KR100260837B1 - 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법 - Google Patents

광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 부제가수분해시켜 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함에 있어, 종래 슈도모나스속 미생물을 대신하여 새로운 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용함으로써, 광학활성을 지니는 여러 가지 생리활성물질의 제조에 유효하며, 특히 고혈압치료제의 제조원료로 사용되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 보다 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00000
Figure kpo00001
상기에서, R1은 알킬기, 아릴기, 또는 아릴알킬기, R2및R3는 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다.

Description

광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
본 발명은 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 다음 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 부제가수분해시켜 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함에 있어, 종래 슈도모나스속 미생물을 대신하여 새로운 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용함으로써, 광학활성을 지니는 여러 가지 생리활성물질의 제조에 유효하며, 특히 고혈압치료제의 제조원료로 사용되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 보다 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
화학식 1
Figure kpo00002
화학식 2
Figure kpo00003
상기에서, R1은 알킬기, 아릴기, 또는 아릴알킬기, R2및 R3는 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다.
일반적으로 상기의 화학식 1로 대표되는 광학활성을 갖는 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르는 광학활성을 지니는 여러 가지 생리활성물질의 제조에 유효하며, 특히 고혈압 치료제의 제조원료로 사용되어 온 화합물이다.
종래 이들 화합물을 제조하는 방법으로는 우선, 화학합성으로 상기 화학식 1의 라세미체를 만든 후 광학분할제를 사용하여 광학분할하는 방법이 알려지고 있으나[미국 특허 제 4,294,775 호, 미국 특허 제 4,297,282 호], 이러한 방법은 광학분할제의 가격이 비쌈에도 불구하고 광학분할제의 사용량이 많으며 분할공정이 복잡할 뿐만 아니라, 사용한 광학분할제가 불순물로 남는 등의 단점이 있어 비경제적인 문제점이 있다.
또다른 방법으로는 미생물을 이용하여 이소부틸산이나 메타크릴산을 광학활성적으로 베타하이드록시화하여 광학활성 베타 하이드록시 카본산을 만든 후 하이드록시기의 반응성을 이용하여 화학적인 방법으로 상기 화학식 1의 광학활성 화합물을 만드는 방법이 알려지고 있으나[마사미 시마자끼 등, Chem. Pharm. Bull. 30(9)3139-3146(1982)], 이 방법 또한 미생물을 이용하여 베타하이드록시 카본산을 만드는 데, 배양시간이 오래 걸리고, 베타 하이드록시 카본산을 화학반응으로 화학식 1의 화합물로 만드는 데도 고가의 시약이 소요되며 제조단계가 길어 복잡할 뿐만 아니라 시간이 오래 걸려 비경제적인 문제점이 있다.
또한, 상기와 같은 결점을 개선한 방법으로 카본산 에스테르의 라세미체를 미생물 및 효소로 부제가수분해하여 광학활성 카본산과 그 거울상 이성체 카본산 에스테르를 만드는 방법이 알려지고 있는데, 주로 슈도모나스 속의 미생물이 사용되어 왔으나[일본특허공개 평 6-32634, 일본특허공개 평 6-32635, 일본특허공개 평 4-5438, 일본특허공개 평 5-34958, 일본특허공개 소 63-202397], 이도 역시 고온에서는 그 활성을 잃어 효율이 높지않은 문제점이 있어 바람직하지 않았다.
따라서, 상술한 바와 같은 문제점을 개선하기 위하여, 본 발명은 내열성 에스테라제 활성을 갖는 새로운 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하여 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함으로써, 고온에서도 활성을 잃지 않고, 보다 효율적으로 그리고 경제적으로 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 새로운 미생물인 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) BR-317(KCCM 10105)을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 다음의 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 부제가수분해시켜 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함에 있어서, 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하는 것을 특징으로 하는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법을 포함한다.
화학식 1
Figure kpo00004
화학식 2
Figure kpo00005
상기에서, R1은 알킬기, 아릴기, 또는 아릴알킬기, R2및 R3는 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 상기한 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하여 부제가수분해시켜 상기 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조하는 것에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신균주 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) BR-317의 분리 및 동정과정은 다음과 같다.
[신규 미생물의 분리]
대한민국 전주에서 채집한 토양 샘플을 멸균 증류수에 현탁한 후, 토양현탁액을 트립티카제(Trypticase) 아가 평판에 한방울을 도말한 후, 30℃에서 하룻밤을 배양하였다. 그 결과, 생성된 단일 콜로니를 분리하였고, 다음과 같은 균학적 성질을 실험하였다.
