KR19990013989A - 신규의 에스테라제 및 광학활성 크로만화합물의 제조방법 - Google Patents
신규의 에스테라제 및 광학활성 크로만화합물의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19990013989A KR19990013989A KR1019980029029A KR19980029029A KR19990013989A KR 19990013989 A KR19990013989 A KR 19990013989A KR 1019980029029 A KR1019980029029 A KR 1019980029029A KR 19980029029 A KR19980029029 A KR 19980029029A KR 19990013989 A KR19990013989 A KR 19990013989A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ester
- esterase
- acetic acid
- microorganism
- optically active
- Prior art date
Links
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- -1 chroman compound Chemical class 0.000 title claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 36
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 26
- KGDUETQEJCATNN-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2CC(CC(=O)O)COC2=C1 KGDUETQEJCATNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- KGDUETQEJCATNN-QMMMGPOBSA-N 2-[(3s)-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetic acid Chemical class C1=CC=C2C[C@@H](CC(=O)O)COC2=C1 KGDUETQEJCATNN-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Natural products CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 22
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 22
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 22
- WRADELAVAFRPDW-UHFFFAOYSA-N 2-(6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl)acetic acid Chemical compound O1CC(CC(O)=O)CC2=CC(N)=CC=C21 WRADELAVAFRPDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 11
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000187602 Pseudonocardia thermophila Species 0.000 claims description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241000203775 Thermoactinomyces Species 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- ASNHGEVAWNWCRQ-UHFFFAOYSA-N 4-(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol Chemical compound OCC1(O)COC(O)C1O ASNHGEVAWNWCRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000187603 Pseudonocardia Species 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 claims description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical class OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims 2
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 claims 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- VYXLCNODKYOLLJ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl)acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2CC(CC(=O)OC)COC2=C1 VYXLCNODKYOLLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- MHFFWCUFQLUBNB-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-(6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl)acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2CC(CC(=O)OCC)COC2=C1 MHFFWCUFQLUBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VYXLCNODKYOLLJ-QMMMGPOBSA-N methyl 2-[(3s)-6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2C[C@@H](CC(=O)OC)COC2=C1 VYXLCNODKYOLLJ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- VYXLCNODKYOLLJ-MRVPVSSYSA-N methyl 2-[(3r)-6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2C[C@H](CC(=O)OC)COC2=C1 VYXLCNODKYOLLJ-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- MHFFWCUFQLUBNB-VIFPVBQESA-N ethyl 2-[(3s)-6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2C[C@@H](CC(=O)OCC)COC2=C1 MHFFWCUFQLUBNB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- WRADELAVAFRPDW-SSDOTTSWSA-N 2-[(3r)-6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetic acid Chemical compound O1C[C@@H](CC(O)=O)CC2=CC(N)=CC=C21 WRADELAVAFRPDW-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 241001503905 Laceyella sacchari Species 0.000 description 1
- 241000589579 Planomicrobium okeanokoites Species 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000010426 asphalt Substances 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 150000002168 ethanoic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- MHFFWCUFQLUBNB-SECBINFHSA-N ethyl 2-[(3r)-6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl]acetate Chemical compound C1=C(N)C=C2C[C@H](CC(=O)OCC)COC2=C1 MHFFWCUFQLUBNB-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate Substances CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- AOWVZVMVEYRSGX-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(6-amino-3,4-dihydro-2h-chromen-3-yl)acetate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1=C(N)C=C2CC(CC(=O)OC)COC2=C1 AOWVZVMVEYRSGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
- C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
광학활성 크로만-3-아세트산 및 광학활성크로만-3-아세트산에스테르는, 하기 일반식(Ⅰ)
[식중, R1은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기알킬기, R2는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환아미노기임]의 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테라제 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 또는 그로부터의 프레파라트로 처리함으로써 얻을 수 있다. 또, 슈도노카르디아속의 세균으로부터 유래된 신규의 에스테라제도 상기 에스테라제로서 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 에스테르의 가수분해용의 촉매로서 유용한 신규의 에스테라제(에스테르가수분해효소), 상기 에스테라제의 분리방법, 상기 에스테라제를 이용한 에스테르화합물의 (R)-형과 (S)-형의 혼합물의 카이네틱 분할(kinetic resolution)방법 및 상기 에스테라제를 이용해서 의약재로서 유용한 광학활성(즉, 선광성)크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은 후술하는 일반식(Ⅰ)로 표시되는 (3R)- 및 (3S)-크로만-3아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물 또는 그로부터의 프레파라트(preparation)로 처리하여 광학활성크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근, 유기합성에 있어서 효소를 이용하는 시도가 다수 행해지고 있다. 특시, 각종 에스테르화합물을 선택적으로 광학선택적 가수분해를 행함으로써 광학활성 화합물을 얻거나 프로카이럴에스테르화합물로부터 카이럴화합물을 제조하기 위한 높은 기질특이성을 지닌 에스테라제를 이용하는 것은 공업적효율이 높다.
돼지의 간으로부터 유래된 에스테라제는 일반적으로 전술한 바와 같은 목적에 사용되나, 그 비용이 높고 입수성이 한정되어 있어 공업적 용도가 제한되어 있었다. 또, 돼지의 간으로부터 유래된 에스테라제대신에 미생물원으로부터의 에스테라제를 이용하는 것이 시도되어 왔다. 상이한 유기체로부터 유래된 효소는 그들의 기질특성이 특이하게 다르므로, 효소의 선택성 및 반응속도가 해당효소를 적용하는 화합물에 따라 현저하게 변화한다.
예를 들면, 유럽특허공보 제 709370호 및 제 760364호에 개시된 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르는, 항혈소판의 유용한 중간체이지만, 상기 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르에 대해 높은 광학선택성을 발휘하는 동시에 이들을 효율적으로 가수분해할 수 있는 에스테라제는 보고되어 있지 않다.
