KR100300443B1

KR100300443B1 - 신규의에스테라제및광학활성크로만화합물의제조방법

Info

Publication number: KR100300443B1
Application number: KR1019980029029A
Authority: KR
Inventors: 토시히로 오이카와; 노부히로 후쿠하라; 야스코 마쯔바
Original assignee: 나까니시 히로유끼; 미쓰이 가가쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1998-07-18
Publication date: 2001-09-06
Also published as: US6303349B1; CN1218110A; DE69828338T2; DE69828338D1; KR19990013989A; EP0892044A2; US6060290A; EP0892044B1; HU9801621D0; EP0892044A3; HUP9801621A3; HUP9801621A2

Abstract

광학활성 크로만-3-아세트산 및 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르는, 하기 일반식(Ⅰ):

[식중, R₁은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기형상의 알킬기, R₂는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환아미노기임]의 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테라제(즉, 에스테르가수분해효소) 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 또는 그로부터의 프레파라트로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또, 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속의 세균으로부터 유래된 신규의 에스테라제도 상기 에스테라제로서 사용할 수 있다.

Description

신규의 에스테라제 및 광학활성 크로만화합물의 제조방법.{NOVEL ESTERASE AND METHODS FOR THE PRODUCTION OF OPTICALLY ACTIVE CHROMAN COMPOUNDS}

본 발명은 에스테르의 가수분해용의 촉매로서 유용한 신규의 에스테라제(에스테르가수분해효소), 상기 에스테라제의 분리방법, 상기 에스테라제를 이용한 에스테르화합물의 (R)-형과 (S)-형의 혼합물의 카이네틱 분할(kinetic resolution)방법 및 상기 에스테라제를 이용해서 의약원료로서 유용한 광학활성(즉, 선광성)인 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은 후술하는 일반식(Ⅰ)로 표시되는 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물 또는 그로부터의 프레파라트(preparation)로 처리하여 광학활성인 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 유기합성에 있어서 효소를 이용하는 시도가 다수 행해지고 있다. 특시, 각종 에스테르화합물을 선택적으로 광학선택적 가수분해를 행함으로써 광학활성인 화합물을 얻거나 프로카이럴 에스테르화합물로부터 카이럴화합물을 제조하기위한 높은 기질특이성을 지닌 에스테라제를 이용하는 것은 공업적 효율이 높다.

돼지의 간으로부터 유래된 에스테라제는 일반적으로 전술한 바와 같은 목적에 사용되나, 그 비용이 높고 입수성이 한정되어 있어 공업적 용도가 제한되어 있었다. 또, 돼지의 간으로부터 유래된 에스테라제대신에 미생물원으로부터의 에스테라제를 이용하는 것이 시도되어 왔다. 상이한 유기체로부터 유래된 효소는 그들의 기질특성이 특이하게 다르므로, 효소의 선택성 및 반응속도가 해당 효소를 적용하는 화합물에 따라 현저하게 변화한다.

예를 들면, 유럽특허공보 제 709370호 및 제 760364호에 개시된 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르는, 항혈소판의 유용한 중간체이지만, 상기 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르에 대해 높은 광학선택성을 발휘하는 동시에 이들을 효율적으로 가수분해할 수 있는 에스테라제는 보고되어 있지 않다.

본 발명의 목적은, 광학선택성을 지니고, 또한 의약원료로서 유용한 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하기 위한 촉매로서 유용한 에스테라제를 얻는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 연구한 결과, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물 또는 그로부터의 프레파라트로 처리함으로써 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 또, 본 발명자들은 각종 정제기술을 이용해서 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속의 미생물로부터 열 및 pH안정성이 우수하고 광학선택적 가수분해활성을 지닌 신규의 에스테라제를 발견하였다.

즉, 본 발명은 에스테르의 가수분해용의 촉매로서 유용한 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속의 미생물에서 발견한 신규의 에스테라제, 상기 에스테라제의 분리방법, 상기 에스테라제를 이용한 (R) 및 (S)에스테르화합물의 혼합물의 카이네틱분할방법 및 상기 에스테라제를 이용해서 의약원료로서 유용한 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은, 하기 일반식(I):

[식중, R₁은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기형상의 알킬기, R₂는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환의 아미노기임]로 표시되는 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 또는 그로부터의 프레파라트로 처리해서 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

[1] 효소함유미생물 및 이 미생물의 배양방법:

목표로 하는 신규의 에스테라제는 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275의 세포에 함유되어 있고, 이들 세포는 공지의 방법에 의해 배양할 수 있다. 고기추출물(meat extract), 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤 및 NZ아민 등의 유기영양원; 글루코스, 말토스, 슈크로스, 전분 및 유기산 등의 탄소원; 황산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등의 질소원; 인산염, 마그네슘, 칼륨 및 철 등의 무기영양원; 및 비타민을 적절하게 조합해서 사용할 수 있다. 상기 세포는 배지에 있어서 pH 6∼9, 30℃∼60℃, 바람직하게는 45℃∼55℃의 온도에서 호기적으로 배양하며, 이 때의 배양은 목표로 하는 에스테라제함량이 최대치에 이를 때까지 1∼7일간 행한다.

