KR870000509B1

KR870000509B1 - L-글루탐산 산화효소(h₂o₂생성), 그 제법 및 분석방법

Info

Publication number: KR870000509B1
Application number: KR1019830000832A
Authority: KR
Inventors: 이시가와 히테히꼬; 미사끼 히데오; 무또 나오끼
Original assignee: 도요 조조 가부시끼가이샤; 후지마 이또오
Priority date: 1982-03-02
Filing date: 1983-03-02
Publication date: 1987-03-13
Also published as: JPH0329399B2; DE3307607C2; KR840004161A; US4605615A; FR2522680B1; FR2522680A1; JPS58149677A; DE3348379C2; IT1161590B; DE3307607A1; IT8319856A0; IT8319856A1

Abstract

내용 없음.

Description

L-글루탐산 산화효소(H2O2생성), 그 제법 및 분석방법

제1도는 A7700효소의 최적 PH곡선.

제2도는 A8063효소의 최적 PH곡선.

제3도는 A7700 및 A8063효소의 열안정성 곡선.

제4도는 A7700효소의 PH안정성 곡선.

제5도는 A8063효소의 PH안정성 곡선.

제6도는 A7700 및 A8063효소를 이용한 L-글루탐산의 검정곡선(calibration curve).

제7도는 혈청 GPT의 검정곡선.

제8도는 혈청 GOT의 검정곡선.

제9도는 혈청 GPT의 검정곡선.

제10도는 혈청 GOT의 검정곡선.

제11도는 혈청 GPT 활성에서의 상관곡선(correlation curve)

제12도는 혈청 GOT 활성에서의 상관곡선

본 발명은 L-글루탐산 또는 L-글루타메이트에 대한 기질활성(substrate activity)을 가지며 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소화 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 효소작용을 갖는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성), 그의 제법 및 그를 이용한 분석방법에 관한 것이다.

이제까지 L-글루탐산에 대한 기질특성(SUbSTRATE SPECIFICITY)을 갖는 공지의 산화효소는 단지 2볼의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 2-몰의 α-게토글루탈산, 2몰의 암모니아 및 1몰의 물을 형성하는 반응을 촉진하는 효소작용을 갖는 L-(+)-글루타메이트 산화환원효소 뿐이었다.

[Biochim, Biophys. Acta, 368, 158-172(1974)]

또한, L-아미노산에 대한 기질특성을 가지며, 1몰의 아미노산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 효소작용을 갖는 L-아미노산 산화효소가 알려져 있다.

[Methods in Enzymology, Vol. Ⅱ, 204~211(1955)]

이들 공지기술에 있어서, L-(+)-글루타메이트 산화환원효소는 상술한 반응을 촉진하나 과산화수소는 생성하지 않는다. 한편, L-아미노산 산화효소는 상술한 반응을 촉진하며 따라서 과산화수소가 생성된다. 그러나 공지의 L-아미노산 산화효소 가운데에서 기질 L-글루탐산에 작용하는 효소는 보고된바 없었다.

[Methods in Enzymology, Vol. Ⅱ, 204~211(1955)]

우리는 일본 나가노껭, 사꾸시 평야의 토양시료로부터 분비된 스트렙토마이스변형 A7700(Streptomyces strain A7700) 및 일본 군마껭 아주마군 나가노하라쪼의 토마토농장의 토양시료로부터 분리된 스트렙토마이스 변형 A8063이 L-글루탐산에 대한 기질특성을 가지며 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 효소를 생성한다는 것을 발견하였으며, 상기 효소를 단단백질(single protain)로서 정제하였다. 우리는 이 효소를 "L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)"로 명명하였다.

우리는 또한 이 새로운 효소를 이용한, L-글루탐산을 함유하는 액체시료의 새로운 측정법을 알아내었다. 한편, 스트렙토마이스 변형 A7700 및 A8063의 분류학적 성질은 다음과 같다.

(A) 스트렙토마이스 변형 A7700

I. 현미경관찰

녹말-무기염 한천배양기 매체에서 30℃에서 10~15일간 배양된 것의 형태학적 관찰은 다음과 같다(오트밀 한천배양기 매체 및 이스트추출물-맥아추출물 한천배양기매체에서 배양된 것도 거의 동일하였다). 기질균사(substrate mycelia)는 만곡되어 있으며 분지와 함께 성장되고 직경은 0,5~0,6μ이며, 균사적 오이듐(mycelial oidium)이나 포자결실은 없다. 기질균사 위의 기생균사(aerial mycelia)성체는 만곡되어 있으며 단가지들과 함께 성장되고 직경은 0.6~0.8μ이며, 많은 사슬포자들을 형성한다. 포자사슬들은 2~3회권회된 나선형이거나 혹은 가끔 루우프형 또는 갈고리형이다. 포자는 타원형 또는 짧은 막대형으로 0.6~0.8×0.8~0.1μ의 크기로서 표면은 매끈하다. 편모포자 및 포자낭은 형성되지 않았다.