본 발명의 목적은, 광학선택성을 지니고, 또한 의약재로서 유용한 광학활성크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하기 위한 촉매로서 유용한 에스테라제를 얻는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명자들은, 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 연구한 결과, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물 또는 그로부터의 프레파라트로 처리함으로써 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 또, 본 발명자들은 각종 정제기술을 이용해서 슈도노카르디아(Psuedonocardia)속의 미생물로부터 열 및 pH안정성이 우수하고 광학선택적 가수분해활성을 지닌 신규의 에스테라제를 발견하였다.
즉, 본 발명은 에스테르의 가수분해용의 촉매로서 유용한 슈도노카르디아속의 미생물에서 발견한 신규의 에스테라제, 상기 에스테라제의 분리방법, 상기 에스테라제를 이용한 (R) 및 (S)에스테르화합물의 혼합물의 카이네틱분할방법 및 상기 에스테라제를 이용해서 의약제로서 유용한 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또, 본 발명은, 하기 일반식(I)
[식중, R1은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기의 알킬기, R2는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환의 아미노기임]로 표시되는 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소 혹은 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 또는 그로부터의 프레파라트로 처리해서 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
[1] 효소함유미생물 및 이 미생물의 배양방법:
목료로 하는 신규의 에스테라제는 슈도노카르디아써모필라(Pseudonocardia thermophila) FERM BP-6275의 세포에 함유되어 있고, 이들 세포는 공지의 방법에 의해 배양할 수 있다. 고기추출물(meat extract), 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤 및 NZ아민 등의 유기영양원; 글루코스, 말토스, 슈크로스, 전분 및 유기산 등의 탄소원; 황산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등의 질소원; 인산염, 마그네슘, 칼륨 및 철 등의 무기영양원; 및 비타미늘 적절하게 조합해서 사용할 수 있다. 상기 세포는 배지에 있어서 pH 6∼9, 30℃∼60℃, 바람직하게는 45℃∼55℃의 온도에서 호기성으로 배양하며, 이 때의 배양은 목표로 하는 에스테라제함량이 최대치에 이를때까지 행한다.
[2] 효소의 정제:
효소는 종래의 효소정제법을 이용해서 정제시킬 수 있다. 세포는 완전한 배양액으로부터 원심분리에 의해 거두어들여, 고주파음에 의한 분해, 프렌치프레셔셀프레스(FRENCH PRESSURE CELL PRESS; 상품명), 다이노밀(DYNO-MILL; 상품명)등을 이용해서 기계적으로 분해시킨다. 세포부스러기 등의 고체를 원심분리에 의해 제거하여 미가공상태의 효소액을 얻는다. 다음에, 이 효소를 황산암모늄 또는 기타 염에 의한 염석, 겔여과, 이온교환크로마토크래피, 소수성크로마토그래피, 결정화법 등에 의해 정제한다. 그 일례가 실시예 1에 설명되어 있다.
[3] 효소활성측정:
라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 1.0μmol, 인산칼륨완충액(pH 7.2)0.1mmol 및 에스테라제 적량을 함유하는 반응혼합물(1㎖)을 55℃에서 30분간 반응시킨 후, 이 반응혼합물의 일부를 10mM 인산나트륨완충액 (pH6.0)-30％아세토니트릴용액으로 희석하고, 고속액체크로마토그래피에 의해 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 6-아미노크로만-3-아세트산을 각각 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 10mM인산나트륨완충액(pH6.0)-30％아세토니트릴을 사용해서 이너트실 ODS-2칼럼(GL사이언스사제품)상에서 0.7㎖/분의 유속으로 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 다음에, 나머지 반응액에 동일체적의 클로로포름등을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 이어서, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또, 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. 이와 같이 해서 제조한 용액중의 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량 측정하여 광학순도를 구하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올용액(3:2 체적비)을 사용해서 키랄셀 OD-H광학분할칼럼(다이셀카가쿠사제품)상에서 0.5㎖/분의 유속으로 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정 검출하였다.
6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 1μmol을 1분당 가수분해하는 효소의 양을 1유닛으로 정의하였다.
[4] 효소의 균질성
트리스-글리신완충액을 이용한 10-20％겔(네이춰 227,680,1970)상에서 램리법(Laemmli method)에 의해 SDS폴리아크릴아미드겔 전기이동을 행하였다. 쿠마시 브릴리언트블루에 의한 착색후, 균질한 단백질띠를 관찰한 결과, 이 단백질의 분자량은 종래의 표준단백질에 비해서 50000±2000으로 측정되었다.
[5] 효소의 특성:
본 발명의 에스테라제의 특성은 다음과 같았다.
(1) 효소작용
효소는 에스테르화합물을 카르복시기를 지닌 화합물과 알콜화합물로 가수분해할 때 및 에스테르화합물과 알콜화합물간에 에스테르교환반응할 때 촉매로서 작용한다.
(2) 기질특이성
효소는 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 (R)형을 우선적으로 가수분해한다.
직쇄의 지방산과 p-니트로페놀의 에스테르에 대해서, 지방산의 탄소수가 적을수록, 가수분해활성이 강하다.
(3) 분자량
효소의 분자량은 50000±2000(SDS-PAGE)이다.
(4) 최적 pH
pH7∼10에서 가수분해가 최적으로 일어난다.
(5) 최적온도
0.1M인산완충액(pH 7.2)중에서 55℃∼60℃에서 가수분해가 최적으로 일어난다.
(6) 온도안정성
온도 60℃이하, pH7.2에서 90%의 가수분해활성은 30분간 유지할 수 있다.
(7) pH안정성
5∼10의 pH범위에서 효소가 안정하다.