[신규 미생물의 동정]
1) 균학적 성질
상기에서 분리한 미생물의 균학적 성질을 분석해 본 결과, 다음 표 1과 같았다.
크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) BR-317의 균학적 성질
구 분 효과 구 분 효과
형태 막대형 산화/ 발효 포도당 +
그람염색성 - 만니톨 +
운동성 - 이노시톨 +
OF 테스트 O~F 솔비톨 +
옥시다제 - 람노스 +
베타 갈락토시다제 + 슈크로스 +
아지닌 디하이드로라제 - 멜리비오스 +
라이신 데카복실라제 + 아미그달린 +
오르니틴 데카복실라제 - 아라비노스 +
구연산 이용성 + 세포지방산분석(%) C16:0 26.4
황화수소 생성 - C18:1 w7c/w9t/w12t 25.2
요소 분해 - C16:1w7c/c15 iso 2OH 18.0
트립토판 데아미나제 - C14:0 10.4
인돌생성 - C17:0 cyclo 7,7
아세토인 생성 + C16:1iso I/C 14:00 3OH 9.9
젤라틴 분해 -
2) 신균주 미생물 BR-317의 동정 및 명명
일반적인 균학적 특성을 분석한 결과, 본 발명에서 분리한 균주는 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.)에 속하는 미생물임을 버기스 매뉴얼 및 호기성 미생물 동정시스템(Bergey's Manual Systematic Bacteriology Vol.1, William & Wilkins Co., 1984; Microbial Identification System Library for aerobes, ver.3.90)에서 확인할 수 있었다. 동정결과가 정확하게 일치하는 균주는 없었으나, 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)와 가장 비슷한 결과를 가지는 것으로 보아 그 변종인 것으로 판단된다.
분리된 미생물을 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) BR-317로 명명하고, 1997년 9 월 3 일부로 대한민국 특허균주 기탁기관인 한국종균협회 미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 10105를 부여받았다.
[광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법]
본 발명은 상기한 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르의 라세미체의 에스테르 부분을 부제가수분해시켜 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함에 있어서, 크렙시엘라속 미생물의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 상기 화학식 2로 대표되는 에스테르 화합물의 에스테르 결합을 부제가수분해하기 위하여 에스테라제 효소활성을 갖는 크렙시엘라속 미생물균체, 배양액 또는 균체처리물을 사용한다. 이들 크렙시엘라속 미생물을 구체적으로 살펴보면, 본 발명에 따른 신균주 크렙시엘라 뉴모니아 BR-317 뿐만 아니라, 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031, 크렙시엘라 옥시토카 ATCC 8724 등을 사용할 수 있으며, 이들은 내열성 에스테라제 활성을 공통적으로 지니고 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 열에 안정한 내열성 에스테라제 활성을 나타내는 크렙시엘라속 미생물을 이용함으로써 고온의 효소반응공정에서 냉각에 사용되는 비용을 줄일 수 있어 보다 경제적일 뿐만 아니라, 높은 온도에서도 보다 효율적으로 목적물을 제조할 수 있는 데에 특징이 있다. 그 밖에도 이러한 열에 안정한 내열성 에스테라제를 사용함으로써 가열처리에 의해 불순단백질을 불활성화시키는 방법으로 쉽게 부분정제가 가능할 뿐만 아니라 회수공정에서도 안정하여 연속사용이 가능한 특징이 있어 산업적으로도 유리하다.
이들 미생물의 배양은 통상적으로 액체배양을 하지만 고체배양으로도 가능하며, 배지는 미생물이 통상 이용하는 포도당, 수크로스, 말토스 등의 탄소원, 효모추출액, 트립톤, 펩톤 등의 질소원, 티아민, 바이오틴, 니코틴산 등의 생육인자 및 무기염류 등의 성분을 적절히 배합하여 사용한다. 또한, 본 발명에 따른 미생물의 영양배지에는 미생물의 에스테라제 생산능력을 항상시키기 위하여 에스테르를 소량 첨가하기도 한다. 배양은 일반적으로 이들 미생물종이 생육 가능한 온도 및 pH에서 하며, 통상 50℃이하 및 pH 2 ~ 11, 더욱 바람직하게는 pH 5 ~ 8의 범위가 적당하다. 그리고, 호기성인 미생물의 생육을 촉진하기 위하여 통기교반을 하기도 한다.