[2] 효소의 정제:

효소는 종래의 효소정제법을 이용해서 정제시킬 수 있다. 세포는 완전한 배양액으로부터 원심분리에 의해 거두어들여, 고주파음에 의한 분해, 프렌치프레셔셀프레스(FRENCH PRESSURE CELL PRESS; 상품명), 다이노밀(DYNO-MILL; 상품명) 등을 이용해서 기계적으로 분해시킨다. 세포부스러기 등의 고체를 원심분리에 의해 제거하여 미가공상태의 효소액을 얻는다. 다음에, 이 효소를 황산암모늄 등의 염에 의한 염석, 겔여과, 이온교환크로마토크래피, 소수성 크로마토그래피, 결정화법 등에 의해 정제한다. 그 일례가 실시예 1에 설명되어 있다.

[3] 효소활성의 측정법:

라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 10μmol, 인산칼륨완충액(pH 7.2) 0.1mmol 및 에스테라제 적량을 함유하는 반응혼합물(1㎖)을 55℃에서 30분간 반응시킨 후, 이 반응혼합물의 일부를 10mM 인산나트륨완충액 (pH 6.0)-30％아세토니트릴용액으로 희석하고, 고속액체크로마토그래피에 의해 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 6-아미노크로만-3-아세트산을 각각 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 10mM인산나트륨완충액(pH 6.0)-30％아세토니트릴을 사용해서 이너트실 ODS-2칼럼(GL사이언스사 제품)상에서 0.7㎖/분의 유속으로 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 다음에, 나머지 반응액에 동일 체적의 클로로포름을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 이어서, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또, 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. 이와 같이 해서 제조한 용액중의 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량 측정하여 광학순도를 구하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올용액(3:2 체적비)을 사용해서 키랄셀 OD-H광학분할칼럼(다이셀카가쿠사 제품)상에서 0.5㎖/분의 유속으로 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정 검출하였다.

6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 1μmol을 1분당 가수분해하는 효소의 양을 1단위로 정의하였다.

[4] 효소의 균질성

트리스-글리신완충액을 이용한 10-20％겔(네이춰 227, 680, 1970)상에서 램리법(Laemmli method)에 의해 SDS폴리아크릴아미드겔 전기이동을 행하였다. 쿠마시 브릴리언트블루에 의한 착색후, 균질한 단백질띠를 관찰한 결과, 이 단백질의 분자량은 종래의 표준단백질에 비해서 50000±2000으로 측정되었다.

[5] 효소의 성질:

본 발명의 에스테라제의 성질은 다음과 같았다.

(1) 효소작용

효소는 에스테르화합물을 카르복시기를 지닌 화합물과 알콜화합물로 가수분해할 때 및 에스테르화합물과 알콜화합물간에 에스테르교환반응할 때 촉매로서 작용한다.

(2) 기질특이성

효소는 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 (R)형을 우선적으로 가수분해한다.

직쇄의 지방산과 p-니트로페놀의 에스테르에 대해서, 지방산의 탄소수가 적을수록, 가수분해활성이 강하다.

(3) 분자량

효소의 분자량은 50000±2000(SDS-PAGE)이다.

(4) 최적 pH

pH 7∼10에서 가수분해가 최적으로 일어난다.

(5) 최적 온도

0.1M인산완충액(pH 7.2)중에서 55℃∼60℃에서 가수분해가 최적으로 일어난다.

(6) 온도안정성

온도 60℃이하, pH 7.2에서 90%의 가수분해활성을 30분간 유지할 수 있다.

(7) pH안정성

5∼10의 pH범위에서 효소가 안정하다.