(8) 억제제
0.1M인산버퍼액(pH 7.2)중에서 30℃, 30분간 각종 억제제에 의한 처리시, 효소의 활성은, 황산구리(1mM)에 의해서는 30％, 불화페닐메틸술포닐(0.1mM)에 의해서는 85％, 그리고 디이소프로필 플루오로포스페이트(0.5mM)에 의해서는 15％ 손실된다. 또, 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM)에 의해서는 효소활성반응이 관측되지 않는다. 이점은, 이하의 실시예에 있어서 더욱 상세히 설명한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 효소는, 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르에 대해 입체특이적으로 작용하는 동시에 내열성 및 pH안정성이 우수한 에스테라제이다.
일반식(Ⅰ)의 화합물은 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275로부터 상기 에스테라제의 존재하에 입체선택적으로 가수분해될 수 있다.
본 발명은 또한, 미생물에 의해 제공된 에스테르가수분해효소를 이용한 광학분할을 포함한다. 본 발명에 있어서 사용되는 에스테라제 또는 에스테르가수분해효소를 함유하는 미생물은, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물에서 광학화합물의 어느 하나를 우선적으로 가수분해하는 미생물일 수 있다. 이러한 미생물의 예로서는, 슈도노카르디아속, 플라보박테리움(Flavobacterium)속 및 써모악티노미세스(Thermoactinomyces)속의 것을 들 수 있다. 이런 미생물의 특수예로는, 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275, 플라보박테리움 오케아노코이테이스(Flavobacterium okeanokoites)FERM BP-6276, 써모악티노미세스 삭카리(Thermoactinomyces sacchari)ATCC-27375, 플라보박테리움 오케아노코이테이스 IFO 15880 등을 들 수 있다. 균주 FERM BP-6275 및 FERM BP-6276은, 부타페스트조약에 의거 1998년 2월 27일, 이들 수탁번호하에, 일본국, 이바라키켕(305-8566), 추쿠바시 히가시 1쪼메 1-3의 the National Institute of Bioscience and Human-Technology of The Agency of Industrial Science and Technology in the Ministry of International Trade and Industry에 수탁되어 있다. 또, ATCC번호를 지닌 균주는, ATCC(The American Type Culture Collection, 미합중국, 매릴랜드 20852, 록빌, 12301파크론드라이브)로부터 시판되고 있다. 또, IFO번호를 지닌 균주도 일본국 오사카후(532) 요도가와쿠 2쪼메 쥬소혼마찌 17-85의 the Institution for Fermentation Osaka로부터 시판되고 있다.
이들 미생물은 본 발명에 필요한 능력을 지니는 한 특히 제한되지 않는다. 사용되는 미생물의 예로서는, 예를 들면 자외선방사나 돌연변이제의 사용 또는 유전자공학의 도입에 의해 얻어진 돌연변이균주를 들 수 있다.
미생물배양균 또는 이들로부터의 프레파라트는, 이들이 본 발명에 필요한 필수능력을 지니는 한 특히 제한되지 않는다. 미생물배양균의 예로서는, 배양액 및 미생물세포 등을 들 수 있다. 배양균으로부터의 프레파라트의 예로는, 세정세포, 건조세포, 배양상등액, 세포부스러기, 세포자동소화물, 세포추출물 또는 종래의 방법을 이용해서 정제 또는 부분적으로 정제한 효소프레파라트 등의 분해세포 등을 들 수 있다. 또, 이들 미생물배양균 및 이들로부터의 프레파라트는 고정화시켜 사용할 수 있다. 고정화방법으로서는, 플라아크릴아미드, 알길산 및 카라게닌으로 처리하는 방법, 또는 공유결합법이나 흡착법 등의 공지의 방법을 이용해서 적절한 캐리어상에 고정시키는 방법을 들 수 있다.
배지로서는, 이 분야에서 미생물을 배양하는 데 일반적으로 사용하는 것이면 어떠한 것이라도 사용가능하다. 예를 들면, 고기추출물, 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤 및 NZ아민 등의 유기영양원; 글루코스, 말토스, 슈크로스, 전분 및 유기산 등의 탄소원; 황산암모늄, 우레아 및 염화암모늄 등의 질소원; 인산염, 마그네슘, 칼륨 및 철 등의 무기영양원; 및 비타민 등을 적절하게 조합해서 사용할 수 있다. 또, 배양은 pH 6∼9, 온도 20℃∼60℃에서 호기성으로 행할 수 있으나, 폴라보박테리움 오케아노코이테스 FERM BP-6276에 대해서는 28℃∼37℃의 온도에서의 배양이 바람직하고, 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275 및 써모악티노미세스 삭카리 ATCC-27375에 대해서는 45℃∼55℃의 온도에서의 배양이 바람직하다. 또한, 이때의 배양은 목표로 하는 에스테라제 함량이 최대치에 이를 때까지 1∼7일간 행한다.
살아 있는 배양세포 및 배양상등액은, 전술한 바와 같이, 미생물을 배양함으로써 얻어진 배양액으로부터 원심분리나 여과 등의 처리에 의해 제조한다. 세정세포는 생리식염수로 살아 있는 세포를 세정함으로써 제조한다. 또, 건조세포는 살아 있는 세포나 세정세포를 냉동건조 또는 아세톤건조함으로써 제조한다. 분해세포는 초음파분해, 프렌치프레스, 삼투압, 냉동용융, 세포용해효소의 사용 또는 계면활성제 및 유기용제에 의한 처리 등의 각종 물리화학적처리를 이용해서 제조한다. 또, 정제 또는 부분정제효소는, 예를 들면 분해세포 또는 배양상등액으로부터, 황산암모늄석출, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 또는 소수성크로마토그래피 등의 종래의 방법을 이용한 분류에 의해 얻는다.
상기 일반식(Ⅰ)에 있어서의 R1기의 예로는, 탄소수 1∼5의 직쇄 및 분기알킬기, 보다 구체적으로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기 또는 부틸기, 보다 바람직하게는, 메틸기 또는 에틸기를 들 수 있다.