본 발명은 상기에서 배양된 미생물의 균체자체나 이들의 배양액, 또는 균체처리물을 이용하여 상기 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 결합을 부제가수분해한다. 가수분해반응은 배양초기부터 또는 배양도중에 상기 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체를 배양액내에 첨가하거나, 또는 배양된 미생물균체를 모은 후 상기 화합물이 포함된 반응용액내에 첨가하여 수행한다. 여기서, 미생물균체자체를 이용하는 경우에는 동결건조균체, 분무건조균체 또는 유기용매건조균체 등의 건조균체나 건조되지 않은 미생물균체 자체를 이용한다. 또한, 균체처리물을 이용하는 경우에는 균체파쇄물, 균체추출물이나 또는 균체, 균체처리물을 가열하여 생성되는 변성단백질과 같은 응고물을 제거하고 상등액만을 사용하는 것도 가능하다.
반응용매로는 탈이온수 또는 중성범위에서 완충작용을 하는 적당한 완충액을 이용하며, 탈이온수 또는 완충액을 아세톤, 메탄올 등과 혼합하거나, 탈이온수 또는 완충액에 헥산, 사이클로헥산, 에틸아세테이트 등의 물과는 층분리되는 용매를 혼합하여 층분리상태로 부제가수분해반응을 한다.
이때, 본 발명에서 사용하는 상기 화학식 2로 대표되는 에스테르 화합물은 메틸 D,L-베타-아세틸티오이소부틸레이트, 메틸 D,L-감마-티오-알파-메틸-노르말-부틸레이트, 메틸 D,L-베타-벤조일티오이소부틸레이트 및 메틸 D,L-베타-페닐아세틸티오이소부틸레이트 등 중에서 선택된 1종 이상을 사용하며, 이들의 사용량은 반응용액내에 0.01 ~ 50 중량%가 적당하다. 왜냐하면, 이들 범위가 본 발명이 목적으로 하는 최적의 효율을 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명은 상기로부터 결과된 반응액내에서 목적으로 하는 목적물의 분리·정제는 통상의 방법, 예를 들면 재결정, 칼럼크로마토그래피, 추출법 등을 이용한다. 특히 추출법의 경우 층분리성을 향상시키기 위하여 한외여과를 하는 것이 바람직하며, Hp-20, 암베라이트 XAD-4, 암베라이트 XAD-16 등의 흡착수지를 사용하여 중성 pH에서 에스테르를 흡착하여 제거한 후, 미흡착액에 황산, 염산을 첨가하는 방법으로 산성화하여 다시 흡착수지로 카본산을 흡착시켜서 정제할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
크렙시엘라 뉴모니아 BR-317을 트립톤 1%, 효모추출액 0.5% 및 NaCl 1%로 조성된 액체배지(pH 7.2) 200㎖에 접종하고 30℃에서 1일간 진탕배양한 다음, 배양액을 원심분리하여 균체를 전량 회수한 후, 0.05M 인산완충액(pH 7.0) 100㎖에 현탁한 후 5g의 메틸 D,L-베타-아세틸티오이소부틸레이트를 가한 후 30℃에서 2% 가성소오다용액으로 pH 7.0을 유지하며 24시간 반응을 진행하였다. 가성소오다용액의 소모량으로 측정한 가수분해율은 50%이었다. 반응액을 한외여과장치(아미콘 TCF-10, YM-10막)를 사용하여 한외여과한 결과 여액을 얻은 후, 당해 여액으로부터 초산에틸로 미반응의 메틸 L-베타-아세틸티오이소부틸레이트를 추출한 다음, 수층을 10 N-황산을 첨가하여 pH 2.0으로 조절한 후 다시 초산에틸을 이용하여 미생물의 탈에스터 작용으로 생성된 D-베타-아세틸티오이소부틸산을 추출하였다. 초산에틸 추출액을 무수황산 나트륨으로 건조한 후, 용매를 감압하여 증류제거하였고, 그 결과 D-베타-아세틸티오이소부틸산 및 메틸 L-베타-아세틸티오이소부틸레이트를 제조하였다. 결과적으로 얻어진 추출물을 가지고 비선광도를 측정하였고, 다음 표 2에서와 같이 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르가 생성되었다.
반응 추출물 비선광도[α]D 25
메틸 L-베타-아세틸티오이소부틸레이트 55.26(C=2.0628,CHCl3)
D-베타-아세틸티오이소부틸산 -56.58(C=2.1578,CHCl3)
실시예 2
상기 실시예에서 사용한 크렙시엘라 뉴모니에 BR-317 대신에 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031을 사용한 사실을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과, 가수분해율은 49.1% 이었으며, 다음 표 3과 같이 실시예 1과 마찬가지로 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르가 생성되었다.