(8) 억제제

0.1M인산버퍼액(pH 7.2)중에서 30℃, 30분간 각종 억제제에 의한 처리시, 효소의 활성은, 황산구리(1mM)에 의해서는 30％, 불화페닐메틸술포닐(0.1mM)에 의해서는 85％, 그리고 디이소프로필 플루오로포스페이트(0.5mM)에 의해서는 15％ 손실된다. 또, 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM)에 의해서는 효소활성의 저감이 관측되지 않는다. 이점은, 이하의 실시예에 있어서 더욱 상세히 설명한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 효소는, 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르에 대해 입체특이적으로 작용하는 동시에 내열성 및 pH안정성이 우수한 에스테라제이다.

일반식(Ⅰ)의 화합물은 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275로부터 상기 에스테라제의 존재하에 입체선택적으로 가수분해될 수 있다.

본 발명은 또한, 미생물에 의해 제공된 에스테르가수분해효소를 이용한 광학분할을 포함한다. 본 발명에 있어서 사용되는 에스테라제 또는 에스테르가수분해효소를 함유하는 미생물은, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물에서 광학화합물의 어느 하나를 우선적으로 가수분해하는 미생물일 수 있다. 이러한 미생물의 예로서는, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속 및 써모악티노마이세스(Thermoactinomyces)속의 것을 들 수 있다. 이런 미생물의 특정 예로는, 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275, 플라보박테리움 오케아노코이테이스(Flavobacterium okeanokoites) FERM BP-6276, 써모악티노마이세스 삭카리(Thermoactinomyces sacchari) ATCC-27375, 플라보박테리움 오케아노코이테이스(Flavobacterium okeanokoites) IFO 15880 등을 들 수 있다. 균주 FERM BP-6275 및 FERM BP-6276은, 부타페스트조약에 의거 1998년 2월 27일, 이들 수탁번호하에, 일본국, 이바라키켕(305-8566), 추쿠바시 히가시 1쪼메 1-3의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁되어 있다. 또, ATCC번호를 지닌 균주는, ATCC(The American Type Culture Collection, 미합중국, 매릴랜드주 20852, 록빌, 12301 파크론드라이브)로부터 시판되고 있다. 또, IFO번호를 지닌 균주도 일본국 오사카후(532) 요도가와쿠 2쪼메 쥬소혼마찌 17-85의 "the Institution for Fermentation Osaka"로부터 시판되고 있다.

이들 미생물은 본 발명에 필요한 능력을 지니는 한 특히 제한되지 않는다. 사용되는 미생물의 예로서는, 예를 들면 자외선방사나 돌연변이제의 사용 또는 유전자공학의 도입에 의해 얻어진 돌연변이균주를 들 수 있다.

미생물배양균 또는 이들로부터의 프레파라트는, 이들이 본 발명에 필요한 필수능력을 지니는 한 특히 제한되지 않는다. 미생물배양물의 예로서는, 배양액 및 미생물세포 등을 들 수 있다. 배양물로부터의 프레파라트의 예로는, 세정세포, 건조세포, 배양상등액, 세포부스러기, 세포자동소화물, 세포추출물 또는 종래의 방법을 이용해서 정제 또는 부분적으로 정제한 효소프레파라트 등의 분해세포 등을 들 수 있다. 또, 이들 미생물배양물 및 이들로부터의 프레파라트는 고정화시켜 사용할 수 있다. 고정화방법으로서는, 폴리아크릴아미드, 알긴산 및 카라기난으로 처리하는 방법, 또는 공유결합법이나 흡착법 등의 공지의 방법을 이용해서 적절한 캐리어상에 고정시키는 방법을 들 수 있다.

배지로서는, 이 분야에서 미생물을 배양하는 데 일반적으로 사용하는 것이면 어떠한 것이라도 사용가능하다. 예를 들면, 고기추출물, 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤 및 NZ아민 등의 유기영양원; 글루코스, 말토스, 슈크로스, 전분 및 유기산 등의 탄소원; 황산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등의 질소원; 인산염, 마그네슘, 칼륨 및 철 등의 무기영양원; 및 비타민 등을 적절하게 조합해서 사용할 수 있다. 또, 배양은 pH 6∼9, 온도 20℃∼60℃에서 호기적으로 행할 수 있으나, 폴라보박테리움 오케아노코이테스 FERM BP-6276에 대해서는 28℃∼37℃의 온도에서의 배양이 바람직하고, 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275 및 써모악티노마이세스 삭카리(Thermoactinomyces sacchari) ATCC-27375에 대해서는 45℃∼55℃의 온도에서의 배양이 바람직하다. 또한, 이때의 배양은 목표로 하는 에스테라제 함량이 최대치에 이를 때까지 1∼7일간 행한다.

