KR100229286B1 - 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 bcs-2 및 이로부터 생산되는 내열성 d-알라닌 아미노펩티다아제 및 l-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 - Google Patents

신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 bcs-2 및 이로부터 생산되는 내열성 d-알라닌 아미노펩티다아제 및 l-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2(Bacillus stearothermophilus BCS-2) 및 이로부터 생산되는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2는 높은 온도에서도 안정적으로 효소 촉매반응을 수행할 수 있는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 활성과 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성을 가져, D-알라닌을 함유하는 D-펩티드의 효소적 합성 및 L-아미노산과 케토산 간의 아미노기 전이 반응을 통한 다양한 L-아미노산의 효소적 합성에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2 및 이로부터 생산되는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제
본 발명은 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2 및 이로부터 생산되는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 D-알라닌 에스테르와 아미드의 아미노 말단 아미노산을 가수분해하는 효소인 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제(D-alanine aminopeptidase)와 L-아스파테이트의 아미노기를 케토산에 전이시키는 효소인 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(L-aspartate aminotransferase: EC 2.6.1.1)를 생산하는 신규 고온성 미생물 균주 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2(Bacillus stearothermophilus BCS-2) 및 이로부터 생산되는 상기 효소들에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 아미노산들은 대부분 광학활성을 나타내는 알파 탄소를 가지고 있으며, 대부분 L-구조를 가진다. D-아미노산 중 D-알라닌은 단백질에는 포함되어 있지 않으나 미생물의 세포벽이나 펩티드계 항생물질의 구성성분으로서, 산업적으로는 합성 감미료, 생리활성 펩티드, 살충제 등의 생산을 위한 중간물질로서 식품 및 의약 분야에서 널리 이용되고 있다.
D-알라닌 아미노펩티다아제는 D-알라닌 에스테르, D-알라닌 아미드, D-알라닌 함유 펩티드 등의 아미노기를 가수분해하는 기능을 가진 효소이다. D-알라닌 아미노펩티다아제는 D-알라닌 함유 펩티드에 대해 기질 특이성을 가져, 이것이 촉매하는 반응의 역반응을 이용하면, D-알라닌 함유 펩티드를 합성할 수 있다. 이 효소는 바실러스(Bacillus) 속 및 오크로박트럼(Ochrobactrum) 속에서 발견되었으며, 아사노 등(Asano et al., J. Biol. Chem., 264, 14233-14239 (1989))은 중온성 미생물로부터 상기 효소를 생산하는 균을 분리하였으며, 최근에는 이 효소의 반응기작 및 유기용매 합성에 관한 연구 결과도 보고된 바 있다(Kato et al., Biocatalysis, 3, 207-215 (1989)).
L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 아스파트산, 글루탐산, 아미노부티르산 등의 다양한 L-아미노산으로부터 아미노기를 α-케토글루타르산, α-케토이소발레르산 등의 케토산에 전이시킴으로써 다양한 L-아미노산을 합성하는 촉매 기능을 가진 효소이다(Kuramitsu et al, Biochemistry, 29, 5469-5476(1990)). L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 비교적 넓은 기질 특이성을 가지고 있어서 단일 공정으로 다양한 L-아미노산을 합성할 수 있는 특징이 있다. 상기 효소는 바실러스 속 미생물에서 주로 발견되어 왔으며(J
Figure kpo00001
ger et al., Protein Engineering, 7, 605-612(1994)), 성 등(Sung et al., J. Biol. Chem., 266, 2567-2572(1991))은 그 효소 기작과 단백질의 구조에 대해 보고하였다.
