JP5553354B2 - エステラーゼの調製 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
本発明は、エステラーゼ活性があるタンパク質を調製する方法であって、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））株中で発現するステップを含んでなる方法に関する。
ブタ肝臓エステラーゼ活性があるタンパク質の高レベルの発現は、容易に実現されない。Ｌａｎｇｅら（２００１）［１］による報告は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中におけるブタ肝臓エステラーゼγ−イソ酵素（γ−ｒＰＬＥ）の低くはあるが検出可能な生成を示唆する。より最近では、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒら（２００７）［２］が方法について述べている。これらの著者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中でのブタ肝臓エステラーゼのγ−イソ酵素（γ−ｒＰＬＥ）の発現が、簡単な過程でないことを示した。追加的手段が取られなければ、このような発現は完全に失敗した。これらの手段は、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の選択だけでなく、シャペロンタンパク質の同時発現もまた暗示する。特に機能性γ−ｒＰＬＥの調製は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳと称されるかなりの量のシャペロンタンパク質を同時発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）中でのみ可能であると判明した。
少なくともγ−ｒＰＬＥの適切な発現で遭遇する問題の一部は、タンパク質中の複数ジスルフィド結合の存在に関する。
非常に意外にも、そしてＢｏｅｔｔｃｈｅｒら（２００７）［１］によって報告された教示に反して、ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）活性があるタンパク質の機能発現は、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒら（２００７）［１］によって開示される大規模な追加的手段なしに、そして特に追加的遺伝子の同時発現なしに、本発明に従って達成できることが発見された。
したがって本発明は、エステラーゼ活性があるタンパク質を調製する方法であって、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で発現するステップを含んでなる方法に関し、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有して、それぞれ配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられる。プラスミドからＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳを同時発現する必要なしに、正確に折りたたまれたエステラーゼが得られることは本発明の利点である。好ましい実施態様では、発現はプラスミドからのＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳの同時発現なしに起きる。
本発明のフレームワークでは、同一性は以下の標準パラメーターを使用して、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで、Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７〜２５０で述べられているようにして計算される。
タンパク質配列：
Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｏｐｅｎ ｇａｐ：５
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：２
Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ： １１
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ：１０
ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１
ヌクレオチド配列：
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ：１
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２
Ｏｐｅｎ ｇａｐ：１１
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ：１
Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ：１０
ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３
より好ましくは、本発明は、エステラーゼ活性があるタンパク質を調製する方法であって、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で発現するステップを含んでなる方法に関し、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１１のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有して、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられる。
さらなる実施態様によれば、本発明は、エステラーゼ活性があるタンパク質を調製する方法であって、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で発現させるステップを含んでなる方法に関し、遺伝子が、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられる。配列番号１２は、ＡＰＬＥのアミノ酸配列を表す。
別の実施態様によれば、本発明はエステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関し、生物が、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子を含有し、この遺伝子が、配列番号１１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有して、それぞれ配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられる。好ましい実施態様では、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳの同時発現のためのプラスミドを含まず、エステラーゼ活性があるタンパク質を生成できる。
特に本発明は、上述の方法に従った、エステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関し、生物はエステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子を含有し、遺伝子は配列番号１１のポリヌクレオチドと少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、好ましくは９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有して、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする。
特に本発明はまた、上述の方法に従ったエステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株にも関し、生物は、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含有する。
さらなる実施態様によれば、本発明は、エステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に関し、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の発現が、例えば突然変異によって消滅することで特徴づけられる。
本発明のさらなる実施態様によれば、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のグルタチオン還元酵素およびチオレドキシン還元酵素の双方の発現が消滅する。
Ｐｒｉｎｚら（１９９７）［３］は、還元酵素活性が消滅した株中でこのタンパク質が生成されれば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現されるジスルフィド架橋を含有するタンパク質（特にアルカリホスファターゼ）の活性が、より高くなることを教示した。また双方の還元酵素が消滅していれば、好気性条件下で成長できるようにする自然突然変異が起きることも示された。Ｂｅｃｋｗｉｔｈら（２００５）［４］は、生物が好気性条件下で成長する能力を復元する予想される自然突然変異を同定した。彼らは、ＡｈｐＣ遺伝子のコドン３６〜３９周辺における、ＴＣＴ三つ組みに富んだ領域中への３個のヌクレオチドの挿入を含んでなるこの遺伝子中の突然変異が、この効果を提供すると主張した。
Ｂｅｓｓｅｔｔｅら（１９９９）［５］は、Ｐｒｉｎｚら（１９９７）によって述べられた発現系をさらに詳しく分析し、ヘルパータンパク質ＤｓｂＣ（ジスルフィド結合イソメラーゼ）の同時発現が、活性組織プラスミノーゲン活性化因子および活性アルカリホスファターゼの発現を増強することを示した。さらに切断型ＤｓｂＣの細胞内発現が、機能性ジスルフィド結合イソメラーゼタンパク質をもたらすことが開示された。
本発明のさらなる実施態様によれば、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ジスルフィド結合を要するタンパク質の適切な折りたたみのためのジスルフィド結合を導入でき、または不適切なジスルフィド結合によって引き起こされる誤った折りたたみを修正できる、低分子量ヘルパータンパク質を生成するように、さらに改変された。
上で言及される適切な低分子量ヘルパータンパク質は、ジスルフィドイソメラーゼである。特に好ましい実施態様ではヘルパータンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤｓｂＣと表示されるタンパク質である（Ｂｅｓｓｅｔｔｅら（１９９９））。