Ⅱ. 디아미노피멜산의 합성

전체세포분석에서 L-디아미노피멜산은 발견되나 메조형(meso-type)은 검출되지 않았다.

Ⅲ. 육안관찰

30℃에서 14일간 여러가지 매개체에서 관찰한 결과가 도표 1에 나타나 있다.

색상표시는 "Color Harmony Manual, 4th Ed., 1958 (Container Corp. of America)"를 참조하여 행하였다.

Ⅳ. 생리학적 성질

(1) 성장온도 : 20~40℃

(2) 산소요건 : 호기성

(3) 젤라틴용해성 : 양성(매우약함)

(4) 녹말가수분해 : 양성

(5) 스킴밀크 : 펩톤화-양성(약함)

응고작용-음성

(6) 멜라닌색소형성 :티로신배양기-음성

멥톤-이스트추출물-철분배양기-양성

(7) 탄소원의 이용(Utilization of Carbon sources)

양성 : L-아라비노즈, D-후럭토즈, D-글루코즈, 이노시톨, D-맨니톨, 라피노즈, L-람노즈, 수크로즈 및 D-크실로즈

[표 1]

상술하였듯이, 변형 A7700은 기질규사로부터 많은 포자사슬을 가진 기생균사를 생성하고, L-형 디아미노피멜산을 형성하며, 편모균포자와 포자낭의 형성은 없고 호기성성장을 하는 분류학적성질을 갖는데, 이는 스트립토마이스류에 속하는 것으로서 결론질 수 있다.

이것은 스트렙토마이스 에스피. A 7700(Streptomyces sp. A7700)으로 명명하여 한국과학기술원에 수탁(기탁)번호KAIST 830328-07612로서 1983년 4월 22일 기탁되었으며, 일본에서는 공업기술원 미생물공업기술연구소에 기탁번호 FERM P-6241로서 1981년 12월 4일 기탁되었다. 이것은 또한 미국농업연구국에 기탁번호 NRRL Number 15267로서 기탁되었다.

(B) 스트립토마이스 변형 A8063

I. 현미경관찰

녹말-무기염한천 배양기에서 30℃로 10~15일간 배양된 것의 형태학적 관찰은 다음과 같다(글리세롤-아스파라긴 배양기, 티로신 배양기 및 이스트추출물-맥아추출물배양기에서 배양된 것도 거의 동일하였다).

기질균사는 만곡되어 있으며 분지와 함께 성장되고 직경은 0.5~0.6μ이며 균사 오이디아(oidia)나 포자결실은 없다. 기질균사위의 기생균사 성체는 만곡되어 있으며, 단가지(simple branchings)들과 함께 성장되고 직경은 0.6~0.8이며, 많은 사슬포자를 형성한다. 포자사슬은 대부분은 루우프형, 갈고리형 또는 이중나선형이며 약간은 3중 또는 그 이상의 다중 나선형이다. 포자는 공모양으로 직경은 0.6~0.8μ이고 가시투성이의 표면을 가졌다. 편모포자 및 포자낭은 형성되지 않았다.

Ⅱ. 디아미노피멜산의 합성

전체세포분석에서 L-디아미노피멜산은 발견되나 메조형은 검출되지 않았다.

Ⅲ. 육안관찰

30℃에서 14일간 여러 매개체에서 관찰한 결과가 다음 도표 2에 나타나 있다. 색상표시는 앞서와 동일하게 행하였다.

Ⅳ. 생리학적 성질

(1) 성장온도 : 15~43℃

(2) 산소요건 : 호기성

(3) 젤라틴용해성 : 양성(약함)

(4) 녹말가수분해 : 양성

(5) 스킴밀크 : 펩톤화-양성

응고작용-음성

(6) 멜라닌색소형성 : 티로신 배양기매체 및 펩톤-이스트추출물-철분배양기매체 : 양성

(7) 탄소원의 이용

양성 : D- 후럭토즈, D-글루코즈, D-맨니톨, L-람노즈, 수크로즈

약산성 : L-아라비노즈, 이노시틀, 라피노즈, D-크실로즈

[표 2]

상술하였듯이, 변형 A8063은 기질균사로부터 많은 포자사슬을 가진 기생균사를 생성하고, L-형 디아미노피멜산을 형성하며, 편모포자와 포자낭의 형성은 없고 호기성성장을 하는 분류학적 성질을 갖는데, 이는 스트렙토마이스류에 속하는 것으로 결론질 수 있다. 이것은 스트렙토마이스 에스피. A8063(Streptomyces sp. A8063)으로 명명하여 한국과학기술원에 수탁(기탁)번호 KAIST 830328-07712로서 1983년 4월 22일 기탁 되었으며, 일본에서 공업기술원 미생물공업기술연구소에 기탁번호 FERM P-6242로서 1981년 12월 4일 기탁되었다. 이것은 또한 미국농업연구국에 기탁번호 NRRL Number 15268로서 기탁되었다.