R2가 아미노기일 경우 치환기의 예로는 아세틸기, tert-부톡시카르복실기 또는 벤질옥시카르보닐기를 들 수 있다.
반응에 역효과를 주지 않는 반응매체 또는 그의 혼합물을 광학선택적 가수분해용으로 사용해도 된다. 반응매체는, 물 또는 물과 물혼화성 용매(water- miscible-solvent)의 혼합물을 이용한 균질계, 혹은 물과 물비혼화성 용매(non- water-miscible-solvent)의 혼합물을 이용한 2상계이어도 된다.
물혼화성 용매의 예로서는, 탄소수 1∼4의 직쇄 또는 분기알콜, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 및 테트라하이드로푸란을 들 수 있다. 이 물혼화성 용매는 수중 0.1∼20％(v/v)범위의 양으로 사용하면 된다.
한편, 물비혼화성 용매의 예로는, 톨루엔 및 크실렌 등의 유기용제를 들 수 있으며, 이 물비혼화성 용매의 양은 수중 1.0∼40.0％(v/v)범위이면 된다.
반응용매에 첨가하는 라세미크로만-3-아세트산에스테르의 농도는, 일반적으로는 0.01∼50％(w/v), 바람직하게는 0.01∼20％(w/v)이다.
반응은, 실온에서, 또는 바람직하게는 15∼70℃보다 바람직하게는 20∼60℃에서의 가열하에 행한다.
반응액의 pH는 가수분해효소나 미생물원의 종류에 따라 다르지만, 일반적으로 pH3∼11에서 반응을 행한다. 가수분해가 진행함에 따라 반응액의 pH가 변화할 경우에는 pH를 최적 pH로 제어하는 것이 바람직하다.
또, 기질과 효소와의 반응성은 반응액에 계면활성제 등을 첨가함으로써 향상시킬 수 있다.
광학선택적 가수분해의 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르와 광학활성 크로만-3-아세트산의 분리는, 물 또는 물과 물혼화성 용매와의 혼합물을 이용한 균질계에 있어서 물비혼화성 추출용매로 광학활성 크로만-3-아세트산을 추출하거나, 물과 물비혼화성 용매의 혼합물 또는 물 및 물혼화성용매와 물비혼화성 용매의 혼합물을 이용한 2상계에 있어서 유기용매층과 물층을 분리함으로써 매우 쉽게 행할 수 있다. 목적으로 하는 용도에 따라, 얻어진 유기용매층속의 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르를 용액상태로, 또는 상기 용매를 제거한 후의 합성중간체로서 사용할 수 있다. 적절한 용제를 이용한 결정화에 의해 보다 높은 광학순도의 광학활성 크로만-3-아세트산을 얻을 수 있다. 또, 물층속의 광학활성 크로만-3-아세트산은, 여과 등의 공지의 방법을 이용해서 세포질성분을 제거한 후 농축된 결정화 등의 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하지만, 이들 실시예가 본 발명의 한계를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 에스테라제함유 미생물의 배양방법
0.1% 효모추출물, 0.1% 고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(TYPE1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01%황산마그네슘 및 1.0% 가용성전분(pH7.4)을 함유한 위생배지(1ℓ)에, 마찬가지의 배지에서 미리 배양된 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275의 5%배양액을 배양하였다. 52℃에서 96시간 호기성으로 배양한 후, 얻어진 배양액을 원심분리하여 젖은 상태의 세포 10g을 얻었다.
실시예 2: 에스테라제의 정제
실시예 1에서 얻어진 세포를 0.05M 인산칼륨완충액(pH7.2)100㎖중에 현탁시키고, 초음파처리에 의해 분산시킨 후, 프렌치프레스를 사용해서 분해시켰다. 원심분리(15000×g, 20분)에 의해 세포부스러기를 제거하여 세포없는 추출물을 얻었다. 이 세포없는 추출물에 황산암모늄을 60%까지 첨가하고, 원심분리에 의해 침전물로서 활성분획(active fraction)을 얻었다. 이 침전물을 상기 완충액 100㎖에 용해시켜 얻은 용액을, 캐리어로서 울트로겔ACA 44(상품명; 파마시아사제품)를 이용해서 겔여과를 행하였다. 활성분획을 모아 데아에 토요펄(DEAE TOYO PEARL)650M(상품명; 토소사제품)칼럼에 넣고, 직선농도기울기를 이용해서 0.8M 황산암모늄 및 완충액을 함유한 완충액으로 용리를 행하였다. 얻어진 활성분획을 환외여과를 이용해서 농축하고, 완충액에 대해서 투석하여, 에스테라제를 균질하게 정제하였다. 이 정제처리과정을 표 1에 요약하였다.
| 처리과정 | 전체활성도(총유닛) | 전체단백질(㎎) | 비활성도(유닛/㎎) |
| 1. 세포없는 액추출 | 677 | 185 | 3.7 |
| 2. 황산암모늄침전(＜60%) | 425 | 125 | 3.4 |
| 3. 겔여과(울트로겔 ACA44분획범위 MW:10,000-100,000) | 358 | 25 | 14.6 |
| 4. 데아에토요펄 650S | 262 | 10 | 26.2 |
| 5. 페닐토요펄 650M | 143 | 2 | 71.5 |
실시예 3: 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 광학선택적가수분해
실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 이하의 조건하에서 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 또는 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 가수분해하였다.