本発明に従って適切に使用できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株よりも還元性がより低い細胞内環境の特質を有する。このような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の特定例は、グルタチオン還元酵素遺伝子およびチオレドキシン還元酵素遺伝子中に突然変異を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株である（Ｔｅｒｐｅ（２００６）［６］）。機能性に発現されると、これらの遺伝子は細胞質中のジスルフィド結合形成と対抗する。したがってジスルフィド結合を含有するタンパク質の異種性発現は、今まで、それぞれグルタチオンおよびチオレドキシン還元酵素の活性排除を要すると見なされた
しかしＰＬＥ活性があるタンパク質の機能発現の増大には、突然変異の１つのみで十分であることが発見された。
意外にも適切なエステラーゼをコードする遺伝子は、エステラーゼタンパク質をコードして、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）に適応したコドン使用頻度を有するポリヌクレオチドである。
特に本発明は、機能性エステラーゼタンパク質をコードして、配列番号１１のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％、少なくとも９５％の同一性があるヌクレオチド配列を有し、配列番号１２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関する。
本発明の実施態様では、本発明は、配列番号１１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、または配列番号４４のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性のヌクレオチド配列を有し、それぞれ配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする、エステラーゼ活性がある機能性タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
大量のタンパク質の生成は、とりわけ大規模発酵生産を受け入れやすい細菌や酵母のような微生物宿主中における、関心のあるタンパク質をコードする遺伝子の発現によって達成できる。細菌タンパク質発現系は、Ｔｅｒｐｅ（２００６）によって最近レビューされている。
本発明によれば、関心のあるタンパク質をコードするこのような遺伝子が、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で発現される。異種の遺伝子による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換は、電気穿孔、熱ショック形質転換、または化学形質転換などのあらゆる適切な方法によって達成できる。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換のためには、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子は、プラスミド、バクテリオファージまたはファージミドなどのベクターの一部であることができる。
本発明はまた、配列番号１１、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、または配列番号４４のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性があるヌクレオチド配列を有して、それぞれ配列番号１２、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での複製および発現に適したベクターにも関する。
ベクターは、例えば所望の遺伝子配列の選択、複製、遺伝子制御転写（開始および終結）およびクローニングに適した、必要な機能要素を含有すべきである。
本発明に従った使用に適した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ベクター、ベクター要素、形質移入法、形質移入生物の培養法、および所望ポリペプチドの収集および単離法の選択は、当業者には明らかであろう。
ブタ肝臓の抽出によって動物原料から得られる市販のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）調製品は、合成有機化学において広く使用されている。
市販の酵素製剤は、おそらく異なる基質特異性がある、少なくともいくつかのＰＬＥイソ酵素からなることが示されている。
市販のＰＬＥは、エステル加水分解の幅広い基質特異性およびエナンチオ選択性を活用する、多様な生触媒の反応において使用される。
例えば国際公開第０１／０９０７９号パンフレットは、（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルの（Ｒ）−鏡像異性体を選択的に加水分解するための動物由来ＰＬＥの使用について述べている。
医薬品製造では、特にウィルスおよびプリオンによって引き起こされる感染疾患に対する懸念のために、非動物由来原料のみを使用することへの関心が高まっており、組み換えＤＮＡ技術を使用したエステラーゼの微生物生産は、この問題の解決策を提供できる。
ＰＬＥの主要（γ−）イソ酵素の同定および発現に関する利用できる情報（マツシマら（１９９１）［７］、Ｌａｎｇｅら（２００１））に基づいて、ブタ肝臓からｃＤＮＡを調製しＰＬＥγ−イソ酵素関連配列についてスクリーンした。この目的のために、ＰＬＥγ−イソ酵素関連タンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を認識するＰＣＲプライマーがデザインされた。これらのいくつかのγ−ＰＬＥ関連ｃＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定することで、予期されたように既知のγ−ＰＬＥをコードするＤＮＡ配列が検索されたが、それに加えて５４８個のアミノ酸の内２１個で、成熟γ−ＰＬＥタンパク質とは異なる第２のＰＬＥイソ酵素が同定された。この新しいＰＬＥイソ酵素はＡＰＬＥ（代替えブタ肝臓エステラーゼ：Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｅｓｔｅｒａｓｅ）と称された。
基質特異性に関するγ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥイソ酵素双方の機能特性解析のために、Ｌａｎｇｅらによって述べられたのと同様のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での分泌タンパク質生成のためにデザインされた発現カセット中に、γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥの双方をコードするＤＮＡ配列を挿入した。後者の出版物とは対照的に、コードされるタンパク質中にＣ−末端アミノ酸配列ＨＡＥＬが存在する場合でさえ、双方のタンパク質の成功裏の発現が達成された。エステラーゼ活性は、α−ナフチル酢酸を使用した一般エステラーゼアッセイを使用して、活性判定によって同定された。
意外にもアミノ酸配列に９５％を超える同一性を有しながら、５−ハロゲン−２−アルキルペント−４−エン酸エステルの加水分解に関して、γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥ間で明白な差異が観察された。ＡＰＬＥはラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを非常に効率的に加水分解できたのに対し、γ−ＰＬＥはこの化合物を全く加水分解しなかった。さらにラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルの加水分解はＲ−鏡像異性体のみの選択的加水分解によることが示され、ＡＰＬＥは（２Ｓ，４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルに対して反応性を示さなかった。国際公開第０１／０９０７９号パンフレットで述べられているような動物由来ＰＬＥによる既知の５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルのエナンチオ選択的加水分解は、市販のブタ肝臓抽出物中に存在するマイナーなイソ酵素であるＡＰＬＥに起因できると結論づけることができた。
５−ハロゲン−２−アルキルペント−４−エン酸エステルをエナンチオ選択的に加水分解できる非動物由来エステラーゼ製剤の大規模生産のためには、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ベースのＡＰＬＥ発現レベルでは不十分である。したがって経済的生産のためには、工業規模の迅速で信頼できる生産が必要とされることを考慮して、代案のタンパク質生産システムが考察された。
ＰＬＥイソ酵素は構造的に非常に深く関連しており、タンパク質はその構造的な完全性および活性を保つために、分子内ジスルフィド結合を必要とすることが知られている。多数の魅力的な微生物タンパク質発現系は、本質的にピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）について上述したように、タンパク質が細胞外環境を標的とする場合にジスルフィド結合のみを形成させる。ほとんどの細菌、とりわけ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、細胞内に還元性環境を保つが、細胞質中で発現されるタンパク質中でジスルフィド結合が形成ができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異体について述べられており（Ｐｒｉｎｚら（１９９７））、様々な株が市販されている（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））。
Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒらはこのような大腸菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））株を活用して、熱ショックタンパク質の過剰発現によるγ−ＰＬＥタンパク質の適切な折りたたみを確実にするために、追加的手段が取られるという条件で、γ−ＰＬＥを成功裏に生成できることを示した。これらの熱ショックタンパク質またはシャペロンは、折りたたみまたは再折りたたみヘルパーとして機能し、タンパク質がそれらの自然な高次構造を獲得するのを助ける。Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒら（２００７）は、大量のシャペロンタンパク質の不在下では、活性γ−ＰＬＥの発現は観察されないと報告する。
意外にも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株中で、シャペロンタンパク質の同時の過剰発現を必要とせず、γ−ＰＬＥと比較すると５４８個のアミノ酸の内２１個のみが異なるＡＰＬＥが、活性エステラーゼ酵素として生成でき、様々な過剰発現シャペロンの存在下においてさえ、ＡＰＬＥ活性レベルへの影響は気付かれなかった。