D-아미노산 함유 펩티드를 생산하는 방법으로는 화학적 합성방법과 미생물 효소를 이용하는 방법(Kato et al., Biocatalysis, 3, 207-215(1989))이 알려져 있다. 화학적 방법에 의한 합성보다 효소를 생물 촉매로서 이용할 경우, 실온 및 대기압에서도 반응이 가능하며 부반응이 없는 등 여러 가지 장점이 있다. 이러한 펩티드의 효소적 합성 공정에 있어서 가장 중요한 것이 효소이며, 효소의 안정성은 효소 전환 공정에서 매우 필요한 요인이다. 일반적으로 고온의 환경에 적응하여 증식하는 고온성 미생물은 고온 환경의 영향에 대해 적응되어 비교적 안정한 내열성 효소를 생산하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 특수한 고온 환경에서 펩티드 합성을 가능하게 하는 생물 촉매를 얻기 위해, 각지의 고온균 서식지로부터 열에 안정하여 높은 온도에서의 효소 반응이 가능할 뿐 아니라 D-아미노산 함유 펩티드에도 높은 효소 활성을 나타내는 새로운 미생물을 탐색하였다. 그 결과, 한국의 토양에서 분리된 천 여종의 고온성 미생물로부터 D-알라닌 아미노펩티다아제 활성을 나타내는 새로운 고온성 미생물을 분리해 내어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 D-알라닌을 가수분해하는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트의 아미노기를 케토산에 전이시키는 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 신규 고온성 미생물 균주 및 상기 미생물로부터 생산되는, D-알라닌 함유 펩티드의 합성에 이용될 수 있는 D-알라닌 아미노펩티다아제와, L-아미노산과 케토산으로부터 다양한 L-아미노산을 합성하는데 이용할 수 있는 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2가 생산하는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제에 의한 D-알라닌 함유 펩티드의 가수분해 아미노산 분석 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 한국 토양으로부터 분리된, 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2(Bacillus stearothermophilus BCS-2)를 제공한다.
본 발명에서는 또한 상기 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2로부터 생산되는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
D-알라닌 함유 펩티드 및 다양한 L-아미노산의 합성에 유용하게 사용할 수 있는, 본 발명의 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2의 분리 및 동정은 다음과 같다.
먼저, 전국 각지의 퇴비 제조 토양, 부식토, 하천, 폐수, 온천, 피혁 제조 공장 등지에서 채취한 토양 시료를 1.5 % 폴리펩톤(polypeptone), 0.2 % 효모 추출액(yeast extract), 0.2 % 글리세롤(glycerol), 0.2 % K2HPO4, 0.2 % KH2PO4, 0.026 % NH4Cl, 0.004 % D-비오틴(D-biotine) 및 0.06 % MgSO4를 함유하는 MY 고체 배지(pH 7.2)에 도말하여 55 ℃에서 2-3 일 배양 후, 형성된 단일 균 집락을 순수분리한다. 분리균을 MY 액체 배지에서 하루 정도 배양후 원심분리하여 얻은 균체를 0.3 mM PMSF(페닐메탄설포닐 플루오라이드)를 함유하는 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기를 이용하여 조효소액을 조제한다. 제조된 조효소액을 사용하여 5 mM D-알라닌-파라-니트로아닐라이드(D- alanine-p-nitroanilide)를 기질로 하여 55 ℃에서 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐린(p-nitroaniline)을 측정함으로써 효소 반응이 수행된 것으로 확인된 고온성 미생물 균주를 분리한다.
상기와 같이 분리된 균주의 미생물학적 특성을 조사한 결과, 상기 균주는 2 % 한천을 포함하는 MY 고체 배지에서 우유빛의 반투명한 균 집락을 형성하며, 65 ℃의 고온에서 호기적으로 생육하였고, 그램 양성이고 포자를 형성하며, 카탈라제와 옥시다아제 생성에서 양성 반응을 나타내고, 광학현미경 관찰 결과 준말단부(subterminal)에서 내생포자를 형성하는 간균으로 글루코즈를 비롯한 당류를 탄소원으로 이용하지 않는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 생리적 및 생화학적 특성 분석 결과로부터 본 발명의 미생물은 고온성 바실러스 속으로 동정하였으며, 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2(Bacillus stearothermophilus BCS-2)로 명명하였다.
본 발명에 따라 토양으로부터 분리된, D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1997년 1월 24일자 수탁번호 제 KCTC 8773P 호로 기탁되었다.
본 발명의 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2 가 생산하는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제는 상기 기술한 바와 같이 MY 액체 배지에서 하루 정도 배양후 원심분리하여 얻은 균체를 0.3 mM PMSF를 함유하는 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 균체를 파쇄하고 원심분리하여 조효소액으로 얻을 수 있다.
