離する無機リンを
測定する方法やアデノシンデアミナーゼ、グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼを利用した酵素法等が知
られているが、上記無機リンを測定する方法は、
反応時間が長く、操作が複雑であり、共存するア
ルカリフオスフアターゼ活性の補正が必要である
等の欠点があり、また上記酵素法でも測定系が複
雑であり、反応開始前に30分程度の予備反応が必
要である等の欠点があつたが、本発明検定法によ
れば非常に簡単な操作で、従来法より感度よく、
しかも通常約２〜５分程度の非常に短時間で、目
的とする人血清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を
測定することができる。 また、本発明検定法において用いられる酸化に
より発色する発色試薬としては、単独の化合物で
酸化されて可視部に吸収を示す試薬及び２種以上
の化合物の組合せで酸化されて縮合し可視部に吸
収を示す試薬が包含される。上記単独化合物の例
としては、各種のラツカーゼ基質、例えばｏ−ト
リジン、ｏ−トルイジン、ｏ−ジアニシジン、10
−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−10−Ｈ−フエノチアジン、ビス〔３−ビス
（４−クロロフエニル）−メチル−４−ジメチルア
ミノフエニル〕アミン等のアニリン系物質等を例
示できる。また、上記２種以上の化合物の組合せ
としては、従来より臨床診断薬として汎用されて
いる４−アミノアンチピリン及びフエノールで代
表されるように、所謂カツプラーとトリンダ試薬
（水素供与体）との組合せを挙げることができる。
上記カツプラーの具体例としては、４−アミノア
ンチピリン（４−AA）の他、２，６−ジブロモ
アミノフエノール、３−メチル−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン等を、またトリンダー試薬（水素
供与体）の具体例としては、フエノールの他、β
−クロロフエノール、２，４−ジクロロフエノー
ル、２，６−ジクロロフエノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン（DMA）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−ｍ−アニ
シジン（ADOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルフオプロピル）−アニリン
（ALOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルフオプロピル）−ｍ−トルイジン
（TOOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピル）
−ｍ−アニシジン（ADPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルフオプロピルアニリン（ALPS）、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルフオプロピル−３，５−ジメトキシ
アニリン・ナトリウム塩（DAPS）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルルフオプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム
塩（DAOS）、Ｎ−スルフオプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン（HDAPS）、Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルフオプロピル）−３，５−ジメ
トキシアニリン（HDAOS）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−３，
５−ジメチルアニリン（MAOS）、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルフオプロピル−３，５−ジメチルアニリ
ン（MAPS）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピ
ル−ｍ−トルイジン（TOPS）、N2−エチル−N2
−（３−メチルフエニル）−N′−アセチルエチレ
ンジアミン（EMAE）等を例示できる。 本発明検定法によれば、まず上記被検液と発色
試薬との混合物に本発明酵素を作用させる。これ
は通常被検液に発色試薬を添加し、更に本発明酵
素を添加するか又は発色試薬に本発明酵素を添加
した液に、被検液を添加し、その後混合物を所定
温度下に所定時間放置することにより実施され、
かくして酵素反応によつて、発色試薬の発色が認
められる。上記において、被検液は適当に希釈し
て利用できる。ここで用いられる希釈液としては
例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の各種
の緩衝液や水等を例示できる。また、上記酵素反
応系における各試薬の使用量は、任意に決定され
特に限定されるものではないが、通常発色試薬は
反応系における度が約0.1〜10mM程度の範囲と
なる量で、本発明酵素は反応液１ml当たり約0.05
〜10ユニツトの範囲で、また被検液は該液中のヌ
クレオシド濃度が反応液において約０〜0.2mM
以下の濃度の範囲となる量でそれぞれ用いられる
のが好適である。また酵素反応系の反応条件は、
特に制限限されるものではないが、通常約20〜40
の温度条件を採用するのがよく、反応時間は使用
する本発明酵素の量、反応温度、PH等に応じて適
宜決定でき、一般には非常に短く、約20分以内で
反応は完結する。更に上記酵素反応系のPHは通常
約３〜10の範囲内であれば充分に良好に反応は進
行するが、一般にはPH約４〜８の範囲とするのが
好適である。 本発明方法では次いで上記酵素反応混合液の発
色度合を測定することによつて被検液のヌクレオ
シド量変化を測定することができる。この発色度
合の測定は、通常の方法に従つて、酵素反応によ
り生じる色素等の可視部に吸収を示す物質の該可
視部吸収を分光学的に測定することにより行ない
得る。例えば４−アミノアンチピリンとフエノー
ルとからキノンイミン色素を生成する系では分光
光度計を用いて、500nmの吸光度を測定すること
により、その発色度合を測定できる。その他の系
の代表例及び之等各系における吸光度測定の実例
は後記実施例において詳述する。 更に本発明の上記分析法において、被検液とし
てヌクレオシドを遊離させる酵素反応系、例えば
ヌクレオチダーゼ等を含有する液を用いる場合
は、上記本発明酵素による反応を分光光度計のセ
ル中で行ない、単位時間当たりの吸光度の増加を
求めることによつて、上記ヌクレオチダーゼ等の
酵素活性を測定することもできる。 以上の通り、本発明によれば本発明酵素を利用
してなる、ヌクレオシドの定量やヌクレオシドを
生成、遊離する系等における各種酵素の活性測定
に極めて有効な新しい分析法が提供される。 実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例
を挙げる。 尚、ヌクレオシドオキシダーゼ活性は、以下の
方法により測定した。 ＜ヌクレオシドオキシダーゼ活性測定法＞ 7mMイノシンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