さらにより意外には、（ブタ肝臓ｃＤＮＡから単離されたままの）天然ＡＰＬＥ遺伝子のコドン使用頻度を変更することで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株中におけるＡＰＬＥ発現に対する追加的増進が提供された。なおさらに意外には、特にピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子のセットと類似するようにコドン使用頻度を変更することが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）向けの「コドン最適化」を実施するよりも効率的であることが分かった（コドン表についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／を参照されたい）。この結果は、最適コドンが翻訳効率およびタンパク質生成レベルの増大を誘導するのでなく、むしろＤＮＡおよび誘導されたメッセンジャーＲＮＡ配列が、活性ＡＰＬＥタンパク質を生じる折りたたみ効率に対して直接的効果を有することを示唆する。
活性ＡＰＬＥ酵素生成のさらなる改善は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内在性ジスルフィド結合イソメラーゼ（ＤｓｂＣ）を過剰発現することで達成された。Ｂｅｓｓｅｔｔｅら（１９９９）によって既に示されたように、切断型のＤｓｂＣタンパク質を構築でき、このタンパク質の細胞内局在化がもたらされる。このような切断型ＤｓｂＣタンパク質の発現を組み合わせることで、様々な組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主によって発現されるＡＰＬＥ活性にかなりの増大がもたらされる。
ＡＰＬＥの機能発現は、ｔｒｘＢおよびｇｏｒ遺伝子双方の破壊によって引き起こされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中の完全な非還元性環境を絶対的に必要としなかった。活性ＡＰＬＥの発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（完全な還元性環境！）中、およびその中で遺伝子ｔｒｘＢまたはｇｏｒの１つのみが不活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中において可能である。
最適ＡＰＬＥ遺伝子であるＣ８Ｐの遺伝子構造が使用されて、様々なエステラーゼイソ型が構築され、単純で規模が拡大縮小できる工業的大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵工程中におけるそれらの高レベル生成を可能にする。
Ａ．ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを基質として使用した、ＡＰＬＥまたはγ−ＰＬＥ発現カセットで形質転換されたＰ．パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３株のプレートアッセイ。Ｂ．（２Ｓ，４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを基質として使用した、ＡＰＬＥまたはγ−ＰＬＥ発現カセットで形質転換されたＰ．パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ３３株のプレートアッセイ。 Ａ．発現プラスミドｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐの機能マップ。Ｂ．発現プラスミドｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐの機能マップ。 ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを基質として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ株の無細胞抽出物をＡＰＬＥ原料として使用したプレートアッセイ。 Ａ：ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを基質として使用したプレートアッセイ。シャペロンをコードするプラスミドｐＴｆ１２の存在下における１．０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｅ］２．０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｅ］３．０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｅ］シャペロンをコードするプラスミドｐＴｆ１２の存在下における４．０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］３．０．１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］Ｂ．ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを基質として使用したプレートアッセイ。左側にはホールセル懸濁液の２μｌのサンプルをプレートに塗布し、各サンプルの右側には１μｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）を添加して、最も効率的な加水分解をハイライトした。英数字で番号付けされたドットは、次の意味を有する。Ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）非形質転換株Ｂ．４℃で１ヶ月間保存された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］Ｃ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］Ｄ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐ］Ｅ．技術的ＰＬＥ（市販のブタ肝臓エステラーゼ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） Ａ．クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ１＝技術的ＰＬＥ２＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）非形質転換株３＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］４＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐ］５＝ＰａｇｅＲｕｌｅｒ着色タンパク質標準Ｂ．ＰＬＥに対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット１＝技術的ＰＬＥ２＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）非形質転換株３＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ］４＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐ］ メチルコハク酸ジメチルを基質として使用した様々なエステラーゼ遺伝子コンストラクトの定性的プレートアッセイ（γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥの双方がこの基質に対して反応性である）１＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿γ−ＰＬＥ］（天然γ−ＰＬＥ）２＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ］（天然ＡＰＬＥ）３＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ａ］（ＡＰＬＥ Ｃ８Ａ遺伝子）４＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８ＣｐＯ］（ＡＰＬＥ Ｃ８ＣｐＯ遺伝子）５＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ｐ］（ＡＰＬＥ Ｃ８Ｐ遺伝子）６＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ｅ２］（ＡＰＬＥ Ｃ８Ｅ２遺伝子）７＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿γ−ＰＬＥ−Ｃ８Ｐ］（γ−ＰＬＥ Ｃ８Ａ遺伝子）８＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ−Ｃ８Ｅ］（ＡＰＬＥ Ｃ８Ｅ遺伝子）９＝大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ［ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＢｏｓＴａｕｒｕｓ］（ウシγ−ＰＬＥ様遺伝子）１０＝負の対照
［実施例］
［実施例１］
［ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成；代替えブタ肝臓エステラーゼ（ＡＰＬＥ）同定］
地元の屠殺場から得た０．７ｇの新鮮なブタ肝臓を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒を使用して均質化した。米国カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ））からのファストトラック（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ）（登録商標）２．０ ｍＲＮＡ単離キットを使用して、製造業者の使用説明書に従ってホモジェネートからｍＲＮＡを抽出した。抽出プロトコルから１３μｇのｍＲＮＡが生じた。米国カールズバッドのインビトロジェンからのＲＴ−ＰＣＲ用スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＴＭＩＩＩ ファーストストランド合成システム（Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、製造業者の使用説明書に従ったｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして０．２６μｇのｍＲＮＡを使用した。
マツシマらによって述べられている遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ６３３２３；配列番号１）と関係しているブタ肝臓エステラーゼ／アミダーゼ配列を増幅するようにデザインされた、特異的プライマーｆｗ−ＰＬＥおよびｒｖ−ＰＬＥを使用したＰＣＲ反応におけるテンプレートとして、得られたｃＤＮＡを使用した。クローニング目的のために、