상기와 같이 얻어진 조효소액을 이용하여, D-알라닌 아미노펩티다아제의 경우 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 중에서 D-아미노산 함유 펩티드, 예를 들어 D-알라닌-글리신-글리신을 기질로 하여 효소 반응을 수행한 후, 가수분해에 의해 생성되는 D-알라닌의 양을 측정함으로써 그 활성을 정량할 수 있으며, L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성은 0.1 M 인산 완충액(pH 8.0) 중에서 조효소액을 L-시스테인 설피네이트, α-케토글루타르산 및 PLP와 반응시켜 효소 반응에 의해 생성된 반응 산물인 β-설피노피루베이트의 양을 측정함으로써 정량할 수 있다.
이상과 같은 본 발명의 신규 고온성 미생물로부터 생성되는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제를 이용하여 그 효소 반응의 역반응에 의해 D-알라닌으로부터 새로운 D-알라닌 함유 펩티드를 합성할 수 있으며, L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 이용하여 그 효소 반응의 역반응에 의해 L-아미노산과 케토산으로부터 다양한 L-아미노산을 합성할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 미생물의 분리 및 동정
(단계 1) 미생물의 분리
전국 각지의 퇴비 제조 토양, 부식토, 하천, 폐수, 온천, 피혁 제조 공장 등지에서 채취한 토양 시료를 1.5 % 폴리펩톤, 0.2 % 효모 추출액, 0.2 % 글리세롤, 0.2 % K2HPO4, 0.2 % KH2PO4, 0.026 % NH4Cl, 0.004 % D-비오틴 및 0.06 % MgSO4를 함유하는 MY 고체 배지(pH 7.2)에 도말하여 55 ℃에서 2-3 일 배양한 후, 형성된 단일 균 집락을 순수분리하였다. 분리된 균을 MY 액체 배지에서 하루 정도 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체를 0.3 mM PMSF를 함유하는 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기를 이용하여 조효소액을 조제하였다. 제조된 조효소액을 사용하여 5 mM D-알라닌-파라-니트로아닐라이드를 기질로 하여 55 ℃에서 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 효소 반응에 의해 생성되는 파라-니트로아닐린을 측정하여, 흡광도를 나타내는 고온성 미생물 균주를 분리하였다.
(단계 2) 미생물의 동정
단계 1에서 분리된 고온성 미생물은 2 % 한천을 포함하는 MY 고체 배지에서 우유빛의 반투명한 균 집락을 형성하였다. 65 ℃의 고온에서 호기적으로 생육가능하였으며, 그램 양성이고 포자를 형성하며, 광학현미경 관찰 결과 준말단부에서 내생포자를 형성하는 바실러스 속으로 분류되었다.
상기의 신규 고온성 미생물의 상세한 생리적 및 생화학적 특성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
생장온도 30-65 ℃
세포 모양 막대 모양
운동성 있음
내생포자 있음
그램 염색 양성
카탈라제 생성 양성
옥시다아제 생성 양성
보게스-프로스카우어 (Voges-Proskauer) 반응 음성
니트레이트 환원력 양성
글루코즈로부터의 산 생성 음성
크실로즈로부터의 산 생성 음성
만니톨로부터의 산 생성 음성
글루코즈로부터 가스 생성 음성
카세인 가수분해 강함
젤라틴 가수분해 양성
전분 가수분해 약함
pH 5.7에서의 생장 음성
7 % NaCl하에서의 생장 음성
혐기 조건에서의 생장 음성
이상의 결과로부터 본 발명의 분리균은 글루코즈를 비롯한 당류를 탄소원으로 이용하지 못하는 특성을 가지는 생리적 특성을 지닌 고온성 바실러스 속으로 동정하고 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2로 명명하였다.
이 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1997년 1월 24일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 8773P를 부여받았다.
실시예 2 : D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아 제의 활성 측정
바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2가 생산하는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성 정량을 위해, 먼저 상기 균주를 MY 액체 배지에서 하루 정도 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체를 0.3 mM PMSF를 함유하는 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄하고 원심분리하여 조효소액을 분리하였다.
(1) D-알라닌 아미노펩티다아제의 활성 정량
D-알라닌 아미노펩티다아제의 D-알라닌 함유 펩티드 분해 활성은 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 중에서 기질로서 D-알라닌 함유 펩티드인 D-알라닌-글리신-글리신(D-AlaGlyGly)을 사용하여 측정하였다. 즉, D-알라닌-글리신-글리신을 최종 농도가 3 mM이 되도록 가한 후, 55 ℃에서 효소 반응을 수행하였다. 이 효소 반응액을 100 ℃에서 3 분간 끓여 반응을 정지시키고, 원심분리에 의해 얻은 반응액을 20 mM 염산으로 10 배 희석한 후, 아미노산 분석기를 이용하여 아미노산의 분리 상태를 확인하고, 생성된 D-알라닌의 양을 D-알라닌 표준곡선에 준해 효소활성을 측정하였다.