6.0）１mlを酵素電極のセルルに入れ、酵素標品
5μを添加し、25℃において酵素消費の初速度
を測定する。即ち、25℃における飽和浴存酸素量
約250μMからの溶存酸素量の減少を酸素電極に
より経時的に測定し、１分間当たり1μモルの酸
素を消費させた場合を１ユニツト(U)とする。 実施例 １ シユードモナス マルトフイリアLB−86
（Pseudomonas maltophilia LB−86、微工研菌
寄第9813号）を、ブイヨン培地（肉エキス１％、
ペプトン１％及びNaCl0.5％、以下同じ）100ml
を500ml容の坂口フラスコに入れたものに接種し、
25℃で12時間振盪培養（110rpm）して種培養物
を得る。 得られた種培養物を、予め10容量のジヤーフ
アーメンターに殺菌した６のブイヨン培地及び
消泡剤「アデカノール」（旭電化工業社製）0.07
％を添加したものの中に接種（接種量：２％）す
る。培養温度25℃、撹拌250rpm、通気量６／
分の条件で12時間培養し、培養終了後、集菌し、
１のリン酸緩衝液（PH6.0）に菌体を懸濁させ、
20KHz、200Wの条件で15分間超音波処理を行な
う。かくして菌体抽出液を得る。 このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、
1.2U／mlであつた。 実施例 ２ シユードモナス マルトフイリアLB−86（微工
研菌寄第9813号）を、ブイヨン培地100mlを500ml
容の坂口フラスコに入れたものに接種し、25℃で
12時間振盪培養（110rpm）して種培養物を得る。 得られた種培養物を、予め500ml容量の坂口フ
ラスコに殺菌した100mlの酵母エキス・グルコー
ス培地（酵母エキス2.5％、グルコース３％、
KCl0.1％、KH2PO40.1％、MgSO4・7H2O0.05
％、PH7.2）を入れたものの中に接種（接種量：
２％）する。培養温度25℃、撹拌110rpmの条件
で24時間培養し、培養終了後、集菌し、フラスコ
１本当たり30mlのリン酸緩衝液（PH7.0）に菌体
を懸濁させ、以後実施例１と同条件下に超音波処
理を行なう。かくして菌体抽出液を得る。 このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、
7.0U／mlであつた。 実施例 ３ 実施例２と同様にして得られた菌体抽出液272
mlに、20％ストレプトマイシン硫酸塩60mlを添加
して生じた沈澱を遠心除去した後、硫安を35％飽
和になるように添加する。生じた沈澱を除去した
後、更に硫安を60％飽和になるまで添加する。冷
所に一夜放置して沈澱を生成させた後、これを集
め、20mMリン酸緩衝液（PH6.0）に溶解させる。
これとを透析チユーブに入れ、一日透析した後、
予め20mMリン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化した
DEAE−トヨパール650Mカラム（トーソー社製）
にかけ、同緩衝液で充分洗浄後、食塩０〜0.5M
リニアグラジエントにて溶出させる。 活性画分を分画分子量20000のアミコン膜（ア
ミコン社製）を用いて濃縮し、更に20mMリン酸
緩衝液（PH6.0）で平衡化したセフアクリールＳ
−200カラム（フアルマシア社製）にチヤージし
てゲル過を行なう。溶出してくる活性画分を集
め、再び分画分子量20000のアミコン膜で濃縮し、
セフアクリールＳ−200によるゲル過を繰返す。 上記で溶出してくる活性画分を集め、凍結乾燥
を行なうことにより、精製ヌクレオシドオキシダ
ーゼYT−１を得る。 この精製品は、デイスク電気泳動的に単一であ
つた。 上記、精製結果をまとめて下記第１表に示す。
【表】
以下、上記実施例３で得られた本発明ヌクレオ
シドオキシダーゼYT−１精製標品の性質の試験
例につき詳述する。 (1) 酵素作用試験 酸化反応生成物の検出 酵素標品10Uを、適当量の水に溶解させて透析
チユーブに入れ、7mMイノシン溶液100ml中に投
入して反応させた。 反応０分〜800分の間の適当時間にそれぞれ反
応液の一部を採取し、高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）にて分析した。該HPLCはフアイン
SIL C18（Fine SIL C18）、日本分光社製）カラム
を用い、溶媒として50mMリン酸緩衝液（PH
3.0）／メタノール＝95／５を使用し、流速1.5
ml／分として、260nmの吸光度検出を行なつた。 所定時間での結果を第１図に示す。 図においてｘ軸はリテンシヨンタイム（分）
を、ｙ軸は反応時間（インキユベーシヨンタイ
ム、分）を、ｚ軸は260nmでの吸光度を示す。 第１図より次のことが判る。即ち、経時的にイ
ノシンは減少し、これに伴つて２つのピーク（Ｐ
−１及びＰ−２）が現われ、Ｐ−１は反応の初期
に増加後、次第に減少しやがて消失し、最終的に
はＰ−２のみが残存した。 上記Ｐ−１をHPLCにより分離してヌクレオシ
ドオキシダーゼ酵素標品と反応させた所、酸素の
消費を伴つてＰ−２に変化することが確認され
た。一方、Ｐ−２は上記酵素標品との反応に供し
ても変化はなかつた。 この結果より本発明酵素標品はイノシンを酸化
してＰ−１を生成し、更に該Ｐ−１を酸化してＰ
−２を生成する作用を有することが判つた。 反応生成物の同定 −１ Ｐ−１及びＰ−２の調製 イノシン水溶液（２mg／ml）100mlに透析チユ
ーブに入れた本酵素標品100Uを投入し、通気撹
拌しながら37℃で一夜反応させ、Ｐ−２を生成さ
せた。透析チユーブを取出した後、反応液に塩酸
を添加してPH3.0とし、生じたＰ−２の結晶を遠
心分離により集めた。これをPH3.0の塩酸溶液で
洗浄し、減圧乾燥させてＰ−２の結晶約190mgを
得た。 また本酵素標品10Uを透析チユーブに入れ、上
記Ｐ−２の調製と同様にしてイノシン水溶液に投
入して反応させた。経時的に反応物を採取し、
HPLCにて分析し、Ｐ−１蓄積量が増加した時点
（37℃、約30分）で、酵素を入れた透析チユーブ
を取出し、反応を停止させた。この反応液を減圧
濃縮後、HPLCにてＰ−１画分を分離し、凍結乾
燥により精製して、Ｐ−１粉末を得た。 −２ Ｐ−１及びＰ−２の塩基成分及び糖の分
析 Ｐ−１、Ｐ−２及びイノシンをそれぞれ1N塩
酸にて100℃、１時間加水分解した。それぞれの
分解液について、含有される塩基及び糖の分析を
行なつた。 その結果、いずれの塩基成分も、薄層クロマト
グラフイー及びHPLCにおいて、ヒポキサンチン
の標準品と同一挙動を示した。このとから上記Ｐ
−１及びＰ−２の塩基成分は、共にイノシンと同
じヒポキサンチンであると同定できた。 また上記薄層クロマトグラフイーにおける糖の
分析では、イノシンの分解液からはＤ−リボース
が検出されたが、Ｐ−１及びＰ−２の分解液から
はＤ−リボースとは異なる位置にスポツトが検出
された。このことから、Ｐ−１及びＰ−２ではイ
ノシンの糖部分が酸化されていることが明らかと
なつた。 −３ Ｐ−１の同定 Ｐ−１を1.2倍当量の水素化硼素ナトリウムに
より還元した。この還元生成物を薄層クロマトグ
ラフイー及びHPLCで分析した所、その挙動はイ
ノシンの標準品と一致した。従つて、Ｐ−１の水
素化硼素ナトリウムによる還元生成物はイノシン
であると同定された。しかして、水素化硼素ナト
リウムにより還元され、基質であるイノシンに戻
り得る唯一の構造はイノシン−5′−アルデヒドの