にＥｃｏＲＩ制限部位（Ｉｔａｌｉｃｓ）を導入した。既知のブタ肝臓エステラーゼ／アミダーゼ配列と相同的な配列に下線を引いた。
フィンランド国エスポー（Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）のＦｉｎｎｚｙｍｅｓからの１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、テンプレートとして５００ｎｇのｃＤＮＡ、各２０μｍｏｌの順方向および逆方向プライマーを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼマニュアル（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）に従って増幅を実施した。ＰＣＲ条件：９８℃で３０秒間の変性と、それに続く増幅のための３０サイクル（９８℃で１０秒間、６８℃で２０秒間、７２℃で１分間）、および全長増幅産物を確実にする７２℃で８分間の最終インキュベーション。
得られた１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をドイツ国ヒルデンのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からのＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して浄化し、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して消化し、米国カールズバッドのインビトロジェンからのプラスミドベクターｐＨＩＬＺおよびｐＨＩＬ−Ｄ２中に挿入し、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。
無作為に選択された形質転換体からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決定からは、２つの異なるＤＮＡ断片が明らかにされ、その１つはマツシマらによって述べられている遺伝子と完全に同じであり、それはまた後にＢｏｅｔｔｃｈｅｒらによってγ−ＰＬＥをコードする遺伝子と同定された。第２の断片は配列番号５のヌクレオチド配列を有し、成熟タンパク質配列の５４８個のアミノ酸の内２１個がγ−ＰＬＥとは異なるタンパク質（ＡＰＬＥ；配列番号６）をコードした。
［実施例２］
［ＡＰＬＥの機能発現およびＡＰＬＥ活性の特性決定］
米国カールズバッドのインビトロジェンからのベクターｐＰＩＣＺα中に存在するα−接合因子分泌シグナル配列との融合によって、γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥ遺伝子の双方をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）中での分泌発現に適応させた。
α−接合因子分泌シグナル配列およびγ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥ遺伝子を最初に別々に増幅した。
プライマー、