살아 있는 배양세포 및 배양상등액은, 전술한 바와 같이, 미생물을 배양함으로써 얻어진 배양액으로부터 원심분리나 여과 등의 처리에 의해 제조한다. 세정세포는 생리식염수로 살아 있는 세포를 세정함으로써 제조한다. 또, 건조세포는 살아 있는 세포나 세정세포를 냉동건조 또는 아세톤건조함으로써 제조한다. 분해세포는 초음파분해, 프렌치프레스, 삼투압, 냉동용융, 세포용해효소의 사용 또는 계면활성제 및 유기용제에 의한 처리 등의 각종 물리화학적 방법을 이용해서 제조한다. 또, 정제 또는 부분정제효소는, 예를 들면 분해세포 또는 배양상등액으로부터, 황산암모늄석출, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 또는 소수성크로마토그래피 등의 종래의 방법을 이용한 분류에 의해 얻는다.

상기 일반식(Ⅰ)에 있어서의 R₁기의 예로는, 탄소수 1∼5의 직쇄 및 분기형상의 알킬기, 보다 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기 또는 부틸기, 보다 바람직하게는, 메틸기 또는 에틸기를 들 수 있다.

R₂가 아미노기일 경우 치환기의 예로는 아세틸기, tert-부톡시카르보닐기 또는 벤질옥시카르보닐기를 들 수 있다.

반응에 역효과를 주지 않는 반응매체 또는 그의 혼합물을 광학선택적 가수분해용으로 사용해도 된다. 반응매체는, 물 또는 물과 물혼화성 용매(water- miscible-solvent)와의 혼합물을 이용한 균질계, 혹은 물과 물비혼화성 용매(non- water-miscible-solvent)와의 혼합물을 이용한 2상계이어도 된다.

물혼화성 용매의 예로서는, 탄소수 1∼4의 직쇄 또는 분기형상의 알콜, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 및 테트라하이드로푸란을 들 수있다. 이 물혼화성 용매는 수중 0.1∼20.0％(v/v)범위의 양으로 사용하면 된다.

한편, 물비혼화성 용매의 예로는, 톨루엔 및 크실렌 등의 유기용제를 들 수 있으며, 이 물비혼화성 용매의 양은 수중 1.0∼40.0％(v/v)범위이면 된다.

반응용매에 첨가하는 라세미크로만-3-아세트산에스테르의 농도는, 일반적으로는 0.01∼50％(w/v), 바람직하게는 0.01∼20％(w/v)이다.

반응은, 실온에서, 또는 바람직하게는 15∼70℃, 보다 바람직하게는 20∼60℃에서의 가열하에 행한다.

반응액의 pH는 가수분해효소나 미생물원의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 pH 3∼11에서 반응을 행한다. 가수분해가 진행함에 따라 반응액의 pH가 변화할 경우에는 pH를 최적 pH로 제어하는 것이 바람직하다.

또, 기질과 효소와의 반응성은 반응액에 계면활성제 등을 첨가함으로써 향상시킬 수 있다.

광학선택적 가수분해후의 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르와 광학활성 크로만-3-아세트산의 분리는, 물 또는 물과 물혼화성 용매와의 혼합물을 이용한 균질계에 있어서 물비혼화성 추출용매로 광학활성 크로만-3-아세트산을 추출하거나, 물과 물비혼화성 용매와의 혼합물 또는 물 및 물혼화성용매와 물비혼화성 용매와의 혼합물을 이용한 2상계에 있어서 유기용매층과 물층을 분리함으로써 매우 쉽게 행할 수 있다. 목적으로 하는 용도에 따라, 얻어진 유기용매층속의 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르를 용액상태로, 또는 상기 용매를 제거한 후의 합성중간체로서 사용할 수 있다. 적절한 용제를 이용한 결정화에 의해 보다 높은 광학순도의광학활성 크로만-3-아세트산을 얻을 수 있다. 또, 물층속의 광학활성 크로만-3-아세트산은, 여과 등의 공지의 방법을 이용해서 세포질 성분을 제거한 후 농축결정화 등의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다.

실시예

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 에스테라제함유 미생물의 배양방법

0.1% 효모추출물, 0.1% 고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(Type 1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01%황산마그네슘 및 1.0% 가용성 전분(pH 7.4)을 함유한 위생배지(1ℓ)에, 마찬가지의 배지에서 미리 배양된 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275의 5%배양물을 배양하였다. 52℃에서 96시간 호기적으로 배양한 후, 얻어진 배양액을 원심분리하여 젖은 상태의 세포 10g을 얻었다.