みである。これはＰ−１の核気共鳴スペクトル及
び赤外線スペクトルによつても支持された。以上
よりＰ−１をイノシン−5′−アルデヒドと同定し
た。 −４ Ｐ−２の同定 Ｐ−２の結晶標品のC13−NMRスペクトル及
びH1−NMRスペクトルを測定した。 C13−NMRは完全カツプリング及びデカツプ
リングにて、H1−NMRはジメチルスルフオキシ
ド（DMSO−d6）中のスペクトル及びその重水
（D2O）添加後のスペクトル測定にて行なつた。 その結果、全てのシグナルは、そのケミカルシ
フト、結合定数等によつて、下記第２表のように
帰属でき、このことからＰ−２はイノシン−5′−
カルボン酸と同定できた。 第 ２ 表
シドオキシダーゼYT−１精製標品の性質の試験
例につき詳述する。 (1) 酵素作用試験 酸化反応生成物の検出 酵素標品10Uを、適当量の水に溶解させて透析
チユーブに入れ、7mMイノシン溶液100ml中に投
入して反応させた。 反応０分〜800分の間の適当時間にそれぞれ反
応液の一部を採取し、高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）にて分析した。該HPLCはフアイン
SIL C18（Fine SIL C18）、日本分光社製）カラム
を用い、溶媒として50mMリン酸緩衝液（PH
3.0）／メタノール＝95／５を使用し、流速1.5
ml／分として、260nmの吸光度検出を行なつた。 所定時間での結果を第１図に示す。 図においてｘ軸はリテンシヨンタイム（分）
を、ｙ軸は反応時間（インキユベーシヨンタイ
ム、分）を、ｚ軸は260nmでの吸光度を示す。 第１図より次のことが判る。即ち、経時的にイ
ノシンは減少し、これに伴つて２つのピーク（Ｐ
−１及びＰ−２）が現われ、Ｐ−１は反応の初期
に増加後、次第に減少しやがて消失し、最終的に
はＰ−２のみが残存した。 上記Ｐ−１をHPLCにより分離してヌクレオシ
ドオキシダーゼ酵素標品と反応させた所、酸素の
消費を伴つてＰ−２に変化することが確認され
た。一方、Ｐ−２は上記酵素標品との反応に供し
ても変化はなかつた。 この結果より本発明酵素標品はイノシンを酸化
してＰ−１を生成し、更に該Ｐ−１を酸化してＰ
−２を生成する作用を有することが判つた。 反応生成物の同定 −１ Ｐ−１及びＰ−２の調製 イノシン水溶液（２mg／ml）100mlに透析チユ
ーブに入れた本酵素標品100Uを投入し、通気撹
拌しながら37℃で一夜反応させ、Ｐ−２を生成さ
せた。透析チユーブを取出した後、反応液に塩酸
を添加してPH3.0とし、生じたＰ−２の結晶を遠
心分離により集めた。これをPH3.0の塩酸溶液で
洗浄し、減圧乾燥させてＰ−２の結晶約190mgを
得た。 また本酵素標品10Uを透析チユーブに入れ、上
記Ｐ−２の調製と同様にしてイノシン水溶液に投
入して反応させた。経時的に反応物を採取し、
HPLCにて分析し、Ｐ−１蓄積量が増加した時点
（37℃、約30分）で、酵素を入れた透析チユーブ
を取出し、反応を停止させた。この反応液を減圧
濃縮後、HPLCにてＰ−１画分を分離し、凍結乾
燥により精製して、Ｐ−１粉末を得た。 −２ Ｐ−１及びＰ−２の塩基成分及び糖の分
析 Ｐ−１、Ｐ−２及びイノシンをそれぞれ1N塩
酸にて100℃、１時間加水分解した。それぞれの
分解液について、含有される塩基及び糖の分析を
行なつた。 その結果、いずれの塩基成分も、薄層クロマト
グラフイー及びHPLCにおいて、ヒポキサンチン
の標準品と同一挙動を示した。このとから上記Ｐ
−１及びＰ−２の塩基成分は、共にイノシンと同
じヒポキサンチンであると同定できた。 また上記薄層クロマトグラフイーにおける糖の
分析では、イノシンの分解液からはＤ−リボース
が検出されたが、Ｐ−１及びＰ−２の分解液から
はＤ−リボースとは異なる位置にスポツトが検出
された。このことから、Ｐ−１及びＰ−２ではイ
ノシンの糖部分が酸化されていることが明らかと
なつた。 −３ Ｐ−１の同定 Ｐ−１を1.2倍当量の水素化硼素ナトリウムに
より還元した。この還元生成物を薄層クロマトグ
ラフイー及びHPLCで分析した所、その挙動はイ
ノシンの標準品と一致した。従つて、Ｐ−１の水
素化硼素ナトリウムによる還元生成物はイノシン
であると同定された。しかして、水素化硼素ナト
リウムにより還元され、基質であるイノシンに戻
り得る唯一の構造はイノシン−5′−アルデヒドの
みである。これはＰ−１の核気共鳴スペクトル及
び赤外線スペクトルによつても支持された。以上
よりＰ−１をイノシン−5′−アルデヒドと同定し
た。 −４ Ｐ−２の同定 Ｐ−２の結晶標品のC13−NMRスペクトル及
びH1−NMRスペクトルを測定した。 C13−NMRは完全カツプリング及びデカツプ
リングにて、H1−NMRはジメチルスルフオキシ
ド（DMSO−d6）中のスペクトル及びその重水
（D2O）添加後のスペクトル測定にて行なつた。 その結果、全てのシグナルは、そのケミカルシ
フト、結合定数等によつて、下記第２表のように
帰属でき、このことからＰ−２はイノシン−5′−
カルボン酸と同定できた。 第 ２ 表
【表】
但し、表中ｓはシングレツトを、ｄはダブレツ
トを示す。 反応の化学量論 50ナノモルのイノシンを含む100mMリン酸緩
衝液１mlに本酵素標品1Uを添加し、酸素消費量、
Ｐ−２生成量及び過酸化水素量を測定した。 その結果、イノシン50ナノモルにおける酸素消
費量51ナノモルにおいてＰ−２の47ナノモルを生
成した。また過酸化水素は検出されなかつた。 次に、100ナノモルのP1を含む100mMリン酸
緩衝液１mlに本酵素標品1Uを添加し、酸素消費
量、Ｐ−２生成量及び過酸化水素量を測定した。 その結果、Ｐ−１の100ナノモルにおける酸素
消費量48ナノモルにおいてＰ−２の97ナノモルを
生成した。この場合も過酸化水素は検出されなか
つた。 また、上記反応において、カタラーゼ1Uを添
加した場合においても、酸素消費量に差が認めら
れず、この点からも本反応においては過酸化水素
は発生しないことが明らかにされた。 以上の結果より、本発明酵素は、イノシン１モ
ル1/2モルの酸素を電子受容体として酸化して、
１モルのイノシン−5′−アルデヒドと１モルの水
とを生成し、更に１モルのイノシン−5′−アルデ
ヒドを1/2モルの酸素を電子受容体として酸化し
て、１モルのイノシン−5′−カルボン酸を生成す
ることが明らかとなつた。 (2) 酵素作用試験 １，４−ハイドロキノンを基質とした時の反
応生成物の同定と化学量論 0.5μモルのイノシン及び0.2μモルの１，４−ハ
イドロキノンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlに本酵素標品1Uを加え、室温で10分間
反応させ、反応生成物をHPLCにより分析した。 その結果、溶出位置はｐ−キノンの標準品のそ
れと一致した。 更にその紫外線スペクトルも一致した。 従つて、上記反応生成物はｐ−キノンと同定さ
れた。 また、0.06μモルのイノシン及び0.12μモルの
１，４−ハイドロキノンを含む100mMリン酸緩
衝液（PH7.0）１mlに本酵素標品1Uを加え、室温
で10分間反応させ、この時の酸素消費量を酸素電
極を用いて測定した。 その結果、酸素消費量は0.115μモルであり、こ
のうちイノシンの酸化に用いられた酸素0.06μモ
ルを差引いた値0.055μモルは、0.12μモルの１，
４−ハイドロキノンの酸化に用いられたことにな
る。 従つて、本酵素は、１モル１，４−ハイドロキ
ノンを1/2モルの酸素で酸化して、１モルのｐ−