0.1mmol인산칼륨완충액(pH7.2), 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 10㎛ol 및 적량의 에스테라제를 함유한 반응액(1㎖)을 55℃에서 30분간 반응시킨 후, 이 반응액의 일부를 10mM인산나트륨완충액(pH6.0)-30%아세토니트릴용액으로 희석하고, 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르와 6-아미노크로만-3-아세트산을 각각 고속액체크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 10mM 인산나트륨완충액(pH 6.0)-30%아세토니트릴용액을 이용한 이너트실 ODS-2칼럼(GL사이언스사제품)상에서 0.7㎖/분의 유속으로 용리를 행하였다. 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 다음에, 나머지 반응액에 동등한 체적의 클로로포름을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 그후, 클로로포름을 진공하에 증류제거한 후, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또 헥산/에탄올 (3/2, v/v)용액으로 희석하였다. 이와 같이 해서 제조한 용액중의 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르와 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량적으로 측정하여 광학순도를 구하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올(3:2, 체적비)을 이용한 키랄셀 OD-II광학분할칼럼(다이셀사제품)상에서 용리를 행하고, 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다.
6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르대신에 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 이용해서 이상의 처리를 반복한 후, 반응액중의 (R) 6-아미노크로만-3-아세트산의 양과 헥산/에틸올용액중의 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 및 (R) 6-아미노크로만-3-아세트산 에틸에스테르의 양을 상기와 마찬가지 방법으로 구하였다.
그 결과를 표 2에 표시한다.
| 라세미기질 | 6-아미노크로만-3-아세트산(μ㏖) | 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르(μ㏖) | 광학순도(%ee) |
| 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 | 6.0 | 4.0 | S99 |
| 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 | 6.2 | 3.8 | S99 |
실시예 4: 기질로서 직쇄지방산의 에스테르를 이용한 가수분해
각종 p-니트로페닐에스테르중 1종을 1mM 함유하는 0.2M인산칼륨완충액(pH 7.0)2.5㎖에 적량의 효소액을 가하고, 얻어진 반응액을 45℃에서 8분간 배양하였다. 메탄올 1㎖를 첨가함으로써 반응을 중지시킨 후, 400㎚에서의 흡광도의 증가를 구하였다. 제어시료용으로, 효소액 대신에 완충액을 사용하였다. 흡광도의 변화로부터 p-니트로페닐에스테르에 대한 상대활성도를 산출하였다. 그 결과를 표 3에 표시한다.
| 기질 | 상대활성도(%) |
| p-니트로페닐아세트산에스테르 | 100 |
| p-니트로페닐카프르산에스테르 | 12 |
| p-니트로페닐라우르산에스테르 | 0.6 |
실시예 5: 효소반응에 대한 최적pH
실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 최적pH를 조사했다. 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 10μ㏖, 하기와 같은 각종 pH범위를 제공하는 완충액중 1종 0.1mmol 및 에스테라제 0.1유닛을 함유하는 반응혼합물(1.0㎖)을 55℃에서 30분간 배양하였다. 반응후, 동일체적의 클로로포름을 첨가하여 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 그후, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또, 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. 고속액체크로마토그래피에 의해 (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 정량적으로 측정하였다. 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 양의 감소에 의해 효소활성을 측정했다.
완충액으로서는, pH5.0∼7.2의 인산칼륨완충액, pH8.0∼9.5의 트리스-HCl완충액 및 pH10.0의 CAPS완충액(Good buffer)을 이용했다. 표 4의 결과에 표시한 바와 같이 최적pH는 8.0∼10.0범위였다.
실시예 6: 효소의 pH안정성
실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 pH안정성을 조사했다. 실시예 5에서와 마찬가지로 특정pH의 0.1M완충액에 에스테라제 0.5유닛을 첨가하고, 이 용액을 30℃에서 30분간 유지시킨 후 효소 0.1유닛을 이용해서 나머지활성도를 측정하였다. 상대활성도는 pH처리하지 않은 제어시료의 100%에스테라제활성도에 의거한 것이다. 표 4의 결과, pH 5.0∼10.0범위에서의 활성도에는 거의 변화가 없었다.
| pH | 최적pH#(실시예 5) | pH안정성*(실시예 6) |
| 5.0 | 28 | 97 |
| 6.0 | 65 | 98 |
| 6.5 | 80 | 100 |
| 7.2 | 90 | 100 |
| 8.0 | 93 | 100 |
| 8.5 | 93 | 100 |
| 9.5 | 94 | 100 |
| 10.0 | 100 | 99 |
#: pH10에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도
*: 특정pH에서 30분간 유지한 후 효소반응없이 pH7.2에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도
실시예 7: 효소반응에 대한 최적온도
반응온도를 30℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 및 70℃로 하고 완충액으로서 인산칼륨완충액(pH7.2)을 사용한 것을 제외하고 실시예 5와 마찬가지로 반응을 행하였다. 그 결과, 활성도는 60℃에서 최고였다. 또, 상대활성도는 60℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 것이다(표 5).
실시예 8: 효소의 온도안정성
실시예 2에서 균질하게 정제된 에스테라제를 이용해서 온도안정성을 조사하였다. 0.1mmol인산칼륨완충액(pH7.2)에 에스테라제 0.1유닛을 첨가하여 총체적을 0.95㎖로 하였다. 이 혼합액을 특정온도, 즉, 30℃, 40℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 70℃에서 30분간 유지하고, 여기에, 0.2M라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르 0.05㎖을 첨가하고, 55℃, 30분간 반응을 행한 후, 나머지 활성도를 측정하였다. 상대활성도는 열처리하지 않고 얻어진 100% 에스테라제활성도에 의거한 것이었다. 표 5의 결과, 90%이상의 활성도가 60℃까지의 온도에서 유지된 것을 알 수 있다.