실시예 2: 에스테라제의 정제

실시예 1에서 얻어진 세포를 0.05M 인산칼륨완충액(pH 7.2) 100㎖중에 현탁시키고, 초음파처리에 의해 분산시킨 후, 프렌치프레스를 사용해서 분해시켰다. 원심분리(15000×g, 20분)에 의해 세포부스러기를 제거하여 세포없는 추출물을 얻었다. 이 세포없는 추출물에 황산암모늄을 60%까지 첨가하고, 원심분리에 의해 침전물로서 활성분획(active fraction)을 얻었다. 이 침전물을 상기 완충액 100㎖에 용해시켜 얻은 용액을, 캐리어로서 울트로겔 ACA 44(상품명; 파마시아사 제품)를 이용해서 겔여과를 행하였다. 활성분획을 모아 데아에 토요펄(DEAE TOYO PEARL) 650M(상품명; 토소사 제품)칼럼에 넣고, 직선농도기울기를 이용해서 0.8M 황산암모늄 및 완충액을 함유한 완충액으로 용리를 행하였다. 얻어진 활성분획을 환외여과를 이용해서 농축하고, 완충액에 대해서 투석하여, 에스테라제를 균질하게 정제하였다. 이 정제처리과정을 표 1에 요약하였다.

처리과정	전체활성도(총단위)	전체단백질(㎎)	비활성도(단위/㎎)
1. 세포없는 액추출	677	185	3.7
2. 황산암모늄침전(＜60%)	425	125	3.4
3. 겔여과(울트로겔 ACA44분획범위MW:10,000-100,000)	358	25	14.6
4. 데아에토요펄 650S	262	10	26.2
5. 페닐토요펄 650M	143	2	71.5

실시예 3: 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 광학선택적 가수분해

실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 이하의 조건하에서 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 또는 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 가수분해하였다.

0.1mmol인산칼륨완충액(pH 7.2), 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 10㎛ol 및 적량의 에스테라제를 함유한 반응액(1㎖)을 55℃에서 30분간 반응시킨 후, 이 반응액의 일부를 10mM인산나트륨완충액(pH 6.0)-30%아세토니트릴용액으로 희석하고, 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르와 6-아미노크로만-3-아세트산을 각각 고속액체크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 10mM 인산나트륨완충액(pH 6.0)-30%아세토니트릴용액을 이용한 이너트실ODS-2칼럼(GL사이언스사 제품)상에서 0.7㎖/분의 유속으로 용리를 행하였다. 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 다음에, 나머지 반응액에 동등한 체적의 클로로포름을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 그후, 클로로포름을 진공하에 증류제거한 후, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또 헥산/에탄올(3/2, v/v)용액으로 희석하였다. 이와 같이 해서 제조한 용액중의 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르와 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량적으로 측정하여 광학순도를 구하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올(3:2, 체적비)을 이용해서 0.5㎖/분의 유속으로 키랄셀 OD-II광학분할칼럼(다이셀사 제품)상에서 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다.

6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 대신에 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 이용해서 이상의 처리를 반복한 후, 반응액중의 (R) 6-아미노크로만-3-아세트산의 양과 헥산/에틸올용액중의 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 및 (R) 6-아미노크로만-3-아세트산 에틸에스테르의 양을 상기와 마찬가지 방법으로 구하였다.

그 결과를 표 2에 표시한다.

<라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 광학선택적 가수분해>

라세미기질	6-아미노크로만-3-아세트산(μ㏖)	6-아미노크로만-3-아세트산에스테르(μ㏖)	광학순도(%ee)
6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르	6.0	4.0	S99
6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르	6.2	3.8	S99

실시예 4: 기질로서 직쇄지방산의 에스테르를 이용한 가수분해

각종 p-니트로페닐에스테르중 1종을 1mM 함유하는 0.2M인산칼륨완충액(pH 7.0) 2.5㎖에 적량의 효소액을 가하고, 얻어진 반응액을 45℃에서 8분간 배양하였다. 메탄올 1㎖를 첨가함으로써 반응을 중지시킨 후, 400㎚에서의 흡광도의 증가를 구하였다. 제어시료용으로, 효소액 대신에 완충액을 사용하였다. 흡광도의 변화로부터 p-니트로페닐에스테르에 대한 상대활성도를 산출하였다. 그 결과를 표 3에 표시한다.