キノンと１モルの水とを生成すると認められた。
これは即ち、従来知られているラツカーゼ
（Laccase EC 1.10.3.2）の反応に合致する。 ヌクレオシド酸化とラツカーゼ作用の関連本
酵素と１，４−ハイドロキノン等のラツカーゼ
基質を混合しても何らの反応も起こらない。し
かるに、上記反応系にイノシン、アデノシン等
のヌクレオシドを共存させるととラツカーゼ反
応が起こる。即ち、本酵素のラツカーゼ活性は
ヌクレオシドの存在を必須とするものであり、
この事実は、以下の試験により確認された。 0.06μモルのイノシン及び0.02、0.06、0.12及
び0.6μモルのいずれかの１，４−ハイドロキノ
ンを含む100mMリン酸緩衝液（PH7.0）１ml
に、本酵素1Uを作用させた。この時の酸素消
費量及びｐ−キノンの生成量を調べた結果を下
記第３表に示す。
トを示す。 反応の化学量論 50ナノモルのイノシンを含む100mMリン酸緩
衝液１mlに本酵素標品1Uを添加し、酸素消費量、
Ｐ−２生成量及び過酸化水素量を測定した。 その結果、イノシン50ナノモルにおける酸素消
費量51ナノモルにおいてＰ−２の47ナノモルを生
成した。また過酸化水素は検出されなかつた。 次に、100ナノモルのP1を含む100mMリン酸
緩衝液１mlに本酵素標品1Uを添加し、酸素消費
量、Ｐ−２生成量及び過酸化水素量を測定した。 その結果、Ｐ−１の100ナノモルにおける酸素
消費量48ナノモルにおいてＰ−２の97ナノモルを
生成した。この場合も過酸化水素は検出されなか
つた。 また、上記反応において、カタラーゼ1Uを添
加した場合においても、酸素消費量に差が認めら
れず、この点からも本反応においては過酸化水素
は発生しないことが明らかにされた。 以上の結果より、本発明酵素は、イノシン１モ
ル1/2モルの酸素を電子受容体として酸化して、
１モルのイノシン−5′−アルデヒドと１モルの水
とを生成し、更に１モルのイノシン−5′−アルデ
ヒドを1/2モルの酸素を電子受容体として酸化し
て、１モルのイノシン−5′−カルボン酸を生成す
ることが明らかとなつた。 (2) 酵素作用試験 １，４−ハイドロキノンを基質とした時の反
応生成物の同定と化学量論 0.5μモルのイノシン及び0.2μモルの１，４−ハ
イドロキノンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
7.0）１mlに本酵素標品1Uを加え、室温で10分間
反応させ、反応生成物をHPLCにより分析した。 その結果、溶出位置はｐ−キノンの標準品のそ
れと一致した。 更にその紫外線スペクトルも一致した。 従つて、上記反応生成物はｐ−キノンと同定さ
れた。 また、0.06μモルのイノシン及び0.12μモルの
１，４−ハイドロキノンを含む100mMリン酸緩
衝液（PH7.0）１mlに本酵素標品1Uを加え、室温
で10分間反応させ、この時の酸素消費量を酸素電
極を用いて測定した。 その結果、酸素消費量は0.115μモルであり、こ
のうちイノシンの酸化に用いられた酸素0.06μモ
ルを差引いた値0.055μモルは、0.12μモルの１，
４−ハイドロキノンの酸化に用いられたことにな
る。 従つて、本酵素は、１モル１，４−ハイドロキ
ノンを1/2モルの酸素で酸化して、１モルのｐ−
キノンと１モルの水とを生成すると認められた。
これは即ち、従来知られているラツカーゼ
（Laccase EC 1.10.3.2）の反応に合致する。 ヌクレオシド酸化とラツカーゼ作用の関連本
酵素と１，４−ハイドロキノン等のラツカーゼ
基質を混合しても何らの反応も起こらない。し
かるに、上記反応系にイノシン、アデノシン等
のヌクレオシドを共存させるととラツカーゼ反
応が起こる。即ち、本酵素のラツカーゼ活性は
ヌクレオシドの存在を必須とするものであり、
この事実は、以下の試験により確認された。 0.06μモルのイノシン及び0.02、0.06、0.12及
び0.6μモルのいずれかの１，４−ハイドロキノ
ンを含む100mMリン酸緩衝液（PH7.0）１ml
に、本酵素1Uを作用させた。この時の酸素消
費量及びｐ−キノンの生成量を調べた結果を下
記第３表に示す。
【表】
上記第３表より、本酵素は１モルのヌクレオシ
ドを、１モルの酸素を電子受容体として酸化させ
る場合、同時に且つ該ヌクレオシドの酸化とは別
に、酸素１モルを電子受容体としてラツカーゼ反
応を行なうことが確認される。 フエノール、４−アミノアンチピリンに対す
る作用 本酵素は、ヌクレオシド存在下に、従来知られ
ているラツカーゼ（ポリポラス ベルシカラー起
源等）と同様に、フエノールと４−アミノアンチ
ピリンとを酸化的にカツプリング反応させて、赤
色のキノンイミン色素を生成させる。この時生成
される赤色色素は、その紫外、可視吸収スペクト
ル及びHPLCによる溶出位置等において、従来の
過酸化水素存在下におけるパーオキシダーゼによ
る上記フエノール−４−アミノアンチピリンの酸
化反応により生成するキノンイミン色素と同一で
あること確認される。 上記本発明酵素によるキノンイミン色素の生成
（発色度合）とヌクレオシド量との関係を以下の
通り調べた。即ち、ヌクレオシドとしてイノシン
を用い、これを10mMフエノール及び４−アミノ
アンチピリンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
7.0）３ml中に所定濃度で添加し、該液中に1Uの
本酵素を添加して反応、発色を行なわせた。その
結果は第２図に示す通りである。 図において、横軸はイノシン濃度（ナノモル）
を、縦軸は500nmでの吸光度を示す。 第２図より、ヌクレオシド量と発色との間には
直線関係が成立しており、このことから本酵素は
上記反応を利用してヌクレオシドの比色定量に利
用できることが明らかである。 (3) 基質特異性試験 下記第４表に示す各種の化合物を基質として、
これらに対する本酵素の粗対活性（イノシンに対
する活性を100とする）を測定した。 結果を第４表に併記する。
ドを、１モルの酸素を電子受容体として酸化させ
る場合、同時に且つ該ヌクレオシドの酸化とは別
に、酸素１モルを電子受容体としてラツカーゼ反
応を行なうことが確認される。 フエノール、４−アミノアンチピリンに対す
る作用 本酵素は、ヌクレオシド存在下に、従来知られ
ているラツカーゼ（ポリポラス ベルシカラー起
源等）と同様に、フエノールと４−アミノアンチ
ピリンとを酸化的にカツプリング反応させて、赤
色のキノンイミン色素を生成させる。この時生成
される赤色色素は、その紫外、可視吸収スペクト
ル及びHPLCによる溶出位置等において、従来の
過酸化水素存在下におけるパーオキシダーゼによ
る上記フエノール−４−アミノアンチピリンの酸
化反応により生成するキノンイミン色素と同一で
あること確認される。 上記本発明酵素によるキノンイミン色素の生成
（発色度合）とヌクレオシド量との関係を以下の
通り調べた。即ち、ヌクレオシドとしてイノシン
を用い、これを10mMフエノール及び４−アミノ
アンチピリンを含む100mMリン酸緩衝液（PH
7.0）３ml中に所定濃度で添加し、該液中に1Uの
本酵素を添加して反応、発色を行なわせた。その
結果は第２図に示す通りである。 図において、横軸はイノシン濃度（ナノモル）
を、縦軸は500nmでの吸光度を示す。 第２図より、ヌクレオシド量と発色との間には
直線関係が成立しており、このことから本酵素は
上記反応を利用してヌクレオシドの比色定量に利
用できることが明らかである。 (3) 基質特異性試験 下記第４表に示す各種の化合物を基質として、