본 발명의 새로운 효소, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)(이후부터 L-글루탐산산화효소(H₂O₂)로 약칭 함)는 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탐산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 효소이다.

우리는 L-글루탐산을 포함하는 액체시료를 L-글루탐산산화효소(H₂O₂)와 접촉시켜 이 촉매반응시스템내의 L-글루타메이트의 양에 상응하는, 소요된 산소 또는 생성된 과산화수소, 암모니아 또는 α-케토글루타레이트의 양을 정량적으로 측정함으로서 L-글루탐산을 포함하는 액체시료속에서 L-글루탐산을 검출하거나 또는 정량분석하는 방법을 발견하였다.

본 발명의 목적은 최소한 다음과 같은 생화학적 성질을 갖는 새로운 효소인 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 제공하는데 있다. 기질특성 : L-글루탐산

효소작용 : 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진함.

상기 반응을 화학식으로 표현하면 다음과 같다.

본 발명의 다른 목적은, 자양분매개체속에서 스트렙토마이스류에 속하는 미생물을 배양하여 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 생성하여 그렇게 생성된 L-글루탐산산화효소(H₂O₂)를 분리하는 것을 특징으로 하는, L-글루탐산산화효소(H₂O₂)의 생산방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 L-글루탐사나에 대한 기질특성을 가지며 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 본 발명의 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)에 L-글루탐산을 함유한 액체시료를 접촉시켜 그 반응으로부터 소요된 산소 또는 생성된 α-케토글루탈산, 암모니아 또는 과산화수소를 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 L-글루탐산의 분석방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 새로운 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는 앞서 설명한 바와같은 기질특성이나 효소작용을 갖는 것을 특징으로 하는 효소로서, 등전점(isoelectric point), km값, 최적 pH, 열안정성, pH안정성, 부가제에 의한 억제 또는 활성화등과 같은 여러 성질이 동일하며 같은 특성을 갖는 어떠한 효소도 본 발명에 속함은 분명한 것이다.

한편, 전술한바의 미생물은 단지 새로운 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 생성하는 미생물의 예시적인 것일 뿐이며, 스트렙토마이스류에 속하는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)생성 미생물은 모두 본 발명에서 사용되는 미생물에 속할 수 있는 것이다. 일반적으로 미생물변형물들은 자연적으로 또는 인위적으로 쉽게 돌연변이 되며 따라서 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 생성활성을 갖는 모든 돌연변이들은 본 발명에서 이용될 수 있는 것이다.

또한 상기 효소생성을 위하여 재결합 DNA기술에 의하여 개량된 변종들도 본 발명에서 이용될 수 있는 것이다. 이제 스트렙토마이스류에 속하는 효소생성 미생물에 의한 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 제법에 대하여 좀 더 상세히 설명한다. 스트렙토마이스류에 속하느 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂) 생성미생물은 통상 항생물질이나 효소제조를 위한 자양분매개체내에서 배양된다. 고체 또는 액체배양도 적용될 수 있으나 산업적 제법에 있어서는 침수공기포화배양(submerged aeration culture)이 더욱 바람직하다.

미생물을 위한 자양분원(nutrient sources)은 미생물배양에 사용되는 통상의 매개체들이다. 질소원(nitro gen sources)의 경우, 옥수수위스키, 강남콩분말, 펩톤, 여러가지 육류추출물, 황산암모늄, 염화암모늄, 또는 L-글루탐산과 같은 아미노산류 등과 같은 동화성 질소원들이 사용될 수 있다. 탄소원(carbon sources)의 경우, 수크로즈, 글루코즈, 후럭토즈, 몰라제스, 맥아추출물 또는 녹말가수분해물등과 같은 동화성 탄소원들이 사용될 수 있다. 또한 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 인산칼륨, 아인산칼륨 등과 같은 무기염들이나 또는 임의적으로 거품방지제등도 사용될 수 있다.

배양온도는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 제조범위 및 미생물성장에 따라 변화될 수 있으나 통상 20~35℃이며, 바람직하게는 26℃이다. 배양시간은 조건에 따라 변화될 수 있는데, 통상 50~120시간이다. 배양은 효소생성이 극대치에 달하는 시간에서 자연적으로 종결된다.

본 발명의 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는 엔도-효소(endo-enzyme)이며 세포내에서 포함된다. 본 발명의 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는, 배양된 브로우스트 (broth)부터 배양된 세포를 분리하여 젖은 세포를 인산완충액, Tris-HCl완충액 또는 디메틸글루타레이트-NaOH완충액과 같은 완충용액에 현수한 다음 프렌치 프레스, 초음파처리, 연마분쇄처리 또는 리소짐처리등의 방법으로 처리하여 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 거친용액을 얻고, 이 용액을 프로테인 및 효소를 분리정제하는 공지의 방법으로서 처리함으로서 정제된 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 얻는 것이다.