| 온도(℃) | 최적온도#(실시예 7) | 온도안정성*(실시예 8) |
| 30 | 24 | 100 |
| 40 | 43 | 100 |
| 50 | 69 | 100 |
| 55 | 75 | 100 |
| 60 | 100 | 90 |
| 70 | 35 | 0 |
#: 60℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도
*: 특정온도에서 30분간 유지한 후 효소반응없이 55℃에서 얻어진 100%활성도에 의거한 상대활성도
실시예 9: 억제제의 효과
실시예 2에서 균질하게 정제된 각종 억제제의 효과를 조사했다. 에스테라제 0.1유닛, 인산칼륨완충액(pH7.2)0.1mmol 및 특정억제제를 혼합하여 총체적을 0.95㎖로 하고, 이 혼합액을 30℃에서 30분간 유지하고, 여기에, 0.2M라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르하이드로클로라이드 0.05㎖를 첨가하고, 55℃에서 30분간 반응을 행한 후, 나머지 활성도를 측정하였다. 상대활성도는 억제제없이 얻어진 100%에스테라제활성도에 의거한 것이었다. 얻어진 결과를 표 6에 표시하였다. 금속중, Cu2+가 억제제였고, 기타, 불화페닐메틸술포닐(PMSF), 프로테아제억제제 및 디이소프로필플루오로인산(DFP)이 억제제였다. 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM)등의 계면활성제에 의해서는 효소활성의 현저한 감소는 관측되지 않았다(표 6).
| 억제제 | 상대활성도 |
| 없음 | 100 |
| FeSO41 mM | 92 |
| CoCl21 mM | 102 |
| MmSO41 mM | 99 |
| NiCl21 mM | 92 |
| CuSO41 mM | 21 |
| CaCl21 mM | 96 |
| ZnCl21 mM | 101 |
| EDTA 5 mM | 103 |
| PMSF 0.1 mM | 84 |
| DFP 0.5 mM | 6 |
| DTT 0.1 mM | 102 |
| SDS 5mM | 99 |
| 데옥시콜산나트륨 | 102 |
실시예 10: 미생물에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 광학선택적 가수분해
각종 미생물을 한천사면배지상에서 표 7에 표시한 조건하에 각각 배양하였다. 세포배양액의 하나의 백금선을, 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르하이드로클로라이드 2.5㎎과 인산칼륨 0.1mmol(pH7.2)을 함유하는 반응액 1㎖에 현탁시키고, 이 반응액을 30℃에서 16시간 반응시킨 후, 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 동일체적의 클로로포름에 의해 추출하였다. 다음에, 클로로포름을 진공하에 증류제거하고, 얻어진 잔류물을 에탄올에 용해시키고, 또 헥산/에탄올용액(3/2, v/v)으로 희석하였다. (3S)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르 및 (3R)-6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 각각 정량적으로 측정하였다. 캐리어로서 헥산/에탄올(3:2 체적비)을 사용한 키랄셀 OD-II광학분할칼럼(다이셀사제품)상에서 0.5㎖/분의 유속으로 용리를 행하였다. 254㎚에서의 흡광도를 측정검출하였다. 결과를 표 7에 표시한다.
| 미생물균주 | 배양조건 | S-에스테르함량(㎎/㎖) | R-에스테르함량(㎎/㎖) |
| 플라보박테리움오케아노코이테스 IFO 15880 | A | 0.98 | 0.00 |
| 써모악티오미세스삭카리 | B | 1.20 | 0.73 |
배양조건 A:
효모추출물 0.5%
박토트립톤 1.0%
염화나트륨 1.0%
한천 1.5%
pH: 7.3 ; 배양온도: 30℃
배양조건B:
효모추출물 0.1%
고기추출물 0.1%
NZ아민 0.2%
말토스 1.0%
한천 1.5%
pH: 7.3 ; 배양온도 : 45℃
실시예 11: 슈도노카르디아 써모필라에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르의 광학선택적 가수분해
0.1% 효모추출물, 0.1%고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(TYPE1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01% 황산마그네슘 및 1.0% 가용성 전분을 함유한 위생배지(pH7.4) 10㎖에, 마찬가지의 배지에서 미리 배양된 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275의 5%배양액을 배양하였다. 52℃에서 72시간 배양을 행하고, 원심분리에 의해 얻어진 젖은 세포를, 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 메틸에스테르 1g을 함유하는 반응액(pH8.0, 수산화칼륨으로 조정됨)50㎖에 첨가하고, 2% 수산화칼륨용액으로 pH를 8.0으로 유지하면서 55℃에서 3시간 가수분해반응을 행하였다. 반응후, 톨루엔 20㎖를 첨가하여 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 대부분은 톨루엔층으로 추출되었고, 가수분해된 6-아미노크로만-3-아세트산은 물층에 존재하였다. 상기 톨루엔층을 농축함으로써 99%이상의 순도를 지닌 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 얻었다(수율: 40%)
실시예 12: 슈도노카르디아 써모필라에 의한 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산 에틸에스테르의 광학선택적 가수분해
0.1% 효모추출물, 0.1%고기추출물(Ehrlich), 0.2% NZ아민(TYPE1), 0.5% 염화나트륨, 0.05% 인산 2수소칼륨, 0.1% 인산수소 2칼륨, 0.01%황산마그네슘 및 1.0% 가용성 전분을 함유한 위생배지(pH7.4), 10㎖에, 마찬가지의 배지에서 미리 배양된 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275의 5%배양액을 배양하였다. 52℃에서 72시간 배양을 행하고, 원심분리에 의해 얻어진 젖은 세포를 라세미 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르 1g을 함유하는 반응액(pH8.0, 수산화칼륨으로 조정됨)50㎖에 첨가하고, 2% 수산화칼륨용액으로 pH를 8.0으로 유지하면서 55℃에서 3시간 가수분해반응을 행하였다. 반응후, 톨루엔 20㎖를 첨가하여 미반응의 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르를 추출하였다. 나머지 6-아미노크로만-3-아세트산메틸에스테르의 대부분은 톨루엔층으로 추출되었고, 가수분해된 6-아미노크로만-3-아세트산은 물층에 존재하였다. 상기 톨루엔층을 농축함으로써 99%이상의 순도를 지닌 (S) 6-아미노크로만-3-아세트산에틸에스테르를 얻었다(수율: 35%).