これらに対する本酵素の粗対活性（イノシンに対
する活性を100とする）を測定した。 結果を第４表に併記する。
【表】
【表】
上記第４表より、本酵素はヌクレオシドに作用
し、核酸塩基や糖単独には作用せず、ヌクレオチ
ドにも作用しないことが明らかである。 また、本酵素の作用するヌクレオシドの糖部分
はリボースでもデオキシリボースでもよく、塩基
部分も各種のものでよいことが判る。 (4) ラツカーゼ基質に対する特異性試験 本酵素の7mMイノシン存在下におけるラツカ
ーゼ様活性の基質特異性を以下の通り調べた。即
ち、イノシン7mMと共に下記第５表に示す各種
ラツカーゼ基質1mMを含む試料液に本酵素１ユ
ニツトを添加して５分間放置し、上記酵素添加前
後の試料液の吸収スペクトルを求めた。 その結果を下記第５表に示す。
し、核酸塩基や糖単独には作用せず、ヌクレオチ
ドにも作用しないことが明らかである。 また、本酵素の作用するヌクレオシドの糖部分
はリボースでもデオキシリボースでもよく、塩基
部分も各種のものでよいことが判る。 (4) ラツカーゼ基質に対する特異性試験 本酵素の7mMイノシン存在下におけるラツカ
ーゼ様活性の基質特異性を以下の通り調べた。即
ち、イノシン7mMと共に下記第５表に示す各種
ラツカーゼ基質1mMを含む試料液に本酵素１ユ
ニツトを添加して５分間放置し、上記酵素添加前
後の試料液の吸収スペクトルを求めた。 その結果を下記第５表に示す。
【表】
【表】
上記第５表よより、本酵素はイノシン存在下で
は各種ラツカーゼ基質に作用することが判る。 また、上記ラツカーゼ様活性の発現にはイノシ
ンの他、第４表に示したような各種のヌクレオシ
ドオキシダーゼの基質となるヌクレオシドなら
ば、いずれでもよいことが確認されている。 (5) 温度及びPH試験 温度安定性： 本酵素リン酸緩衝液（PH6.0）100ml中にて15分
間処理視した後、その残存活性を測定した。 その結果は、第３図（横軸＝温度、縦軸＝残存
活性）に示す通りであり、本酵素は60℃で15分間
安定であることが判る。 PH安定性： 本酵素をそれぞれのPHで37℃下に60分間処理
し、その後、PH6.0にて残存活性を測定した。 その結果は、第４図（横軸＝PH、縦軸＝残存活
性）に示す通りである。本酵素はPH５〜６で安定
であることが判る。 至適PH： 第５図（横軸＝PH、縦軸＝相対活性）に示す通
り、本酵素の至適PHは５〜６であつた。尚、第５
図中(1)は酢酸緩衝液（μ＝0.05）を、(2)はリン酸
緩衝液（μ＝0.05）を示す。 至適温度： 本酵素の活性測定に用いる酸素電極は、40℃以
上でその精度が低下し、正しい測定ができない。
40℃までの範囲では40℃で最も高い活性を示し
た。 (6) 分子量測定試験 セフアクリルＳ−200（フアルマシア社製）カラ
ム（径2.5cm×長さ90cm）を用いたゲル過法に
より、本酵素の分子量を測定した。 その結果、本酵素の分子量は130000と求められ
た。 (7) 等電点試験 キヤリアーアンホライト（PH3.5〜10.5）用い、
LKB社製焦点電気泳動装置を用いて、冷却（４
℃）下に48時間泳動を行なつて、本酵素の等電点
を求めた。 得られた本酵素の等電点はPH5.3であつた。 (8) 阻害剤の影響試験 本酵素溶液（0.02U）を各種阻害剤の存在下
に、PH6.0、25℃、10分間イノシンに作用させた
後、活性を測定した。 その結果を下記第６表に示す。
は各種ラツカーゼ基質に作用することが判る。 また、上記ラツカーゼ様活性の発現にはイノシ
ンの他、第４表に示したような各種のヌクレオシ
ドオキシダーゼの基質となるヌクレオシドなら
ば、いずれでもよいことが確認されている。 (5) 温度及びPH試験 温度安定性： 本酵素リン酸緩衝液（PH6.0）100ml中にて15分
間処理視した後、その残存活性を測定した。 その結果は、第３図（横軸＝温度、縦軸＝残存
活性）に示す通りであり、本酵素は60℃で15分間
安定であることが判る。 PH安定性： 本酵素をそれぞれのPHで37℃下に60分間処理
し、その後、PH6.0にて残存活性を測定した。 その結果は、第４図（横軸＝PH、縦軸＝残存活
性）に示す通りである。本酵素はPH５〜６で安定
であることが判る。 至適PH： 第５図（横軸＝PH、縦軸＝相対活性）に示す通
り、本酵素の至適PHは５〜６であつた。尚、第５
図中(1)は酢酸緩衝液（μ＝0.05）を、(2)はリン酸
緩衝液（μ＝0.05）を示す。 至適温度： 本酵素の活性測定に用いる酸素電極は、40℃以
上でその精度が低下し、正しい測定ができない。
40℃までの範囲では40℃で最も高い活性を示し
た。 (6) 分子量測定試験 セフアクリルＳ−200（フアルマシア社製）カラ
ム（径2.5cm×長さ90cm）を用いたゲル過法に
より、本酵素の分子量を測定した。 その結果、本酵素の分子量は130000と求められ
た。 (7) 等電点試験 キヤリアーアンホライト（PH3.5〜10.5）用い、
LKB社製焦点電気泳動装置を用いて、冷却（４
℃）下に48時間泳動を行なつて、本酵素の等電点
を求めた。 得られた本酵素の等電点はPH5.3であつた。 (8) 阻害剤の影響試験 本酵素溶液（0.02U）を各種阻害剤の存在下
に、PH6.0、25℃、10分間イノシンに作用させた
後、活性を測定した。 その結果を下記第６表に示す。
【表】
【表】
上記第６表より、本酵素は、シアン化カリウ
ム、アジ化ナトリウム、Ｎ−ブロモコハク酸イミ
ド等により阻害されることが判る。 (9) 紫外、可視吸収スペクトル分析 100mMリン酸緩衝液（PH6.0）中における本酵
素のスペクトル分析を行なつた。 その結果を第６図に示す。 (10) 金属含量 原子吸光法により測定した結果、本酵素中には
鉄が含まれていることが確認されたが、モリブデ
ン、銅、マンガン、亜鉛は検出されなかつた。 (11) 活性に及ぼす金属イオンの影響 本酵素溶液（0.02U）を各種金属イオンの存在
下に、PH6.0、25℃、10分間イノシンに作用させ
た後、活性を測定して、各種金属イオンの本酵素
活性に及ぼす影響を調べた。 その結果を下記第７表に示す。
ム、アジ化ナトリウム、Ｎ−ブロモコハク酸イミ
ド等により阻害されることが判る。 (9) 紫外、可視吸収スペクトル分析 100mMリン酸緩衝液（PH6.0）中における本酵
素のスペクトル分析を行なつた。 その結果を第６図に示す。 (10) 金属含量 原子吸光法により測定した結果、本酵素中には
鉄が含まれていることが確認されたが、モリブデ
ン、銅、マンガン、亜鉛は検出されなかつた。 (11) 活性に及ぼす金属イオンの影響 本酵素溶液（0.02U）を各種金属イオンの存在
下に、PH6.0、25℃、10分間イノシンに作用させ
た後、活性を測定して、各種金属イオンの本酵素
活性に及ぼす影響を調べた。 その結果を下記第７表に示す。
【表】
(12) Km値
イノシンに対する見掛けのKm値を求めた結果、
該Km値は4.4×10-5Mであつた。 (13) アミノ酸組成 本酵素を6N塩酸を用いて減圧下に24、48又は
72時間加水分解し、充分に塩酸を除去した後、
0.09Mクエン酸緩衝液（PH2.2に溶解させ、この
溶液について日本電子社製JLC200A型自動アミ
ノ酸分折機を用いてアミノ酸の分析を行なつた。 トリプトフアン（Trp）の含量は4.2N NaOH
にて110℃下に24時間加水分解後、同様にして測
定した。シスチン（Cys）の定量は、本酵素を過
蟻酸酸化後、塩酸分解を行なつて分析した〔S.