공지의 방법들은, 예를들면, 아세톤, 메타놀, 에타놀 또는 이소프로파놀과 같은 유기용매를 가함에 의한 유기용매침전, 황산암모늄을 가함에 의한 염석(salting out) 디에틸아미노에틸 셀룰로우즈나 디에틸아미노에틸 세파로즈와 같은 이온교환자를 사용한 크로마토그라피, 덱스트란-겔이나 폴리아크릴아미드겔을 사용한 겔여과 크로마토그라피등이 있다. 정제된 분말효소는 상기한 공정들을 연합적용하고 최종적으로 효소용액을 동결건조시킴에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 분석방법 및 생화학적성질은 다음과 같다.

(1) 분석방법

0.3% 4-아미노안티피린 0.3ml

퍼옥시다제(50U/ml) 0.1ml

0.2M 인산염완충액(pH7.0) 0.6ml

0.2% N,N-디메틸-m-톨루이딘 0.3ml

0.2% L-글루탐산(pH7.0) 1.5ml

증류수 0.2ml

총합 3.0ml

위의 화합물(3.0ml)을 37℃에서 수정 셀(cell)에 채우고 즉시 효소용액(50㎕)을 가하고 혼합한다. 이것을 일정온도(37℃)를 갖는 분광광도계의 셀홀더(cell-holder)에 집어넣은 다음, 효소용액을 혼합한지 2분이 지난때부터 정확히 5분간 항온처리한 다음 545nm에서의 흡수의 변화(흡광도, optical density, A545)를 측정한다. 효소의 활성은 다음 방정식에 의하여 계산된다.

L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)활성(unit/ml)=

×희석비율

(2) 기질특성

스트렙토마이스 에스피. A7700(Streptomyces sp. A7700, 이하 "A7700효소"라 칭함) 및 스트렙토마이스 에스피 A8063(Streptomyces sp. A8063, 이하 "A8063효소"라 칭함)에 의하여 생성제조된 효소들의 L-글루탐산기질 및 여러가지 다른 비교기질에 대한 상대활성(%)을 각각 측정하였다. 결과는 다음 도표 3에 있다. 도표에서 보는 바와같이 두가지 효소 모두다 L-글루탐산에 대한 고유활성(specific activity)을 가지나 다른 아미노산에 대해서는 활성을 갖지 않는다.

[표 3]

(3) 효소작용

L-글루탐산(0.5umole)이 기질로서 사용되었다. 소모된 산소, 생성된 α-게토글루탈산, 암모니아 및 과산화수소의 양을 측정하여 도표 4에 결과를 나타내었다.

[표 4]

(주) 소모된 산소는 산소전극에 의하여 측정되었다. 생성된 α-케토글루탈산은 2,4-디니트로페닐히드라진방법(KAGAKU NO RYOIKI, Supl. 33, p.99~104, "Spectrophotometry on Biochemistry", 일본)에 의하여 측정되었다. 암모니아는 인도페놀방법[J. Biol. Chem., 102, 499(1933)]에 의하여 측정되었다. 과산화수소는 퍼옥시다제-4-아미노안티피린-페놀과 함께 열량분석방법에 의하여 측정되었다. 양자 효소들은 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응(반응식(I))을 촉진한다.

(4) 등전점

A7700효소와 A8063효소의 등전점은 운반 양쪽성 전해질 pH3.5~6.0(LKB Inc.)를 이용한 등전접속방법(isoelectric focusing method)에 의하여 결정되었다. A7700효소의 등전점은 약 pH4.3이고 A8063효소의 등전점은 약 pH4.1이다.

(5) km값

L-글루탐산에 대한 두가지 효소의 km값은 각각 다음과 같다.

A7700효소 : 약 5.6×10^-4M

A8063효소 : 약 1.1×10^-3M

(6) 최적pH

글리신-HCl완충액(pH2.5~4.5), 디메틸글루타레이트-NaOH완충액(pH4~7), 인산염 완충액(pH6~8), Tris-HCl완충액(pH7~9) 및 글리신 -NaOH완충액(pH9~9.5)이 효소의 최적 pH를 결정하는데 사용되었다. A7700효소에 대한 결과는 제1도, A8063효소에 대한 결과는 제2도에 나타나 있다. 두가지 효소의 최적 pH는 5~7.5이다.

(7) 열안정성

20m의 인산염 완충액(pH7.0)에 용해된 A770효소와 A8063효소를 10분동안 여러온도에서 항온처리하고 곧바로 얼음물에서 냉각시킨 다음 그들의 잔존활성을 분석하였다. 결과는 제3도에 도시되어 있다. 두가지 효소 모두다 55℃까지는 안정하였으며 70℃에서 변성되었다.