반응 추출물 비선광도[α]D 25
메틸 L-베타-아세틸티오이소부틸레이트 42.68(C=1.9916,CHCl3)
D-베타-아세틸티오이소부틸산 -51.23(C=2.0241,CHCl3)
실시예 3
상기 실시예 1에서 사용한 크렙시엘라 뉴모니아 BR-317 대신에 크렙시엘라 옥시토카 ATCC 8724를 사용한 사실을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과, 가수분해율은 50% 이었으며, 다음 표 4와 같이 실시예 1과 마찬가지의 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르가 생성되었다.
반응 추출물 비선광도[α]D 25
메틸 L-베타-아세틸티오이소부틸레이트 56.98(C=2.0375,CHCl3)
D-베타-아세틸티오이소부틸산 -53.93(C=2.0285,CHCl3)
실험예 : 내열성여부의 측정
실시예 1, 2, 3에서 사용한 크렙시엘라 뉴모니아 BR-317, 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031, 크렙시엘라 옥시토카 ATCC 8724를 각각 트립톤 1%, 효모추출물 0.5% 및 NaCl 1.0%로 조성된 액체배지(pH 7.2)에 접종하고, 30℃에서 1일간 진탕배양한 다음, 배양액을 원심분리하여 균체를 모아서 배양액과 동량의 0.05M 인산완충액(pH 7.0)으로 현탁한 다음, 다음 표 5의 각 온도에서 1시간씩 가열처리한 후 남아있는 에스테라제 활성을 측정하였다. 활성측정은 5g 메틸 D,L-베타-아세틸티오이소부틸레이트에 0.05M 인산완충액 45㎖를 가하고, 가열처리한 균액을 50㎖ 넣은 후 30℃에서 1시간 동안 pH 7.0을 유지하는 데 소모된 0.1N-가성소다용액의 양으로 상대적 효소역가를 측정하였다. 그 결과, 다음 표 5에 요약한 바와 같이 크렙시엘라 뉴모니아속 에스테라제는 70℃에서도 그 가수분해 활성을 유지할 수 있는 내열성 효소이었다.
비교예 : 내열성여부의 측정
슈도모나스 플루오레센스 IFO 3081을 이용한 점을 제외하고는 상기 실험예와 동일한 배지, 동일한 배양조건하에서 배양시킨 다음, 동일한 방법으로 에스테라제 활성을 측정하였다. 그 결과는 다음 표 5에 요약하였다.
온도(℃) 탈에스테르 활성(%)
실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예
30 100 100 100 100
40 100 100 100 100
50 100 100 100 90
60 100 100 100 47
70 100 100 100 10
80 90 88 89 0
상술한 바와 같이, 본 발명은 70℃이상의 고온에서도 효소의 활성을 잃지 않은 체, 에스테르 결합을 가수분해할 수 있음으로써, 대형의 반응기내에서 가수분해반응시에 발생하는 고온상태를 냉각하는 데 필요한 비용을 절약할 수 있어 보다 경제적으로 그리고 효율적으로 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims (3)

  1. 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 가수분해시키는 능력을 가지는 광학활성 혼합물 분리용 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) BR-317(KCCM 10105).
  2. 다음의 화학식 2로 대표되는 카본산 에스테르 라세미체의 에스테르 부분을 부제가수분해시켜 화학식 1로 대표되는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르를 제조함에 있어서, 크렙시엘라 뉴모니아 BR-317(KCCM10105), 크렙시엘라 뉴모니아 ATCC 10031 및 크렙시엘라 옥시토카 ATCC 8724 중에서 선택된 1종이상의 배양액, 균체 또는 균체처리물을 사용하는 것을 특징으로 하는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법.
    화학식 1
    Figure kpo00006
    화학식 2
    Figure kpo00007
    상기에서, R1은 알킬기, 아릴기, 또는 아릴알킬기, R2및 R3는 알킬기, n은 1 또는 2를 나타낸다.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 화학식 2의 에스테르 화합물은 메틸 D,L-베타-아세틸티오이소부틸레이트, 메틸 D,L-감마-티오-알파-메틸-노르말-부틸레이트, 메틸 D,L-베타-벤조일티오이소부틸레이트 및 메틸 D,L-베타-페닐아세틸티오이소부틸레이트 중에서 선택된 1 종 이상인 것임을 특징으로 하는 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법.
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