Moore，J.Biol.Chem.，238，235（1963）〕。 結果を下記第８表に示す。
該Km値は4.4×10-5Mであつた。 (13) アミノ酸組成 本酵素を6N塩酸を用いて減圧下に24、48又は
72時間加水分解し、充分に塩酸を除去した後、
0.09Mクエン酸緩衝液（PH2.2に溶解させ、この
溶液について日本電子社製JLC200A型自動アミ
ノ酸分折機を用いてアミノ酸の分析を行なつた。 トリプトフアン（Trp）の含量は4.2N NaOH
にて110℃下に24時間加水分解後、同様にして測
定した。シスチン（Cys）の定量は、本酵素を過
蟻酸酸化後、塩酸分解を行なつて分析した〔S.
Moore，J.Biol.Chem.，238，235（1963）〕。 結果を下記第８表に示す。
【表】
(14)デイスク電気泳動
７％ポリアクリルアミドゲル（PH9.5）を使用し、
デイビスのリン酸〔J.B.Davis，Ann.N.Y.Acad.
Sci.，121，404（1964）〕に従つて、本酵素のデイ
スク電気泳動を２本行なつた。一方は蛋白染色
を、もう一方は１mm単位で切つて活性測定を行な
い、それぞれ泳動位置を調べた。 その結果、酵素蛋白は単一バンドを示し、その
泳動位置は活性の泳動位置と一致した。 以下、本発明酵素を用いた本発明分析法の実施
例を示す。尚、以下の各例において酵素として
は、前記実施例３で得られたヌクレオシドオキシ
ダーゼYT−１精製標品を用いた。 実施例 ４ ４−アミノアンチピリン 23.4mg ５％フエノール ２ml 50mM HEPES緩衝液（PH7.5） 98ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35Uを加え、次いで種々の濃縮
のアデノシン含有被検液0.3mlを加え、混合液を
30℃で20分間反応させた後、500nmの吸光度を測
定した。 その結果は第７図に示す通りである。図におい
て縦軸は吸光度を、横軸は被検波のアデノシン濃
度（ミリモル）を示す。 第７図より、吸光度測定により被検液中のアデ
ノシンを簡便且つ良好に定量できることが判る。 実施例 ５ ４−アミノアンチピリン 23.4mg Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
フオプロピル）−３，５−ジメチルアニリン
178.7mg 50mMリン酸緩衝液（PH6.0） 100ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度のイノシン、グアノシン、デオキシアデノシン
含有被検液0.3mlを加え、混合液を30℃で20分間
反応させた後、630nmの吸光度を測定した。 その結果を第７図と同様にして、第８図（イノ
シン測定結果）、第９図（グアノシン測定結果）
及び第１０図（デオキシアデノシン測定結果）に
示す。 之等各図より、吸光度測定により被検波中の各
ヌクレオシド量を簡便且つ良好に定量できること
が判る。 実施例 ６ ４−アミノアンチピリン 23.4mg Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
フオプロピル）−ｍ−トルイジン 71.3mg グリセロール−２−リン酸・２ナトリウム
1.76ｇ MnSO4・４〜6H2O 19.4mg 50mM HEPES緩衝液（PH7.5） 100ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度の5′−ヌクレオチダーゼ含有被検液（シグマ社
製、5′−NDコントロールＥ）0.1mlを加え、次に
基質である11.5mM5′−アデニル酸（5′−AMP）
溶液0.2mlを添加し、分光光度計にて単位時間当
りの555nmの吸光度を増加を約５分間測定した。 その結果を第１１図に示す。図において縦軸は
１分間当りの吸光度の増加値を、横軸は5′−ヌク
レオチダーゼ濃度（Ｕ／）を示す。 第１１図より、吸光度測定により被検波中のヌ
クレオチダーゼ量を簡便且つ良好に定量できるこ
とが判る。 実施例 ７ ４−アミノアンチピリン 23.4mg ５％フエノール ２ml MnSO4・４〜6H2O 19.4mg 50mM HEPES緩衝液（PH7.7） 98ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度の3′−ヌクレオチダーゼ含有被検液（シグマ社
製）0.1mlを加え、次に基質である11.5mM3′−ア
デニル酸（3′−AMP）溶液0.2mlを添加し、分光
光度計にて単位時間当りの505の吸光度の増加を
約５分間測定した。 その結果を第１１図と同様にして、第１２図に
示す。 該図より、吸光度測定により被検液中のヌクレ
オチダーゼ量を簡便、迅速且つ良好に定量できる
ことが判る。 実施例 ８ 実施例６に示した発色液と同一組成の発色液
に、ヌクレオシドオキシダーゼ10μ（0.35U）
及び人血清0.1mlを加え、次に5′−AMP
（11.5mM）0.2mlを添加し、分光光度計にて
555nmの吸光度の増加を測定することにより人血
清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。 同一血清試料を用いて15回測定を繰返した結果
は下記第９表に示す通りである。
デイビスのリン酸〔J.B.Davis，Ann.N.Y.Acad.