(8) pH안정성

여러가지 완충용액속에서의 효소의 pH안정성을 측정하였다. 40mM농도의 각 완충용액에 효소를 용해시키기고 37℃에서 60분간 항온처리하고 즉시 냉각시킨 다음 각 pH에서의 잔존활성을 측정하였다. A7700효소에 대한 결과는 제4도, A8063효소에 대한 결과는 제5도에 나타나 있다. A7700효소는 pH4.5~7.5에서 안정하며 A8063효소는 pH4~7.5에서 안정함을 알 수 있다. 한편 다음의 완충용액들이 사용되었다. 글리신-HCl완충용액(pH2.5~4.5), 디메틸글루타레이트 -NaOH완충용액 (pH4~7.5), 인산염 완충용액(pH6~8), Tris-HCl완충용액(pH7~9) 및 글리신-NaOH완충용액(pH9~9.5)

(9) 금속이온의 영향

여러가지 금속이온의 영향이 다음 도표 5에 표시되어 있다. 도표에서 볼 수 있듯이, Cu⁺⁺이온을 제외한 모든 이온들이 효소활성에 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

[표 5]

(10) 계면활성제 및 다른 기질들의 영향

효소활성에 대한 여러기질들의 영향이 도표 6에 표시되어 있다. EDTA의 무영향은 두가지 효소가 모두 금속성효소(metalloenzyme)가 아님을 시사하여 준다. 또한 두가지 효소는 NaN₃와 KCN에 의하여 억제되지 아니하며, FAD 및 FMN에 의해서도 거의 영향을 받지 않는다.

[표 5]

이상에서 설명하였듯이, A7700효소 및 A8063효소는 L-글루탐산에 대한 기질특성을 가지며, 1몰의 L-글루탐산, 1몰의 산소와 1몰의 물로부터 1몰의 α-케토글루탐산, 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진시키는 새로운 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)인 것이다.

본 발명의 새로운 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는 소모된 산소, 생성된 α-케토글루탈산, 암모니아 또는 과산화수소의 양을 정량분석함에 의하여 L-글루탐산을 함유한 액체시료의 분석에 이용될 수 있다.

본 방법에 따라 분석되어지는 액체시료는 L-글루탐산을 함유한 액체시료로서 예를들면, L-글루탐산시약의 시로, L-글루탐산의 발효약, L-글루탐산을 함유한 음료수, L-글루탐산을 발생 또는 생성하는 효소반응에서의 기질을 결정하거나 또는 효소활성을 분석하기 위한 시로, 또는 L-글루탐산을 기질로서 소모하는 효소반응시스템에서의 기질을 결정하거나 또는 효소활성을 분석하기 위한 시료등을 들 수 있다.

상기한 효소반응시스템들은 예를들면 다음과 같은 것들이다. 여기서 α-KG는 α-케토글루탈산, L-GA는 L-글루탐산을 의미한다.

상기한 반응시스템들은 다만 예시적인 것들이며, 여기서 효소활성이나 기질의 양을 분석하는 것은 생성된 또는 유리된 L-글루탐산을 정량함에 의하여 결정될 수 있다.

상기한 효소반응 시스템들 역시 다만 예시적인 것일뿐이며 본 발명의 방법이 여기에 국한되는 것은 아니다. 이러한 효소반응에 있어서는, 기질로서 소모된 L-글루탐산이 효소활성의 분석을 위하여 측정된다.

본 발명의 분석방법에 있어서, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는 L-글루탐산을 함유한 액체시료와 반응하도록 하여진다. 여기서 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)는 안정한 pH완충액에 용해된 효소된 효소용액, 변성없이 효소를 유지하기 위하여 보호된 마이크로캡슐화 효소이거나 또는 수지, 폴리사카라이드 혹은 무기질 유리등과 공유결합한 부동성 효소형태일 수도 있다.

L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)의 양은 액체시료의 양, 반응시간에 따라 변화될 수 있으나 통상 바람직하게는 2~10유니트(units)이다. 높은 고유활성의 효소를 사용하는 것이 바람직하기는 하지만 효소의 최고순도가 항상 요구되는 것은 아니다. L-글루탐산을 함유한 액체시료의 양은 한정되어 있는 것이 아니며 임의적으로 희석하거나 또는 희석함이 없이 마련된다.

본 발명에 따라서, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 액체시료와 반응하도록하고, 반응혼합물을 일정온도에서 일정시간동안 항온처리(예를들면, 37℃에서 5~20분간)하면 L-글루탐산 1몰당 1몰의 산소가 소모되고, 1몰의 α-케토글루탈산, 1몰의암모니아 및 1몰의 과산화수소가 생성된다. 이들 산소, α-케토글루탈산, 암모니아 또는 과산화수소를 정량분석한다.

산소는 산소전극에 의하여 전기값(electric value)으로서 검출하는 것이 바람직하다. α-케토글루탈산은 2,4-디니트로페닐하이드라진과 함께 하이드라진방법의 색도계분석(415nm 또는 530nm에서의 흡수값)에 의하여 검출하는 것이 바람직하다. 암모니아는 암모니아 전극에 의한 전극값 또는 암모니아 이온으로 전환한 후 이온전극에 의한 전극값을 측정함에 의하여 또는 인도페놀방법(indophenol method)에 의하여 검출될 수 있다.