を使用したＰＣＲ１：α−接合因子分泌シグナル配列。
プライマー、


を使用したＰＣＲ２（γ−ＰＬＥ）およびＰＣＲ３（ＡＰＬＥ）。
クローニングのためのＥｃｏＲＩ制限部位をイタリックで表す一方、テンプレートと相同的な配列に下線を引いた。
全反応のＰＣＲ条件：２ｎｇのテンプレートＤＮＡ、各０．５μＭのプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、および１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ−ポリメラーゼが入った５０μｌの反応混合物、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼマニュアル（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）に準拠、８５℃で３分間の変性、３０サイクル（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１５秒間）中の増幅、および７２℃で７分間の最終インキュベーション。
α−接合因子分泌シグナル増幅（ＰＣＲ１）のためのテンプレートはプラスミドｐＰＩＣＺαであり、γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥ遺伝子増幅のためのテンプレート（それぞれＰＣＲ２およびＰＣＲ３）は、実施例１で述べられているｐＨＩＬＺベクター中のｃＤＮＡであった。
引き続いて、得られた別々の断片をα−接合因子断片と各ブタ肝臓エステラーゼ遺伝子間の融合反応中で、次のように組み合わせた：α−接合因子断片（ＰＣＲ１）＋γ−ＰＬＥ断片（ＰＣＲ２）；α−接合因子断片（ＰＣＲ１）＋ＡＰＬＥ断片（ＰＣＲ３）。
それぞれＰＣＲ１およびＰＣＲ２またはＰＣＲ３から各３μｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、および１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ−ポリメラーゼが入った総容積４５μｌ中で反応を開始させた。９５℃で３分間と、それに続いて９５℃で３０秒間および７２℃で４５秒間を１０サイクル。引き続いてプライマーｆｗ−αおよびｒｖ−ＰＬＥを０．５μＭの最終濃度に添加して、９５℃で３分間の変性、３０サイクル（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１５秒間）中での増幅、および７２℃で７分間の最終インキュベーションによって全長産物増幅を達成した。
得られた断片をドイツ国ヒルデンのキアゲンからのＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、米国カールズバッドのインビトロジェンからのベクターｐＧＡＰＺＡ中に挿入されたＥｃｏＲＩでの消化後にプラスミドｐＧＡＰＺＡ＿γ−ＰＬＥおよびｐＧＡＰＺＡ＿ＡＰＬＥを得た。
プラスミドｐＧＡＰＺＡ＿γ−ＰＬＥおよびｐＧＡＰＺＡ＿ＡＰＬＥのＤＮＡは、米国カールズバッドのインビトロジェンからのピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キットマニュアルに従って直線化し、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３に導入した。形質転換体は１００ｍｇ／ｌのゼオシンを含有するＹＰＤ−寒天上で選択された。
ｐＧＡＰＺＡ＿γ−ＰＬＥおよびｐＧＡＰＺＡ＿ＡＰＬＥを保有するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体を１００ｍｇ／ｌセオジンを添加したＹＰＤ寒天上に画線培養して、３０℃で４８時間成育させた。次に細胞物質を英国マディソンのワットマン・インターナショナル（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ））からのワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）グレード５４１無灰硬質７０ｍｍ径濾紙に載せて乾燥させた。次に濾紙をシグマ（Ｓｉｇｍａ）からの６ｍｇのα−ナフチル酢酸（５００μｌのアセトンに溶解させた）、シグマからの２．５ｍｇのファストブルーＢＮ塩（Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ Ｓａｌｔ ＢＮ）（１２５μｌの水に溶解させた）、および５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の混合物に浸してインキュベートし、着色産物をもたらすα−ナフチル酢酸の加水分解によってエステラーゼ活性を可視化した。γ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥ発現カセットで形質転換された全てのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、非形質転換ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３親株と比較するとエステラーゼ活性の増大を示した。
一般エステラーゼアッセイについて述べられているのと類似した構成を開発して、５−ハロゲン−２−アルキルペント−４−エン酸エステルに対するγ−ＰＬＥおよびＡＰＬＥの活性を判定した。ここでは濾紙を１４ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．０）、オーストリア国リンツのＤＳＭ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ａｕｓｔｒｉａ Ｎｆｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ ＫＧからの１０％（ｖ／ｖ）ラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステル、日本国東京の花王からの１％（ｖ／ｖ）エマルゲン（Ｅｍｕｌｇｅｎ）９１３洗剤、２ｍｇ／ｍｌのフェノールレッドからなるアッセイ混合物に浸した。酵素活性は、（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルの加水分解および付随する酸性基の遊離によって引き起こされる、赤色（塩基性および中性ｐＨ）から黄色（酸性ｐＨ）への変色によって表示された。
図１Ａに示すように、ＡＰＬＥのみが陽性シグナルを与え、この酵素がラセミ（４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを加水分解できることが示唆され、γ−ＰＬＥはこの基質を検出可能な程度には加水分解しなかった。より重要なことには、ＡＰＬＥ酵素は（２Ｒ，４Ｅ）−５−クロロ−２−イソプロピルペント−４−エン酸メチルエステルを選択的に加水分解すると結論できる。基質のＳ−鏡像異性体のみが濾紙に塗布されたプレートアッセイでは、Ｓ−形態の加水分解は検出できなかった（図１Ｂ）。
［実施例３］
［合成ＡＰＬＥ遺伝子のデザイン］
ＡＰＬＥをコードする遺伝子（配列番号５）に由来する成熟ＡＰＬＥ（配列番号６）のアミノ酸配列に基づいて、コドン使用頻度の改変があり天然の分泌シグナル配列を欠く合成遺伝子をデザインして、化学的に合成した（供給元：米国メンロパークのＤＮＡ２．０）。合成ＡＰＬＥ遺伝子変異型Ｃ８Ｐ（配列番号１１）、Ｃ８Ａ（配列番号１３）、Ｃ８ＣｐＯ（配列番号１４）、およびＣ８Ｅ（配列番号１５）は全て、必要とされる翻訳開始コドンとして追加的Ｎ−末端メチオニンがある成熟ＡＰＬＥタンパク質をコードする（配列番号１２）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現研究のために、プラスミドｐＭＳ４７０中に合成ＡＰＬＥ遺伝子を挿入した（Ｂａｌｚｅｒら（１９９２）［８］）。ＰＣＲ増幅（条件については実施例１を参照されたい）を使用して、以下のプライマーを使用してＮｄｅＩ制限部位（ＡＴＧ開始コドンを含む）を５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’末端にそれぞれ付加した。
遺伝子ＡＰＬＥ Ｃ８Ｐのためには、以下のＰＣＲプライマーがデザインされた。