Sci.，121，404（1964）〕に従つて、本酵素のデイ
スク電気泳動を２本行なつた。一方は蛋白染色
を、もう一方は１mm単位で切つて活性測定を行な
い、それぞれ泳動位置を調べた。 その結果、酵素蛋白は単一バンドを示し、その
泳動位置は活性の泳動位置と一致した。 以下、本発明酵素を用いた本発明分析法の実施
例を示す。尚、以下の各例において酵素として
は、前記実施例３で得られたヌクレオシドオキシ
ダーゼYT−１精製標品を用いた。 実施例 ４ ４−アミノアンチピリン 23.4mg ５％フエノール ２ml 50mM HEPES緩衝液（PH7.5） 98ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35Uを加え、次いで種々の濃縮
のアデノシン含有被検液0.3mlを加え、混合液を
30℃で20分間反応させた後、500nmの吸光度を測
定した。 その結果は第７図に示す通りである。図におい
て縦軸は吸光度を、横軸は被検波のアデノシン濃
度（ミリモル）を示す。 第７図より、吸光度測定により被検液中のアデ
ノシンを簡便且つ良好に定量できることが判る。 実施例 ５ ４−アミノアンチピリン 23.4mg Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
フオプロピル）−３，５−ジメチルアニリン
178.7mg 50mMリン酸緩衝液（PH6.0） 100ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度のイノシン、グアノシン、デオキシアデノシン
含有被検液0.3mlを加え、混合液を30℃で20分間
反応させた後、630nmの吸光度を測定した。 その結果を第７図と同様にして、第８図（イノ
シン測定結果）、第９図（グアノシン測定結果）
及び第１０図（デオキシアデノシン測定結果）に
示す。 之等各図より、吸光度測定により被検波中の各
ヌクレオシド量を簡便且つ良好に定量できること
が判る。 実施例 ６ ４−アミノアンチピリン 23.4mg Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
フオプロピル）−ｍ−トルイジン 71.3mg グリセロール−２−リン酸・２ナトリウム
1.76ｇ MnSO4・４〜6H2O 19.4mg 50mM HEPES緩衝液（PH7.5） 100ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度の5′−ヌクレオチダーゼ含有被検液（シグマ社
製、5′−NDコントロールＥ）0.1mlを加え、次に
基質である11.5mM5′−アデニル酸（5′−AMP）
溶液0.2mlを添加し、分光光度計にて単位時間当
りの555nmの吸光度を増加を約５分間測定した。 その結果を第１１図に示す。図において縦軸は
１分間当りの吸光度の増加値を、横軸は5′−ヌク
レオチダーゼ濃度（Ｕ／）を示す。 第１１図より、吸光度測定により被検波中のヌ
クレオチダーゼ量を簡便且つ良好に定量できるこ
とが判る。 実施例 ７ ４−アミノアンチピリン 23.4mg ５％フエノール ２ml MnSO4・４〜6H2O 19.4mg 50mM HEPES緩衝液（PH7.7） 98ml 計 100ml 上記組成の発色液2.0mlにヌクレオシドオキシ
ダーゼ10μ（0.35U）を加え、次いで種々の濃
度の3′−ヌクレオチダーゼ含有被検液（シグマ社
製）0.1mlを加え、次に基質である11.5mM3′−ア
デニル酸（3′−AMP）溶液0.2mlを添加し、分光
光度計にて単位時間当りの505の吸光度の増加を
約５分間測定した。 その結果を第１１図と同様にして、第１２図に
示す。 該図より、吸光度測定により被検液中のヌクレ
オチダーゼ量を簡便、迅速且つ良好に定量できる
ことが判る。 実施例 ８ 実施例６に示した発色液と同一組成の発色液
に、ヌクレオシドオキシダーゼ10μ（0.35U）
及び人血清0.1mlを加え、次に5′−AMP
（11.5mM）0.2mlを添加し、分光光度計にて
555nmの吸光度の増加を測定することにより人血
清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。 同一血清試料を用いて15回測定を繰返した結果
は下記第９表に示す通りである。
【表】
上記表より本測定法によれば、人血清中の5′−
ヌクレオチダーゼ活性を高い再現性をもつて測定
できることが明らかである。 実施例 ９ 実施例８と同様にして人血清５検体について、
5′−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。 また、比較のため同人血清検体に対して従来知
られている酵素法〔C.L.M.Arkesteijn，J.Clin，
Chem.Clin.Biochem.，Vol.14.p155−158（1976）〕
を行なつて、同酵素活性を測定した。 得られた結果（Ｕ／）を下記第10表に対比し
て示す。
ヌクレオチダーゼ活性を高い再現性をもつて測定
できることが明らかである。 実施例 ９ 実施例８と同様にして人血清５検体について、
5′−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。 また、比較のため同人血清検体に対して従来知
られている酵素法〔C.L.M.Arkesteijn，J.Clin，
Chem.Clin.Biochem.，Vol.14.p155−158（1976）〕
を行なつて、同酵素活性を測定した。 得られた結果（Ｕ／）を下記第10表に対比し
て示す。
【表】
上記表より本測定法によれば、従来の測定系が
複雑で、反応開始前に30分程度の予備反応が必要
である等の欠点を有している酵素法に代つて、人
血清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を、非常に簡
単な操作で、高感度にしかも短時間で測定できる
ことが明らかである。 実施例 10 種々の濃度のイノシンを含む100mMリン酸緩
衝液（PH6.0）２mlに、1mMo−トルイジン溶液
１mlを加え、次いでヌクレオシドオキシダーゼ
10μ（0.35U）を添加し、37℃で15分間反応さ
せ、反応液液の480nm吸光度を測定した。 得られた結果を第１３図に示す。図において縦
軸は480nmの吸光度を、横軸は反応液中のイノシ
ン量（μモル）を示す。 該図より、被検液のイノシン含有量と吸光度と
の比例関係を利用して、被検液中のイノシン量を
良好に測定できることが明らかである。 実施例 11 この例は各種デオキシリボヌクレオチドを基質
としてこれを加水分解する酸性ホオスフアターゼ
の活性測定を行なつた例である。 試験は基質としての各デオキシリボヌクレオチ
ド（10mM）を含有する0.1Mクエン酸緩衝液
（1.2mM4−アミノアンチピリン及び0.1％フエノ
ール含有、PH4.9）−Ａ液0.9mlを37℃で５分間イ
ンキユベーシヨン後、これにヌクレオシドオキシ
ダーゼ溶液（80U／ml）−Ｂ液36μを添加し、そ
の後ヒト起源酸性フオスフアターゼ（シグマ社
製）を36μ添加し、37℃で反応させた後、１分
間当りの505nmの吸光度の増加を求め、2′−デオ
キシイノシン−5′−リン酸に対する反応性を100
として、各基質に対する上記酵素の反応性を求め
ることにより実施した。 その結果を下記第11表に示す。
複雑で、反応開始前に30分程度の予備反応が必要
である等の欠点を有している酵素法に代つて、人
血清中の5′−ヌクレオチダーゼ活性を、非常に簡
単な操作で、高感度にしかも短時間で測定できる
ことが明らかである。 実施例 10 種々の濃度のイノシンを含む100mMリン酸緩
衝液（PH6.0）２mlに、1mMo−トルイジン溶液
１mlを加え、次いでヌクレオシドオキシダーゼ
10μ（0.35U）を添加し、37℃で15分間反応さ
せ、反応液液の480nm吸光度を測定した。 得られた結果を第１３図に示す。図において縦
軸は480nmの吸光度を、横軸は反応液中のイノシ
ン量（μモル）を示す。 該図より、被検液のイノシン含有量と吸光度と
の比例関係を利用して、被検液中のイノシン量を
良好に測定できることが明らかである。 実施例 11 この例は各種デオキシリボヌクレオチドを基質
としてこれを加水分解する酸性ホオスフアターゼ
の活性測定を行なつた例である。 試験は基質としての各デオキシリボヌクレオチ
ド（10mM）を含有する0.1Mクエン酸緩衝液
（1.2mM4−アミノアンチピリン及び0.1％フエノ
ール含有、PH4.9）−Ａ液0.9mlを37℃で５分間イ
ンキユベーシヨン後、これにヌクレオシドオキシ
ダーゼ溶液（80U／ml）−Ｂ液36μを添加し、そ
の後ヒト起源酸性フオスフアターゼ（シグマ社
製）を36μ添加し、37℃で反応させた後、１分
間当りの505nmの吸光度の増加を求め、2′−デオ
キシイノシン−5′−リン酸に対する反応性を100
として、各基質に対する上記酵素の反応性を求め
ることにより実施した。 その結果を下記第11表に示す。
【表】
また上記において2′−デオキシイノシン−5′−
リン酸を基質とした場合の酸性フオスフアターゼ
の検量線を以下の通り作成した。 即ち上記Ａ液に2′−デオキシイノシン−5′−リ
ン酸（10mM）を溶解し、この液0.9mlを37℃、
３分間加温した後、前記Ｂ液36μを添加し、ヒ
ト起源酸性フオスフアターゼ（シグマ製）36μ
を添加して37℃で反応させ、１分間当りの505nm
の吸光度の増加を調べた。 その結果は第１４図に示す通りであつた。 更に同様にして2′−デオキシアデノシン−5′−
リン酸を基質とした場合の酸性フオスフアターゼ