<p-니트로페닐에스테르에 대한 상대활성도 (p-니트로페닐아세트산에스테르에 대한 100%활성도에 의거한 것임)>

기질	상대활성도(%)
p-니트로페닐아세트산에스테르	100
p-니트로페닐카프르산에스테르	12
p-니트로페닐라우르산에스테르	0.6

실시예 5: 효소반응에 대한 최적 pH

실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 최적 pH를 조사했다. 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 10μ㏖, 하기와 같은 각종 pH범위를 제공하는 완충액중 1종 0.1mmol 및 에스테라제 0.1단위를 함유하는 반응혼합물(1.0㎖)을 55℃에서 30분간 배양하였다. 반응후, 동일체적의 클로로포름을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 그후, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또, 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. 고속액체크로마토그래피에 의해 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 정량적으로 측정하였다. 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 양의 감소에 의해 효소활성을 측정했다.

완충액으로서는, pH 5.0∼7.2의 인산칼륨완충액, pH 8.0∼9.5의 트리스-HCl완충액 및 pH 10.0의 CAPS완충액(Good buffer)을 이용했다. 표 4의 결과에 표시한 바와 같이 최적 pH는 8.0∼10.0범위였다.

실시예 6: 효소의 pH안정성

실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 pH안정성을 조사했다. 실시예 5에서와 마찬가지로 특정pH의 0.1M완충액에 에스테라제 0.5단위를 첨가하고, 이 용액을 30℃에서 30분간 유지시킨 후 효소 0.1단위를 이용해서 나머지 활성도를 측정하였다. 상대활성도는 pH처리하지 않은 제어시료의 100%에스테라제활성도에 의거한 것이다. 표 4의 결과, pH 5.0∼10.0범위에서의 활성도에는 거의 변화가 없었다.

<최적 pH 및 pH안정성>

pH	최적pH^#(실시예 5)	pH안정성^*(실시예 6)
5.0	28	97
6.0	65	98
6.5	80	100
7.2	90	100
8.0	93	100
8.5	93	100
9.5	94	100
10.0	100	99

#: pH 10에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도

*: 특정pH에서 30분간 유지한 후 효소반응없이 pH 7.2에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도

실시예 7: 효소반응에 대한 최적 온도

반응온도를 30℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃로 하고 완충액으로서 인산칼륨완충액(pH 7.2)을 사용한 것을 제외하고 실시예 5와 마찬가지로 반응을 행하였다. 그 결과, 활성도는 60℃에서 최고였다. 또, 상대활성도는 60℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 것이다(표 5).

실시예 8: 효소의 온도안정성

실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 온도안정성을 조사하였다. 0.1mmol인산칼륨완충액(pH 7.2)에 에스테라제 0.1단위를 첨가하여 총체적을 0.95㎖로 하였다. 이 혼합액을 특정온도, 즉, 30℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 70℃에서 30분간 유지하고, 여기에, 0.2M라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르 0.05㎖를 첨가하고, 55℃, 30분간 반응을 행한 후, 나머지 활성도를 측정하였다. 상대활성도는 열처리하지 않고 얻어진 100% 에스테라제활성도에 의거한 것이었다. 표 5의 결과, 90%이상의 활성도가 60℃까지의 온도에서 유지된것을 알 수 있다.

<최적 온도 및 온도안정성>

온도(℃)	최적온도^#(실시예 7)	온도안정성^*(실시예 8)
30	24	100
40	43	100
50	69	100
55	75	100
60	100	90
70	35	0

#: 60℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도

*: 특정온도에서 30분간 유지한 후 효소반응없이 55℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도

실시예 9: 억제제의 효과

실시예 2에서 균질하게 정제된 각종 억제제의 효과를 조사했다. 에스테라제 0.1단위, 인산칼륨완충액(pH 7.2) 0.1mmol 및 특정억제제를 혼합하여 총체적을 0.95㎖로 하고, 이 혼합액을 30℃에서 30분간 유지하고, 여기에, 0.2M라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 하이드로클로라이드 0.05㎖를 첨가하고, 55℃에서 30분간 반응을 행한 후, 나머지 활성도를 측정하였다. 상대활성도는 억제제없이 얻어진 100%에스테라제활성도에 의거한 것이었다. 얻어진 결과를 표 6에 표시하였다. 금속중, Cu²⁺가 억제제였고, 기타, 불화페닐메틸술포닐(PMSF), 프로테아제억제제 및 디이소프로필플루오로인산(DFP)이 억제제였다. 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM) 등의 계면활성제에 의해서는효소활성의 현저한 감소는 관측되지 않았다(표 6).