遺伝子ＡＰＬＥ Ｃ８Ａのためには、以下のＰＣＲプライマーがデザインされた。


遺伝子ＡＰＬＥＣ８ＣｐＯのためには、以下のＰＣＲプライマーがデザインされた。


遺伝子ＡＰＬＥＣ８Ｅのためには、以下のＰＣＲプライマーがデザインされた。


クローニングのためのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は斜体で表し、遺伝子テンプレートと相同的な配列には下線を引いた。
得られた断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＭＳ４７０中に挿入し、プラスミドｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐ、ｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ａ、ｐＭＳ４７０＿Ｃ８ＣｐＯ、およびｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｅを作り出した。プラスミドｐＭＳ４７０＿Ｃ８Ｐのマップを図２Ａに示す。
ＡＰＬＥおよびγ−ＰＬＥの天然配列は、実施例１で述べられているようにしてブタ肝臓からｃＤＮＡとして得た。以下のプライマーを使用してこれらの天然遺伝子を増幅し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターに導入した。


クローニングのためのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は斜体で表し、遺伝子テンプレートと相同的な配列には下線を引いた。
これらの天然遺伝子は内部ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するので、二段階ライゲーションが必要であり、最初にＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩがあるより長い断片をｐＭＳ４７０中に挿入し、引き続いて３’ＨｉｎｄＩＩＩ断片を付加することで各遺伝子を完成させ、最終発現ベクターｐＭＳ４７０＿γ−ＰＬＥおよびｐＭＳ４７０＿ＡＰＬＥをそれぞれ得た。
［実施例４］
［ＡＰＬＥ発現ベクターの適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主への形質転換：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中におけるＡＰＬＥの機能発現］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのエステラーゼ発現を分析するため、活性分析用細胞の培養および調製のために以下の手順を使用した。
プレートアッセイでは、１００μｇ／ｍｌ ｌ アンピシリンおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＬＢ−寒天プレート上に、様々な発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を画線培養して３７℃で１６時間インキュベートした。
液体培養アッセイのため、それぞれの発現プラスミドを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロスに接種して、絶え間なく振盪しながら２８℃で１６時間インキュベートした。次にこの培養物を使用し、１Ｌ邪魔板付き振盪フラスコ内で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２５０ｍｌのＬＢブロスに接種した。培養物が６００ｎｍで０．６〜０．８の光学濃度に達したら、０．１ｍＭの最終濃度にＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。２８℃で１６〜２０時間のインキュベーション後に細胞を収集した。
プレートアッセイ：寒天プレート上で成育させた細胞のアッセイについては、様々なエステラーゼ基質を用いて実施例２で述べられている。
液体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の活性分析：５ｍＭのｐ−ニトロフェニル酢酸を基質として用いて、ＭＯＰＳ緩衝液（１００ｍＭ）中の細胞懸濁液のエステラーゼ活性を定量的に判定した。放出されたｐ−ニトロフェノールの量を分光光度法によって４０５ｎｍで判定した。１単位（Ｕ）のエステラーゼ活性は、試験条件（ｐＨ７．５、３７℃）下で１分あたり１ミクロモルのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量と定義される。
異なるＡＰＬＥをコードする遺伝子のための発現カセットを様々な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１株のような普通遺伝子発現株、および正確な折りたたみと酵素活性のために分子内ジスルフィド結合を要するタンパク質の機能性細胞内発現を可能にする特異的に改変された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（Ｐｒｉｎｚら、Ｂｅｓｓｅｔｔｅら）の双方を発現宿主株として使用した。この目的で、特に、ノバジェンから市販されるオリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）ファミリーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である、オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）１、オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）２、およびオリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂを使用した。
ＡＰＬＥ（配列番号１２）の機能発現が標準発現株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（図３）中で観察されたが、活性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株の使用によって得られた活性をはるかに下回った。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）株をそれぞれの発現ベクターで形質転換し、選択された形質転換体を引き続いて、基質特異的アッセイプレート上への播種または振盪フラスコ培養のどちらかによって、エステラーゼ発現について評価した。
いくつかのＡＰＬＥ遺伝子変異型の発現レベルを図４Ａおよび表１に要約する。遺伝子Ｃ８Ｅは天然ＰＬＥ遺伝子と比較してマイナーな変化のみを有する。図４ＡはＣ８ＥおよびＣ８Ｐの発現の差をそれ自体として、およびシャペロンｐＴｆ１６の存在下で示す。プレートでの結果は、表１に示す振盪フラスコでの結果によって確認される。