の検量線を作成した。 その結果は第１５図に示す通りであつた。 実施例 12 この例は、実施例11の方法に従い、17種のヒト
血清中の酸性フオスフアターゼ活性を求めて得ら
れた測定値を、従来性（Kind−King変法）に従
い測定した同測定値と対比した例である。 その結果は第１６図に示した通であり、両者間
の相関係数は0.973であり、有意な相関が認めら
れた。
リン酸を基質とした場合の酸性フオスフアターゼ
の検量線を以下の通り作成した。 即ち上記Ａ液に2′−デオキシイノシン−5′−リ
ン酸（10mM）を溶解し、この液0.9mlを37℃、
３分間加温した後、前記Ｂ液36μを添加し、ヒ
ト起源酸性フオスフアターゼ（シグマ製）36μ
を添加して37℃で反応させ、１分間当りの505nm
の吸光度の増加を調べた。 その結果は第１４図に示す通りであつた。 更に同様にして2′−デオキシアデノシン−5′−
リン酸を基質とした場合の酸性フオスフアターゼ
の検量線を作成した。 その結果は第１５図に示す通りであつた。 実施例 12 この例は、実施例11の方法に従い、17種のヒト
血清中の酸性フオスフアターゼ活性を求めて得ら
れた測定値を、従来性（Kind−King変法）に従
い測定した同測定値と対比した例である。 その結果は第１６図に示した通であり、両者間
の相関係数は0.973であり、有意な相関が認めら
れた。
第１図は本発明酵素作用試験に従い、イノシ
ンを基質として本酵素による酸化反応を行なつて
得られる反応生成物の高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を示す図である。第２図は本発明酵素作
用試験に従い、イノシンを基質としてフエノー
ル及び４−アミノアンチピリンの存在下に本酵素
による酸化反応を行なつて得られるキノンイミン
色素の発色度合と上記基質濃度との関係を示す図
である。第３図は本酵素の温度安定性を調べた図
である。第４図は本酵素のPH定性を調べた図であ
る。第５図は本酵素の至適PHを調べた図である。
第６図は100mMリン酸緩衝液（PH6.0）中おける
本酵素のスペクトル分析結果を示す図である。第
７図乃至第１０図は実施例４及び５に従い、各種
被検液中のヌクレオシド量と吸光度測定値との関
係を求めたグラフである。第１１図及び第１２図
は実施例６及び７に従い、各種被検波中のヌクレ
オチダーゼ量と吸光度測定値との関係を求めたグ
ラフである。第１３図は実施例10に従う測定結果
（イノシン量と吸光度測定値との関係）を求めた
グラフである。第１４図は2′−デオキシイノシン
−5′−リン酸を基質とした実施例11の検量線を示
すグラフ及び第１５図は2′−デオキシアデノシン
−5′−リン酸を基質とした同実施例の検量線を示
すグラフである。第１６図は実施例12に従う血清
中酸性フオスフアターゼ活性測定結果と従来法に
よる同結果との相関関係を示すグラフである。
ンを基質として本酵素による酸化反応を行なつて
得られる反応生成物の高速液体クロマトグラフイ
ーの結果を示す図である。第２図は本発明酵素作
用試験に従い、イノシンを基質としてフエノー
ル及び４−アミノアンチピリンの存在下に本酵素
による酸化反応を行なつて得られるキノンイミン
色素の発色度合と上記基質濃度との関係を示す図
である。第３図は本酵素の温度安定性を調べた図
である。第４図は本酵素のPH定性を調べた図であ
る。第５図は本酵素の至適PHを調べた図である。
第６図は100mMリン酸緩衝液（PH6.0）中おける
本酵素のスペクトル分析結果を示す図である。第
７図乃至第１０図は実施例４及び５に従い、各種
被検液中のヌクレオシド量と吸光度測定値との関
係を求めたグラフである。第１１図及び第１２図
は実施例６及び７に従い、各種被検波中のヌクレ
オチダーゼ量と吸光度測定値との関係を求めたグ
ラフである。第１３図は実施例10に従う測定結果
（イノシン量と吸光度測定値との関係）を求めた
グラフである。第１４図は2′−デオキシイノシン
−5′−リン酸を基質とした実施例11の検量線を示
すグラフ及び第１５図は2′−デオキシアデノシン
−5′−リン酸を基質とした同実施例の検量線を示
すグラフである。第１６図は実施例12に従う血清
中酸性フオスフアターゼ活性測定結果と従来法に
よる同結果との相関関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヌクレオシドの酸化反応を触媒する酵素であ
つて、下記性質を有し且つ上記ヌクレオシドと分
子状酸素との反応によつてヌクレオシド−5′−ア
ルデヒドを経てヌクレオシド−5′−カルボン酸を
生成するが、過酸化水素は副生しないことを特徴
とする新規ヌクレオシドオキシダーゼYT−１。 作用：ヌクレオシドの酸化反応を触媒する 基質特異性：イノシンを始めとする各種ヌクレオ
シドに作用するがヒポキサンチン等の塩基、イ
ノシン等のヌクレオチド、リボースには作用し
ない 温度及びPH安定性：PH6.0、60℃、15分で95％以
上残存し、70℃、15分で失活し、37℃、60分で
PH5.0〜6.0で95％以上残存する。 至適PH：５〜６である 等電点：PH5.3である。 ２ ヌクレオシドを含有するか又はこれを生成さ
せる系を被検液とし、酸化により発色する発色試
薬と上記被検液との混合物に請求項１に記載のヌ
クレオシドオキシダーゼYT−１を作用させ、被
検液のヌクレオシド量変化に比例する上記発色試
薬の発色度合を測定することを特徴とする被検液
の分析法。 ３ 被検液がヌクレオシドを含有する試料、ヌク
レオシドを遊離させる酵素反応系及びヌクレオシ
ドを分解させる酵素反応系から選択される請求項
２に記載の分析法。 ４ 被検液が人血清とヌクレオチドとを含有する
ヌクレオシド遊離酵素反応系であり、上記人血清
中の5′−ヌクレオチダーゼ活性が測定される請求
項２に記載の分析法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63196632A JPH0272873A (ja) | 1988-02-04 | 1988-08-05 | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 |
| EP89902177A EP0353311B1 (en) | 1988-02-04 | 1989-02-01 | Nucleoside oxidase and analytical method using same |
| DE68920659T DE68920659T2 (de) | 1988-02-04 | 1989-02-01 | Nukleosidoxidase und analytisches verfahren. |
| PCT/JP1989/000105 WO1989007137A1 (en) | 1988-02-04 | 1989-02-01 | Nucleoside oxidase and analytical method using same |
| US07/425,217 US5156955A (en) | 1988-02-04 | 1989-02-01 | Nucleoside oxidase and assay method utilizing same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-25462 | 1988-02-04 | ||
| JP2546288 | 1988-02-04 | ||
| JP63196632A JPH0272873A (ja) | 1988-02-04 | 1988-08-05 | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0272873A JPH0272873A (ja) | 1990-03-13 |
| JPH0544273B2 true JPH0544273B2 (ja) | 1993-07-05 |
Family
ID=12166691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63196632A Granted JPH0272873A (ja) | 1988-02-04 | 1988-08-05 | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0272873A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3586237B2 (ja) * | 2001-11-22 | 2004-11-10 | 株式会社東芝 | 光導波路型バイオケミカルセンサ |
| JP3682270B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2005-08-10 | 株式会社東芝 | 光導波路型グルコースセンサ |
| JP3586244B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2004-11-10 | 株式会社東芝 | 携帯型検査装置および携帯型検査システム |
| JP3730652B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2006-01-05 | 株式会社東芝 | 光導波路型グルコースセンサ |
-
1988
- 1988-08-05 JP JP63196632A patent/JPH0272873A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0272873A (ja) | 1990-03-13 |
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