<억제제의 효과>

억제제	상대활성도
없음	100
FeSO₄1 mM	92
CoCl₂1 mM	102
MnSO₄1 mM	99
NiCl₂1 mM	92
CuSO₄1 mM	21
CaCl₂1 mM	96
ZnCl₂1 mM	101
EDTA 5 mM	103
PMSF 0.1 mM	84
DFP 0.5 mM	6
DTT 0.1 mM	102
SDS 5mM	99
데옥시콜산나트륨	102

실시예 10: 미생물에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 광학선택적 가수분해

각종 미생물을 한천사면배지상에서 표 7에 표시한 조건하에 각각 배양하였다. 세포배양액의 하나의 백금선을, 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르하이드로클로라이드 2.5㎎과 인산칼륨 0.1mmol(pH 7.2)을 함유하는 반응액 1㎖에 현탁시키고, 이 반응액을 30℃에서 16시간 반응시킨 후, 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 동일체적의 클로로포름에 의해 추출하였다. 다음에, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올(3:2 체적비)을 사용한 키랄셀 OD-II광학분할칼럼(다이셀사 제품)상에서 0.5㎖/분의 유속으로 용리를 행하였다. 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 결과를 표 7에 표시한다.

<미생물에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 선택적 가수분해>

미생물균주	배양조건	S-에스테르함량(㎎/㎖)	R-에스테르함량(㎎/㎖)
플라보박테리움오케아노코이테스IFO 15880	A	0.98	0.00
써모악티오마이세스삭카리	B	1.20	0.73

배양조건 A: 배양조건 B:

효모추출물 0.5% 효모추출물 0.1%

박토트립톤 1.0% 고기추출물 0.1%

염화나트륨 1.0% NZ아민 0.2%

한천 1.5% 말토스 1.0%

pH: 7.3 ; 배양온도: 30℃ 한천 1.5%

pH: 7.3 ; 배양온도: 45℃

실시예 11: 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila)에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르의 광학선택적 가수분해

0.1% 효모추출물, 0.1%고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(Type 1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01% 황산마그네슘 및 1.0% 가용성 전분을 함유한 위생배지(pH 7.4) 10㎖에, 마찬가지의 배지에서 미리배양된 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275의 5%배양물을 배양하였다. 52℃에서 72시간 배양을 행하고, 원심분리에 의해 얻어진 젖은 세포를, 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르 1g을 함유하는 반응액(pH 8.0, 수산화칼륨으로 조정됨) 50㎖에 첨가하고, 2% 수산화칼륨용액으로 pH를 8.0으로 유지하면서 55℃에서 3시간 가수분해반응을 행하였다. 반응후, 톨루엔 20㎖를 첨가하여 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 대부분은 톨루엔층으로 추출되었고, 가수분해된 6-아미노크로만-3-아세트산은 물층에 존재하였다. 상기 톨루엔층을 농축함으로써 99%이상의 순도를 지닌 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 얻었다(수율: 40%).

실시예 12: 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila)에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 에틸에스테르의 광학선택적 가수분해

0.1% 효모추출물, 0.1%고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(Type 1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01%황산마그네슘 및 1.0% 가용성 전분을 함유한 위생배지(pH 7.4) 10㎖에, 마찬가지의 배지에서 미리 배양된 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275의 5%배양액을 배양하였다. 52℃에서 72시간 배양을 행하고, 원심분리에 의해 얻어진 젖은 세포를 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 1g을 함유하는 반응액(pH 8.0, 수산화칼륨으로 조정됨) 50㎖에 첨가하고, 2% 수산화칼륨용액으로 pH를 8.0으로 유지하면서 55℃에서 6시간 가수분해반응을 행하였다. 반응후, 톨루엔 20㎖를 첨가하여 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 추출하였다. 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르의 대부분은 톨루엔층으로 추출되었고, 가수분해된 6-아미노크로만-3-아세트산은 물층에 존재하였다. 상기 톨루엔층을 농축함으로써 99%이상의 순도를 지닌 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 얻었다(수율: 35%).

본 발명자들은 상압·상온하에서 극소량으로 에스테르의 가수분해에 대해 촉매작용을 할 수 있는 동시에, 유용한 의약원료의 중간체, 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르에 대해 광학선택적 가수분해활성을 지닌, 열 및 pH안정성이 우수한 신규의 에스테라제를 발견하였다. 이 에스테라제는, 의약원료의 중간체로서 유용한 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하는 데 사용할 수 있다. 또, 광학활성 크로만-3-아세트산 및 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르는, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물로부터, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테라제나 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 혹은 그로부터의 프레파라트로 처리함으로서 용이하고 효율좋게 제조할 수 있다.