본 발명자들은 상압·상온하에서 극소량으로 에스테르의 가수분해에 대해 촉매작용을 할 수 있는 동시에, 유용한 의약재의 중간체, 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르에 대해 광학선택적 가수분해활성을 지닌, 열 및 pH안정성이 우수한 신규의 에스테라제를 발견하였다. 이 에스테라제는, 의약재의 중간체로서 유용한 광학활성 크로만-3-아세트산 및 그의 에스테르를 간단하고 효율좋게 제조하는 데 사용할 수 있다. 또, 광학활성 크로만-3-아세트산 및 광학활성 크로만-3-아세트산에스테르는, (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물로부터, 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테라제나 상기 가수분해효소를 지닌 미생물, 혹은 그로부터의 프레파라트로 처리함으로서 용이하고 효율좋게 제조할 수 있다.
Claims (22)
- 이하의 물리화학적 특성을 지닌 것을 특징으로 하는 신규의 에스테라제.(1) 효소작용효소는 에스테르화합물을 카르복시기와 알콜로 가수분해할 때 및 에스테르화합물과 알콜간에 에스테르교환반응할 때 촉매로서 작용한다.(2) 기질특이성효소는 6-아미노크로만-3-아세트산에스테르의 (R)형을 우선적으로 가수분해한다.직쇄의 지방산과 p-니트로페놀의 에스테르에 대해서, 지방산의 탄소수가 적을수록, 가수분해활성이 강하다.(3) 분자량효소의 분자량은 50000±2000(SDS-PAGE)이다.(4) 최적pHpH7∼10에서 가수분해가 최적으로 일어난다.(5) 최적온도55℃∼60℃에서 가수분해가 최적으로 일어난다.(6) 온도안정성온도 60℃이하, pH7.2에서 90%의 가수분해활성을 30분간 유지할 수 있다.(7) pH안정성5∼10의 pH범위에서 효소가 안정하다.(8) 억제제0.1M 인산버퍼액(pH7.2)중에서 30℃, 30분간 각종 억제제에 의한 처리시, 효소의 활성은, 황산구리(1mM)에 의해서는 30%, 불화페닐메틸술포닐(0.1mM)에 의해서는 85%, 그리고 디이소프로필플루오로포스페이트(0.5mM)에 의해서는 15% 손실된다. 또, 라우릴황산나트륨(5mM) 또는 데옥시콜산나트륨(5mM)에 의해서는 효소활성반응이 관측되지 않는다.
- 제 1항기재의 에스테라제를 생성하는 슈도노카르디아속의 미생물을 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 해당 에스테라제를 분리하는 것을 특징으로 하는 제 1항기재의 에스테라제의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 슈도노카르디아속의 미생물은 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275인 것을 특징으로 하는 에스테라제의 제조방법.
- (a) 반응매체에 있어서 제 1항 기재의 에스테라제를 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물과 접촉시켜서, (R)-에스테르화합물 및 (S)-에스테르화합물중의 어느 한쪽을 입체선택적 가수분해함으로써 광학활성 산화합물을 얻는 공정; 및(b) 상기 반응매체로부터 상기 광학활성 산화합물 또는 가수분해되지 않고 남아있는 광학활성 에스테르를 회수하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 에스테라제는, 분리·정제된 효소, 가공되지 않은 효소프레파라트, 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포, 상기 미생물의 배양상등액, 상기 미생물의 세포부스러기 및 상기 미생물의 세포로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되어, 상기 에스테라제 또는 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포를 고정화시킨 형태의 하나인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 에스테르화합물은, 하기 일반식(I)[식중, R1은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기알킬기, R2는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환아미노기임]의 크로만화합물인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 R2는 아미노기인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 R1은 메틸기 또는 에틸기인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 반응매체는 물과 비혼화성 유기용매의 2상계로 이루어진 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 방향족 탄수화물인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 톨루엔 또는 크실렌인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매의 첨가량은 수중 1.0∼40.0%(v/v)인 것을 특징으로 하는 (R)-에스테르화합물과 (S)-에스테르화합물의 혼합물의 광학분할방법.
- (a) 하기 일반식(I)[식중, R1은 탄소수 1∼5의 직쇄 또는 분기알킬기, R2는 수소원자 또는 치환 혹은 무치환 아미노기임]의 (3R)- 및 (3S)-크로만-3-아세트산에스테르의 혼합물을, 반응매체에 있어서 광학선택적 가수분해활성을 지닌 에스테르가수분해효소와 접촉시켜 광학활성 크로만-3-아세트산화합물을 얻는 공정; 및(b) 상기 반응매체로부터 상기 얻어진 광학활성크로만-3-아세트산화합물 또는 가수분해되지 않고 남아있는 광학활성에스테르를 회수하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 에스테라제는, 분리·정제된 효소, 가공되지 않은 효소프레파라트, 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포, 상기 미생물의 배양상등액, 상기 미생물의 세포부스러기 및 상기 미생물의 세포로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되어, 상기 에스테라제 또는 상기 에스테라제를 지닌 미생물의 세포를 고정화시킨 형태의 하나인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 미생물은 슈도노카르디아속, 플라보박테리움속 및 써모악티노미세스속으로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 미생물은 슈도노카르디아 써모필라 FERM BP-6275, 플라보박테리움 오케아노코이테스 FERM BP-6276 및 써모악티노미세스삭카리 ATCC- 27375로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 반응매체는 물과 비혼화성유기용매의 2상계로 이루어진 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 방향족 탄수화물인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매는 톨루엔 또는 크실렌인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 비혼화성 유기용매의 첨가량은 수중 1.0∼40.0% (v/v)인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 R2는 아미노기인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 R1은 메틸기 또는 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학활성 크로만-3-아세트산 또는 광학활성 에스테르의 제조방법.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP97-193949 | 1997-07-18 | ||
| JP1997-193949 | 1997-07-18 | ||
| JP19394997 | 1997-07-18 | ||
| JP1997-219758 | 1997-08-01 | ||
| JP21975897 | 1997-08-01 | ||
| JP31999597 | 1997-11-20 | ||
| JP1997-319995 | 1997-11-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19990013989A true KR19990013989A (ko) | 1999-02-25 |
| KR100300443B1 KR100300443B1 (ko) | 2001-09-06 |
Family
ID=27326840
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019980029029A KR100300443B1 (ko) | 1997-07-18 | 1998-07-18 | 신규의에스테라제및광학활성크로만화합물의제조방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6060290A (ko) |
| EP (1) | EP0892044B1 (ko) |
| KR (1) | KR100300443B1 (ko) |
| CN (1) | CN1218110A (ko) |
| DE (1) | DE69828338T2 (ko) |