과산화수소는 과산화수소전극에 의하여 측정하거나 또는 과산화수소와 반응하여 검출될 수 있는 조성물을 형성하는 지시약으로 처리하여 측정할 수 있다. 지시약으로는 가시변화를 발색지시약, uv광선에 의해 형광을 형성하거나 또는 발광조성물을 형성하는 형광지시약등이 있다. 발색지시약은 과산화효소(퍼옥시다제)활성물질과 색소 선구물질을 포함하는 조성물이다. 바람직하게는 양고추냉이 과산화효소(Horse rad-dish peroxicase), 전자수용체와 페놀유도체 및 아닐린 유도체의 혼합물이 사용된다.

전자수용체(electron acceptor)는 예를들면 4-아미노안티피린, 4-아미노-3-하이드리조-5-머캡토-1,2,4-트리아졸, 2-하이드라지노벤조트리아졸, 3-메틸-2-벤조티아졸론하이드라존, 2-아미노벤조티아졸등이 있다.

페놀유도체 및 아닐린 유도체의 예들로는 페놀, 소디움 P-하이드록시벤조산, P-크로로페놀, 2,4-디-클로로페놀, 4,6-디클로로-0-크레졸, 2,4-디브로모페놀, N,N-디-메틸아닐린, N,N-디에틸아닐린, N,N-디메틸-m-톨루이딘, N,N-디에틸-m-톨루이딘, 3-메틸-N-에틸-N-하이드록시에틸아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N-아세틸에틸렌디아민, 소디움 N-에틸-N-하이드록에틸-m-톨루이딘, N-에틸-N-술포프로필-m-톨루이딘, 소디움 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘 또는 m-아세토아미노-N,N-디에틸아닐린등을 들 수 있다.

4-아미노안티피린과 페놀유도체의 발색혼합물은 500~520nm에서 측정될 수 있으며, 4-아미노안티피린과 아닐린 유도체와의 혼합물은 535~580nm에서 측정될 수 있다.

형광광도법 및 발광광도법에서의 형광기질(fluorescent substrate)의 예들로는 비스(2,4,6-트리클로로페놀)옥살레이트, 페닐티오하이단토인, 호모바닐산, 4-하이드록시 페닐아세트산, 3-메톡시티라민, 프로레틴호르데닌, 루미노모노아니온, 루시게닌 또는 와핀등이 있다. 이들 물질들은 임의로 전자수용체 및 과산화효소 활성물질과 함께 사용될 수 있다. 지시약에 있어서, 사용되는 과산화효소의 양은 통상 테스트한번당 0.1유니트이상, 바람직하게는 1~10유니트정도이다.

4-아미노안티피린과 같은 전자수용체, 페놀유도체 또는 아닐린 유도체는 반응되면 과산화수소에 비하여 각각 2몰 비율로 소모되므로, 이들 물질들은 생성되는 과산화수소의 양보다 충분히 과량이어야하며, 바람직하게는 과산화수소양의 약 5몰이상 과량인 것이 좋다. 이들 시약들은 용액상태로 혼합제조되어 L-글루탐산산화효소(H₂O₂)용액에 혼합될 수도 있고, 합성수지필름이나 여과지 위에 놓여지는 고체상(solid phase)으로 제조될 수 있다. 시료속의 L-글루탐산의 양은 산소, α-케토글루탈산, 암모니아 및 과산화수소의 정량 분석된 양의 검정곡선으로부터 산출될 수 있다. 이하 실시예와 함께 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 극한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

펩톤 0.5%, 육류추출물 0.3%, 이스트추출물 0.1% 및 맥아추출물 0.5%를 포함하는 매개체(100ml, pH7.0)를 500ml 삼각플라스크에 넣고 120℃에서 20분동안 살균시켰다. 여기에 4일배양의 스트렙토마이스 sp. A7700 FERM P-6241을 주입하고 26℃에서 4일간 배양시켰다. 원심분리기로 분리하여 얻은 배양세포들을 약절구(mortar)속에서 수정 모래로 연마한다. 효소를 20mM인산염 완충액(pH7.0)과 함께 추출하여 추출물을 수집하였다. 배양된 브로우스(broth)속의 L-글루탐산 사화효소(H₂O₂)는 0.13μ/ml로 측정되었다.

[실시예 2]

실시예 1에서 스트렙토마이스 sp. A7700 FERM P-6241 대신에 스트렙토마이스 sp. A8063 FERM P-6242를 사용하여 실험을 행하였다. 배양된 브로우스속의 L-글루탐산산화효소(H₂O₂)는 0.59μ/ml로서 측정되었다.