도 1은 상기와 같이 D-알라닌 아미노펩티다아제에 의한 D-알라닌 함유 펩티드의 가수분해 아미노산을 분석한 결과로서, 여기에서 보듯이 알라닌 분리 피크가 나타나므로 본 발명의 균주에 의해 생산된 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제는 D-알라닌 함유 펩티드에 특이적으로 작용하여 아미노 말단의 아미노산을 가수분해함을 확인할 수 있다.
(2) L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성 정량
L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성을 측정하기 위한 반응액은 0.1 M 인산완충액(KPB, pH 8.0)에 5 mM L-시스테인 설피네이트, 10 mM α-케토글루타르산, 0.5 mM PLP 및 배양액 0.1 ㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제하였으며, 55 ℃에서 15 분간 효소 반응을 수행하였다. L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 의해 생성된 β-설피노피루베이트의 양은 효소 반응액 20 ㎕를 취해 0.1 ㎖의 산성 파라로사닐린(p-rosaniline)을 가하여 반응을 종결시키고, 0.98 ㎖의 증류수 및 0.1 ㎖의 0.2 % 포름알데히드(HCHO)를 첨가한 후, 37 ℃에서 30 분간 반응시켜 560 nm에서 흡광도를 측정하였다(West, P. W. and Gaeke, G. C., Anal. Chem., 28, 1816(1956)).
상기와 같이 측정된, 본 발명의 고온성 균주로부터 생산된 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 효소 활성은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
효소 효소비활성 (Units/㎎ 단백질)
D-알라닌 아미노펩티다아제 0.38
L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 0.072
실시예 3 : 여러 D-알라닌 함유 펩티드에 대한 D-알라닌 아미노펩티다아제의 가 수분해 활성 측정
실시예 2에서 D-알라닌 아미노펩티다아제의 활성 측정과 동일한 방법으로 D-알라닌 함유 펩티드, D-알라닌-글리신-글리신(D-Ala-Gly-Gly)을 기질로 하여 본 발명의 D-알라닌 아미노펩티다아제에 의해 가수분해되는 D-알라닌을 측정하였다. 즉, 효소 반응액은 상기 펩티드의 최종 농도가 3 mM이 되도록 하고, 바실러스 스테아로더모필러스의 조효소액을 단백질농도 최종 0.16 ㎎이 되도록 첨가하여 0.1 M 트리스 완충액(pH 8.0)에서 반응을 수행하였다. 실시예 2에서와 같이 효소 반응을 정지시키고 아미노산 분석기를 이용하여 아미노산의 분리 형태를 확인한 결과, D-알라닌 및 글리신 피크가 나타나, 본 발명의 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2가 생산하는 D-알라닌 아미노펩티다아제는 D-알라닌 함유 펩티드에 특이적으로 작용하는 내열성 D-알라닌 아미노펩티다아제임을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2가 생산하는 D-알라닌 아미노펩티다아제의 효소 반응의 역반응을 이용하여 D-알라닌으로부터 D-아미노산 함유 펩티드의 효소적으로 합성할 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 한국의 토양에서 분리한, 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2는 D-알라닌 함유 펩티드를 가수분해하는 D-알라닌 아미노펩티다아제 및 L-아스파테이트의 아미노기를 케토산에 전이시키는 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 생산하며, 상기 균주로부터 생산된 이들 효소는 그들이 촉매하는 반응의 역반응을 이용하여 새로운 D-알라닌 함유 펩티드 및 L-아미노산을 합성하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (3)

  1. 한국 토양에서 분리된, 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 BCS-2(Bacillus stearothermophilus BCS-2)(KCTC 8773P).
  2. 제 1항의 균주 또는 조효소액을 이용하여 D-알라닌을 포함한 아미노산들로부터 D-알라닌 함유 펩티드를 효소적으로 합성하는 방법.
  3. 제 1항의 균주 또는 조효소액을 이용하여 L-아미노산 및 케토산으로부터 새로운 L-아미노산을 효소적으로 합성하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Zentralbl Bakteriol [Naturwiss] 1979 *

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