Claims

슈도노카르디아(Psuedonocardia)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속 또는 써모악티노마이세스(Thermoactinomyces)속에 속하는 미생물로부터 유래되고, 이하의 물리화학적 성질을 지닌 것을 특징으로 하는 신규의 에스테라제:

(1) 효소작용

효소는 에스테르화합물을 카르복시기와 알콜로 가수분해할 때 및 에스테르화합물과 알콜간에 에스테르교환반응할 때 촉매로서 작용함.

(2) 기질특이성

효소는 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 (R)형을 우선적으로 가수분해시킴.

직쇄의 지방산과 p-니트로페놀의 에스테르에 대해서, 지방산의 탄소수가 적을수록, 가수분해활성이 강함.

(3) 분자량

효소의 분자량은 50000±2000(SDS-PAGE)임.

(4) 최적 pH

pH 7∼10에서 가수분해가 최적으로 일어남.

(5) 최적 온도

55℃∼60℃에서 가수분해가 최적으로 일어남.

(6) 온도안정성

온도 60℃이하, pH 7.2에서 90%의 가수분해활성을 30분간 유지할 수 있음.

(7) pH안정성

5∼10의 pH범위에서 효소가 안정함.

(8) 억제제

0.1M 인산버퍼액(pH 7.2)중에서 30℃, 30분간 각종 억제제에 의한 처리시, 효소의 활성은, 황산구리(1mM)에 의해서는 30%, 불화페닐메틸술포닐(0.1mM)에 의해서는 85%, 그리고 디이소프로필플루오로포스페이트(0.5mM)에 의해서는 15% 손실되고, 또, 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM)에 의해서는 효소활성의 저감이 관측되지 않음.
제 1항기재의 에스테라제를 생성하는 슈도노카르디아속의 미생물을 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 해당 에스테라제를 분리하는 것을 특징으로 하는 제 1항기재의 에스테라제의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 슈도노카르디아속의 미생물은 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275인 것을 특징으로 하는 에스테라제의 제조방법.
(a) 반응매체에 있어서 제 1항 기재의 에스테라제를 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물과 접촉시켜서, (R)-에스테르화합물 및 (S)-에스테르화합물중의 어느 한쪽을 입체선택적 가수분해함으로써 광학활성 산화합물을 얻는 공정; 및

(b) 상기 반응매체로부터 상기 광학활성 산화합물 또는 가수분해되지 않고 남아있는 광학활성 에스테르를 회수하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 4항에 있어서, 상기 에스테라제는, 분리·정제된 효소, 가공되지 않은 효소프레파라트, 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포, 상기 미생물의 배양상등액, 상기 미생물의 세포부스러기 및 상기 미생물의 세포로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되어, 상기 에스테라제 또는 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포를 고정화시킨 형태의 하나인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 에스테르화합물은, 하기 일반식(I):

[식중, R₁은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기형상의 알킬기, R₂는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환아미노기임]의 크로만화합물인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 6항에 있어서, 상기 R₂는 아미노기인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 6항에 있어서, 상기 R₁은 메틸기 또는 에틸기인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 4항에 있어서, 상기 반응매체는 물과 비혼화성 유기용매와의 2상계로 이루어진 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 방향족 탄수화물인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 톨루엔 또는 크실렌인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매의 첨가량은 수중 1.0∼40.0%(v/v)인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
(a) 반응매체에 있어서, 하기 일반식(I):

[식중, R₁은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기형상의 알킬기, R₂는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환 아미노기임]의 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소와 접촉시켜 광학활성 크로만-3-아세트산화합물을 얻는 공정; 및

(b) 상기 반응매체로부터 상기 얻어진 광학활성 크로만-3-아세트산화합물 또는 가수분해되지 않고 남아있는 광학활성 에스테르를 회수하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 에스테르가수분해효소는, 분리·정제된 효소, 가공되지 않은 효소프레파라트, 해당 에스테르가수분해효소를 지닌 미생물의 세포, 상기 미생물의 배양상등액, 상기 미생물의 세포부스러기 및 상기 미생물의 세포로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되어, 상기 에스테르가수분해효소 또는 해당 에스테르가수분해효소를 지닌 미생물의 세포를 고정화시킨 형태의 하나인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 미생물은 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속 및 써모악티노마이세스(Thermoactinomyces)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 미생물은 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275, 플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites) FERM BP-6276 및 써모악티노마이세스 삭카리(Thermoactinomyces sacchari) ATCC- 27375로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 반응매체는 물과 비혼화성 유기용매와의 2상계로 이루어진 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 방향족 탄수화물인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 톨루엔 또는 크실렌인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매의 첨가량은 수중 1.0∼40.0% (v/v)인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 R₂는 아미노기인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 R₁은 메틸기 또는 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.