一連の実験を実施して、様々な熱ショックシャペロンの同時発現がＡＰＬＥ発現に貢献するかどうかを評価した。結果（表２に要約される）は、熱ショックタンパク質／シャペロン発現がＡＰＬＥ生成に顕著に影響しないことを示す。

［実施例５］
［ＤｓｂＣの添加を通じたＡＰＬＥ発現の増大］
同時発現される熱ショックタンパク質の影響が観察されないということで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内在性ジスルフィド−イソメラーゼ遺伝子ｄｓｂＣの過剰発現（Ｂｅｓｓｅｔｔｅら）のようなその他の補助因子が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中におけるＡＰＬＥ発現に影響するかどうかを調査した。
フィンランド国エスポーのＦｉｎｎｚｙｍｅｓからのＰｈｕｓｉｏｎＴＭＨｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ−緩衝液および以下の条件を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ’染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｓｂＣ遺伝子の切断型を増幅した（天然ＤｓｂＣタンパク質はぺリプラズムに分泌され、切断型ＤｓｂＣタンパク質は細胞内区画に留まった）。９５℃で５分間の変性、３０サイクル（９８℃で１０秒間、６６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）中での増幅、および７２℃で８分間の最終インキュベーション。使用されたプライマーは、切断型ＤｓｂＣコード配列の前にシャイン・ダルガノ配列を含むようにデザインされた。

ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ＡＰＬＥ発現プラスミドｐＭＳ４７０＿Ｃ８ＰのＢａｍＨＩ制限部位中に挿入した。ＤｓｂＣおよびＣ８Ｐは、４９ｂｐによって隔てられる。コンストラクトを配列決定により確認した。コンストラクトはｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐと命名され、ＡＰＬＥの発現を大幅に改善した（プレートアッセイについては図４および表３を参照されたい）。プラスミドｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿Ｃ８Ｐの機能マップは図２Ｂに示される。

観察されたエステラーゼ活性が、ＡＰＬＥをコードする遺伝子の機能発現に実際に起因することを確認するために、ウエスタンブロット実験を実施した。発酵後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を５．０００ｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを４容積の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、２〜２．５μｌの細胞懸濁液を１７．５〜１８μｌのＳＤＳ装入緩衝液と合わせ、９５℃で１０〜１５分間加熱した１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ＡＰＬＥは、英国ケンブリッジのａｂｃａｍからの抗ブタ肝臓エステラーゼーウサギポリクローナル抗体を一次抗体として、米国セントルイスのＬｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．からのアルカリホスファターゼに抱合されたヤギ−抗ウサギポリクローナル抗体を二次抗体として使用して、ウエスタンブロット分析によって検出された。ウエスタンブロット検出は、Ｇ：Ｂｏｘ ＨＲ（英国ケンブリッジのＳｙｎｇｅｎｅ）中のＬｕｍｉ−ＰｈｏｓＴＭＷＢ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＡＰ）（米国ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）および化学発光検出によって、または米国ラホーヤのＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭからのＢＣＩＰ／ＮＢＴ検出溶液およびスウェーデン国ウプサラからのアマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））からのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬＴＭ）の直接染色によって行われた。
図５はクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図５Ａ）およびウエスタンブロット実験の結果（図５Ｂ）を示し、タンパク質発現レベルが活性の差に対応することが示唆される。図５Ａはまた、切断型ＤｓｂＣが非常に良好に発現されることも示す。
［実施例６］
［新しい大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株の調製およびこれらの宿主のＡＰＬＥ産生特性の分析］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１６０８）から出発して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＲＶ３０８ ΔｔｒｘＢ；Δｇｏｒを構築した。Ｐｒｉｎｚらによって述べられているのと同様に、細胞内ジスルフィド還元に関与する２つの遺伝子を不活性化した。それぞれチオレドキシン還元酵素およびグルタチオンオキシド還元酵素をコードするこれらの２つの遺伝子ｔｒｘＢおよびｇｏｒは、Ｄａｔｓｅｎｋｏら（２０００）［９］で述べられている手順に従って、部位特異的遺伝子組み換えを使用した欠失を通じて不活性化された。
この改変の最初の結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が還元剤の存在下を除いてもはや好気的に成長できないことであるが、還元剤不在下における好気性成長を復元するサプレッサー突然変異は容易に選択される。これらの特性および表現型変化については異なるアプローチを使用して、その中で遺伝子ｔｒｘＢおよびｇｏｒが不活性化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で、以前に述べられている。
詳細：欠失カセットは、以下のプライマーおよびプラスミドｐＫＤ３をテンプレートとして使用してＰＣＲによって得られた。
この反応への


の適用は、遺伝子ｔｒｘＢの欠失カセットをもたらす。
この反応への


の適用は、遺伝子ｇｏｒの欠失カセットをもたらす。
プラスミドｐＫＤ４６を既に含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３０８株にｔｒｘＢおよびｇｏｒ欠失カセットを別々に形質転換し、抗生物質クロラムフェニコールに対するそれらの獲得抵抗性に基づいて、成功した形質転換体を選択した。ｔｒｘＢ遺伝子またはｇｏｒ遺伝子のそれぞれの欠失カセットによる正確な交換は、ＰＣＲ対照およびサザンブロット法によって確認された。引き続いてＦＬＰリコンビナーゼ酵素をコードするプラスミドｐＣＰ２０での形質転換によって、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を除去した［参考文献６］。ＰＣＲおよびサザンブロット法を使用して、得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＶ３０８ ΔｔｒｘＢをｔｒｘＢの完全欠失について再度チェックした。同様に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＶ３０８中のｇｏｒ遺伝子の完全欠失を確認した。
株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＶ３０８ ΔｔｒｘＢから出発して、全く同じセットの反応を実行して、遺伝子ｇｏｒの完全欠失を実施した。この２回目の修正の最初の結果は、Ｐｒｉｎｚらによって述べられているように、ｔｒｘＢおよびｇｏｒの双方を欠失しているこの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＶ３０８株が還元剤の存在下を除いてもはや好気的に成長できないことであるので、ｇｏｒ欠失も有すると想定される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の成育は還元剤ＤＴＴの存在下で行った。最後に、好気性成長のためにＤＴＴの存在にもはや依存しない自発性ＲＶ３０８ΔｔｒｘＢ；Δｇｏｒ突然変異体を選択できた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＲＶ３０８ ΔｔｒｘＢ；Δｇｏｒおよび単一還元酵素欠失のみによる間性株の形質転換を選択されたＡＰＬＥ発現プラスミドによって形質転換し、ＡＰＬＥ産生について振盪フラスコ内で評価した（表４）。

［実施例７］
ブタ肝臓エステラーゼタンパク質の様々な天然のイソ型をコードする追加的合成遺伝子を化学的に合成した。新しいエステラーゼタンパク質生成のために、ウシγ−ＰＬＥ様遺伝子を合成した。
既知のＰＬＥエステラーゼｓγ−ＰＬＥおよびＰＩＣＥをコードするその他の新しい遺伝子；またＡＰＬＥとγ−ＰＬＥイソ型の間のハイブリッドがデザインされた。後者のセットの一般的な特徴は、全てがＡＰＬＥＣ８Ｐテンプレートをベースとすることである。ＡＰＬＥ Ｃ８Ｐから出発して、イソ型またはハイブリッドタンパク質を得るために必要なコドンのみが変更された。
遺伝子はそれらがコードするタンパク質と共に、次によって表される。天然イソ型：新規仮説的ウシγ−ＰＬＥ様遺伝子（配列番号３２）、Ｃ８Ｐがコードする天然エステラーゼ：Ｃ８Ｐ−γ−ＰＬＥ（配列番号３４）およびＣ８Ｐ−ＰＩＣＥ（配列番号３６）。Ｃ８Ｐがコードするハイブリッドエステラーゼ：Ｃ８Ｐ−Ｈ１（配列番号３８）、Ｃ８Ｐ−Ｈ２（配列番号４０）、Ｃ８Ｐ−Ｈ３（配列番号４２）、およびＣ８Ｐ−Ｈ４（配列番号４４）。
全ての配列を図２Ｂ（ｐＭＳ４７０＿ｄｓｂＣ＿ＡＰＬＥ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター中に挿入して、Ｃ８Ｐ遺伝子を効果的に置き換えた。
メチルコハク酸ジメチルを基質として使用した定性的プレートアッセイ（実施例２参照）の結果、デザインされた各遺伝子が活性エステラーゼをコードすることが確認される（図６）。しかしメチルコハク酸ジメチルに対する酵素変異型の比活性は未知であるため、このプレートアッセイから定量的な結論づけはできない。
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Claims (7)

  1. エステラーゼ活性があるタンパク質を調製する方法であって、そのようなタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株中で発現するステップを含んでなり、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号１１のポリヌクレオチドと、少なくとも９０％の同一性を有して、配列番号１２と、少なくとも９８％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられ、発現がプラスミドからのＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳの同時発現なしに起きる、方法。
  2. 遺伝子が、配列番号１２と少なくとも９９％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
  3. エステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であって、前記組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、エステラーゼ活性があるタンパク質をコードする遺伝子を含有し、前記遺伝子が、配列番号１１のポリヌクレオチドと、少なくとも９０％の同一性を有して、配列番号１２と、少なくとも９８％の同一性を有するタンパク質をコードすることで特徴づけられ、発現がプラスミドからのＧｒｏＥＬおよび／またはＧｒｏＥＳの同時発現なしに起きる、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
  4. グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素を発現できないことで特徴づけられる、請求項３に記載のエステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
  5. グルタチオン還元酵素およびチオレドキシン還元酵素の双方を発現できないことで特徴づけられる、請求項３に記載のエステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
  6. グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素発現が突然変異によって消滅されることで特徴づけられる、請求項３に記載のエステラーゼ活性があるタンパク質の調製に適した組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
  7. 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）１、オリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）２またはオリガミ（Ｏｒｉｇａｍｉ）Ｂ株から得られる、請求項３〜６のいずれか一項に記載の組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株。
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