[실시예 3]

펩톤 0.5%, 육류추출물 0.3%, 이스트추출물 0.1% 및 맥아추출물 0.5%를 함유한 매개체 100ml를 각각 두개의 500ml 삼각플라스크에 넣고 120℃에서 20분동안 살균시켰다. 여기에 스트렙토마이스 sp. A8063 FERM P-6242를 주입하고 26℃에서 3일간 배양하였다.

이들 종자 배양물(200ml)을 미리 120℃로 20분간 살균된 30ℓ들이 발효조속에 있는 펩톤 0.5%, 육류추출물 0.3%, 이스트추출물 0.1% 및 맥아추출물 0.5%를 함유한 매개체(20ℓ, pH7.0)에 주입한 다음 26℃, 흡기량 20ℓ/min, 300rpm 교반하에서 96시간 동안 배양하였다. 배양된 브로우스를 5000rpm으로 5분간 원심분리하여 배양세포를 얻었다. 이 세포들을 20mM인산염 완충액(3ℓ, pH7.0)에 현수시키고 Dyno-Mill(상품명)로 연마시켰다. 연마된 세포를 5000rpm에서 15분간 원심분리시켜 부유용액 2.82ℓ(11200 Units)를 얻었다. 부유용액에 황산암모늄을 가하여 포화도(saturation) 0.4~0.53에서 침전되는 부분들을 수집하였다. 침전물을 20mM의 인산염 완충액(pH7.0)에 용해시키고 셀로판튜브에 채운다음 20mM인산염 완충액(pH7.0, 12ℓ)에 대하여 20분동안 투석하였다. 투석물을 DEAE-세파로즈 CL-6B로 채워진 관(50×40m/m)에 집어넣고 0~0.7M의 KCl 1차농도기울기를 갖는 20mM인산염 완충액(pH7.0)으로 용출시켰다. 0.5mM KCl (130ml, 6690 units)와 함께 용출된 부분을 6ℓ의 20mM인산염 완충액에 대하여 18시간 동안 셀로판튜브와 함께 투석시켰다. 투석물을 15ml로 진공농축시켰다. 농축물을 세파로즈 CL-6B의 관에 채우고 10mM인산염 완충액과 함께 용출시켜 용출물(80ml, 5900units)을 얻었다.

용출물을 한의여과에 의하여 8ml로까지 농축시키고 다시 세파로즈 CL-6B의 관에 채운 다음 10mM인산염 완충액(pH7.0)으로 용출시켜 용출물(60ml, 4890units)을 얻었다. 용출물을 동결건조하여 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 산출하였다(78.9ng, 58.2U/mg, 4595units).

[실시예 4]

펩톤 0.5%, 육류추출물 0.3%, 이스트추출물 0.1% 및 맥아추출물 0.5%를 함유한 매개체(pH7.0, 20ℓ)를 30ℓ들이 발효조에 넣고 120℃로 20분간 살균시켰다. 여기에 동일매개체에서 3일간 배양한 스트렙토마이스 sp. A7700 FERM P-6241의 종자배양물(200ML)을 집어넣고 26℃, 무균흡기량 20ℓ/min, 300rpm 교반하에서 96시간동안 배양시켰다. 뱅양된 브로우스를 5000rpm으로 5분간 원심분리하여 얻어진 세포를 20mM인산염 완충액(pH7.0, 3ℓ)에 현수시킨 다음 Dyno-Mill로 분쇄하였다. 분쇄된 세포들을 5000rpm에서 15분동안 원심분리시켜 부유용액 2.8ℓ(2950units)을 얻었다.

부유용액에 황산암모늄을 가하여 포화도 0.47~0.61에서 침전되는 부분들을 수집하였다. 침전물을 20mM인산염 완충액(pH7.0)에 용해시키고 셀로판 튜브속에서 20mM인산염 완충액(pH)에 대하여 20시간동안 투석하였다. 투석물을 DEAE-세파로즈 CL-6B로 채워진 관에 집어넣고 0~0.7M의 KCl 1차농도기울기를 갖는 20mM 인산염 완충액(pH7.0)으로 용출시켰다. 약 0.5M KCl에서 용출된 부분을 모아서 10mM인산염 완충액(pH7.0)에 대하여 18시간동안 셀로판 튜브를 통해 투석시켰다. 투석물을 농축시켜 세파로즈 CL-6B관에 채운다음 용출시키고 다시 용출물을 농축시켰다. 세파로즈 CL-6B 관 크로마토그라피를 반포시킨 다음 용출물을 동결건조하여 분말형태인 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 산출하였다. (22.0mg, 49.5unit/mg, 1080units)

[실시예 5]

[L-글루탐산의 정량적측정]

40mM 인산염 완충액(pH6.5)

0.03% 4-아미노안티피린

0.04% N,N-디메틸-m-틀루이딘

2μ/ml 과산화효소

2μ/ml L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)

상기한 반응혼합물(3.0ml)을 각각 1/1, 3/4, 1/2, 1/4, 1/5 및 1/10으로 희석된 10mM L-글루탐산 용액(50ul)과 혼합하고 37℃에서 10분간 항온처리하였다. 항온처리후 반응혼합물을 545nm에서 비색계(colorimeter)로 측정하였다.

결과는 제6도에 도시하였다. 두가지 효소의 결과가 각각 매우 정확히 일치하며, L-글루탐산의 양과 흡수비 사이의 관계는 매우 양호한 1차곡선을 나타낸다. 이하의 실시예들은 실시예 3에서 얻어진 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂)를 사용하여 실시한 것들이다.

[실시예 6]

[혈청 GPT의 분석]

N,N-디에틸-m-톨루이딘 3mM α-케토글루탈산 10mM

4-아미노안티피린 1.5mM Tris-HCl 완충액(pH7.5) 50mM

과산화효소 5units/ml (u/ml) L-글루탐산 산화효소(H₂O₂) 6u/ml

L-알라닌 200mM

상기한 반응혼합물(10ml)를 작은 시험관에 모아서 37℃에서 미리 항온처리하였다. 거기에 1/1, 3/4, 1/2, 1/4 및 1/10의 비율로 희석된 혈청(50ul)을 각각 가하고 37℃에서 20분동안 항온처리하였다. 0.1M맥길베인(McIlvain)완충액 (pH5.5, 2.0ml)을 가하고 545nm에서 비색계측하였다. 상기혼합물로부터 L-알라닌을 제거한 반응혼합물을 사조규준(control)으로서 사용하였다. 결과는 제7도에 도시되어 있으며, 혈청 GPT는 40가지의 혈청표본(각각 50ul)으로 실시예 8의 방법에 따라 혈청 GPT활성을 분석하였다. 또한 동일한 표본들로서 기존의 UV방법(Wako Rure Chem. Co., assay kit GPT-UV WAKO)을 사용하여 분석하였다.

두가지 방법의 결과들로부터 계산된 상관관계는 다음과 같다.

r=0.998, y=1.03x+1.6

매우 양호한 상관관계가 얻어졌으며, 그의 상관곡선은 제11도에 도시되어 있다.

[실시예 11]

40가지 혈청표본(각각 50ul)으로 실시예 9의 방법에 따라 혈청 GOT활성을 분석하였다. 또한 동일 표본들로서 기존의 UV방법을 사용하여 분석하였다. 두가지 방법의 결과들로부터 계산된 상관관계는 다음과 같이 매우 양호한 것이다.

r=0.997, y=1.01x+1.1

상관곡선은 제12도에 도시되어 있다.

Claims

스트랩토마이스류에 속하는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)산출 미생물을 자양분 매개체내에서 배양시킨 다음 거기서 생성된 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)를 분리함을 특징으로 하는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)의 제조방법.
제1항에 있어서, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)산출 미생물이 스트렙토마이스 sp. A7700 FERM P-6241을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)산출 미생물이 스트렙토마이스 sp. A8063 FERM P-6242을 특징으로 하는 제조방법.
액체 매개체 내에서, 분석하고자하는 L-글루탐산 함유시료를, L-글루탐산에 대한 기질특성을 가지며 1몰의 L-글루탐산과 1몰의 산소 및 1몰의 몰로부터 1몰의 α-케토글루탈산과 1몰의 암모니아 및 1몰의 과산화수소를 생성하는 반응을 촉진하는 L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)와 접촉반응시켜서, 소모된 산소 또는 생성된 α-케토글루탈산, 암모니아 또는 과산화수소를 정량분석함을 특징으로 하는, L-글루탐산 또는 L-글루타메이트의 분석방법.
제4항에 있어서, 과산화수소의 정량분석을 과산화수소와 반응하여 가측변화를 나타내는 지시약에 의하여 행함을 특징으로 하는 분석방법.
제5항에 있어서, 상기 지시약이 발색제, 형광제 또는 발광제임을 특징으로 하는 분석방법.
제4항에 있어서, L-글루탐산 산화효소(H₂O₂생성)가 스트렙토마이스류에 속하는 미생물로부터 산출된 효소임을 특징으로 하는 분석방법.
제4항에 있어서, L-글루탐산 함유 액체시료가 L-글루탐산을 유리하거나 또는 생성하는 효소반응 시스템의 액체시료임을 특징으로 하는 분석방법.
제8항에 있어서, 상기 효소반응시스템의 액체시료가 글루타메이트-피루베이트 전이효소 활성을 분석하기 위한 시료임을 특징으로 하는 분석방법.
제8항에 있어서, 상기 효소반응시스템의 액체시료가 글루타메이트-옥살로아세테이트 전이효소활성을 분석하기 위한 시료임을 특징으로 하는 분석방법.
제8항에 있어서, 상기 효소반응시스템의 액체시료가 펩티다제활성을 분석하기 위한 시료임을 특징으로하는 분석방법.