| HU (1) | HUP9801621A3 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030012964A (ko) * | 2001-08-06 | 2003-02-14 | 주식회사 제노포커스 | 광학활성 α-치환 헤테로시클릭카르복실산 에스테르의제조방법 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0892044B1 (en) * | 1997-07-18 | 2004-12-29 | Mitsui Chemicals, Inc. | Esterase and its use for the production of optically active chroman compounds |
| WO2008000738A1 (de) | 2006-06-27 | 2008-01-03 | Basf Se | Proteine mit esterase-aktivität |
| PL2171061T3 (pl) * | 2007-07-04 | 2019-03-29 | Patheon Austria Gmbh & Co Kg | Preparat esterazy |
| WO2009080676A1 (en) | 2007-12-20 | 2009-07-02 | Basf Se | New calb muteins and their use |
| CN101979528B (zh) * | 2010-10-21 | 2012-05-30 | 北京农业生物技术研究中心 | 一种酯酶及其编码基因与应用 |
| EP3572523A1 (en) * | 2018-05-25 | 2019-11-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel carboxyesterhydrolases |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4430089A1 (de) * | 1994-08-25 | 1996-02-29 | Bayer Ag | Verfahren zur enzymatischen Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten |
| US5658796A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-19 | Seprachem, Inc. | Optical resolution of alkyl chroman-2-carboxylates |
| TW363051B (en) * | 1995-08-31 | 1999-07-01 | Mitsui Toatsu Chemicals | Substituted amidine derivatives and platelet aggregation inhibitor containing the same |
| EP0892044B1 (en) * | 1997-07-18 | 2004-12-29 | Mitsui Chemicals, Inc. | Esterase and its use for the production of optically active chroman compounds |
-
1998
- 1998-07-15 EP EP98305608A patent/EP0892044B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-15 DE DE69828338T patent/DE69828338T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-17 HU HU9801621A patent/HUP9801621A3/hu unknown
- 1998-07-17 US US09/118,275 patent/US6060290A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-18 CN CN98117243A patent/CN1218110A/zh active Pending
- 1998-07-18 KR KR1019980029029A patent/KR100300443B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-13 US US09/524,760 patent/US6303349B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030012964A (ko) * | 2001-08-06 | 2003-02-14 | 주식회사 제노포커스 | 광학활성 α-치환 헤테로시클릭카르복실산 에스테르의제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9801621A2 (hu) | 1999-08-30 |
| HU9801621D0 (en) | 1998-09-28 |
| EP0892044A2 (en) | 1999-01-20 |
| CN1218110A (zh) | 1999-06-02 |
| DE69828338D1 (de) | 2005-02-03 |
| HUP9801621A3 (en) | 2001-08-28 |
| US6303349B1 (en) | 2001-10-16 |
| EP0892044A3 (en) | 2001-05-02 |
| EP0892044B1 (en) | 2004-12-29 |
| DE69828338T2 (de) | 2005-06-02 |
| US6060290A (en) | 2000-05-09 |
| KR100300443B1 (ko) | 2001-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2623345B2 (ja) | 光学活性なα―置換有機酸の製造方法 | |
| JP2840722B2 (ja) | ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 | |
| KR100300443B1 (ko) | 신규의에스테라제및광학활성크로만화합물의제조방법 | |
| JP4941990B2 (ja) | Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ | |
| KR0139525B1 (ko) | 신규한 에스테라제 및 그의 제조방법 | |
| JP3858505B2 (ja) | Ｒ−３−キヌクリジノールの製造方法 | |
| WO2007026860A1 (ja) | 光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の製造方法 | |
| JP2847089B2 (ja) | 光学活性（ｒ）‐（‐）‐３‐ハロ‐１，２‐プロパンジオールの製造法 | |
| JPS6322188A (ja) | 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ | |
| US5492830A (en) | Enzymatic resolution of α-tertiary carboxylic acid esters | |
| EP0243167B1 (en) | A novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same | |
| EP0289804A2 (en) | Process for preparing optically active mercapto compound | |
| JP2840723B2 (ja) | ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法 | |
| JP3093039B2 (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| JP3866357B2 (ja) | 熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素 | |
| JPH02234678A (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
| JP2983695B2 (ja) | ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法 | |
| JP2946055B2 (ja) | 光学活性（ｓ）‐（＋）‐３‐ハロ‐１，２―プロパンジオールの製造法 | |
| KR100260837B1 (ko) | 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법 | |
| JPH11206398A (ja) | 光学活性クロマン−３−酢酸類及びそのエステルの製造法 | |
| JP3415218B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| JPH09107959A (ja) | リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
| JPH0632634B2 (ja) | 光学活性カルボン酸エステルの製造法 | |
| JP2869486B2 (ja) | 光学活性（ｒ）‐（‐）‐３‐ハロ‐１，２‐プロパンジオールの製造法 | |
| JP3893721B2 (ja) | 光学活性化合物の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 19980718 |
|
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 19980718 Comment text: Request for Examination of Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20000428 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20010412 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20010616 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20010618 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |