KR102405289B1 - 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102405289B1
KR102405289B1 KR1020210187761A KR20210187761A KR102405289B1 KR 102405289 B1 KR102405289 B1 KR 102405289B1 KR 1020210187761 A KR1020210187761 A KR 1020210187761A KR 20210187761 A KR20210187761 A KR 20210187761A KR 102405289 B1 KR102405289 B1 KR 102405289B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
thr
ala
cys
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020210187761A
Other languages
English (en)
Inventor
박철
왕은선
리홍선
이미경
손아름
임수진
Original Assignee
아미코젠주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아미코젠주식회사 filed Critical 아미코젠주식회사
Priority to KR1020210187761A priority Critical patent/KR102405289B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102405289B1 publication Critical patent/KR102405289B1/ko
Priority to US18/056,385 priority patent/US20230265409A1/en
Priority to EP22211393.8A priority patent/EP4202044A3/en
Priority to CN202211567142.7A priority patent/CN115851687A/zh
Priority to JP2022196731A priority patent/JP2023095798A/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01011—Penicillin amidase (3.5.1.11), i.e. penicillin-amidohydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01093—Glutaryl-7-aminocephalosporanic-acid acylase (3.5.1.93)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

세팔로스포린 C(CPC) 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 점 돌연변이 도입에 의하여 개선된 효소 활성 및/또는 안정성을 가지는 변이 CPC 아실라제 및 이의 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 제조를 위한 용도가 제공된다.

Description

세팔로스포린 C 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도{POLYPEPTIDE HAVING CEPHALOSPORIN C ACYLASE ACTIVITY AND USE THEREOF}
본 출원은 세팔로스포린 C(CPC) 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 점 돌연변이 도입에 의하여 개선된 효소 활성 및/또는 안정성을 가지는 변이 CPC 아실라제 및 이의 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
세팔로스포린 C(Cephalosporin C, 이하 "CPC")는, 베타-락탐(beta-lactam)계 항생물질로서, 사상균 곰팡이인 아크레모니움 크리소제눔(Acremonium chrysogenum)과 같은 일부 미생물에 의해서 생산된다. CPC는 그람음성 세균에 대해 세포벽 합성저해를 통해 항생활성을 나타내지만, 그 정도가 매우 미약하기 때문에, 주로 반합성 세팔로스포린계 항생제(semi-synthetic cephalosporin antibiotics, 이하 "세파계 항생제")의 원료물질을 제조하는데 이용되고 있다. 특히, CPC로부터 아미노아디포일 곁가지(D-alpha-aminoadipoyl side chain)가 제거된 7-아미노세팔로스포란산(7-aminocephalosporanic acid, 이하 "7-ACA")이 전세계 항생제 시장의 40% 이상을 점유하는 대부분의 세파계 항생제의 원료물질로 사용되고 있다.
기존의 CPC로부터 7-ACA를 제조하는 공법으로서, 화학공법과 효소공법이 있다. 화학공법은 반응조건이 복잡하고, 환경 처리 비용이 많이 들기 때문에, 최근에는 환경친화적인 효소공법으로 7-ACA를 생산하는 추세이다.
통상적인 효소공법은 다음의 2단계로 구성된다: 제1단계에서는 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase, 이하 "DAO")의 효소반응에 의해 CPC를 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid, 이하 "Gl-7-ACA")으로 전환시키고, 제2단계에서는 Gl-7-ACA 아실라제 효소반응에 의해 Gl-7-ACA를 7-ACA로 전환시킨다 (도 1의 왼쪽 반응식 참조).
그러나, 상기와 같은 2단계 효소공법은, 제1단계 효소반응에서 생성된 과산화수소가 기질(CPC), 반응생성물(Gl-7-ACA) 및 DAO를 공격하기 때문에 생산 수율이 낮는 문제가 있다.
이러한 문제의 해결 수단으로서, 제1단계를 거치지 않고, CPC로부터 직접 7-ACA를 제조하는 1단계 효소공법이 제안되며(도 1의 오른쪽 반응식 참조), 이를 위하여 CPC로부터 직접 7-ACA를 제조할 수 있는 CPC 아실라제의 사용이 필요하다. CPC 아실라제는 자연계에 존재하지 않기 때문에, 자연계에 존재하는 여러 종류의 Gl-7-ACA 아실라제(글루타릴 아미다제; (GA)라고도 함)를 개량하여 제조한는데, Gl-7-ACA 아실라제는 CPC에 대한 활성이 매우 약하다는 문제가 있다.
이에, CPC에 대하여 우수한 효소 활성을 가지는 CPC 아실라제의 개발이 필요하다.
대한민국 등록특허 제10-1728906호
본 출원에서는 세팔로스포린 C(Cephalosporin C, 이하 "CPC")에 대하여 개선된 효소 활성을 가지는 CPC 아실라제 및 이의 용도가 제공된다.
일 예는, 알파-서브유닛 및 베타-서브유닛을 포함하는 CPC 아실라제에 있어서,
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α);
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α);
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β);
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β); 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 아미노산의 원래와 다른 아미노산으로 치환에 의하여 변이된, 변이 CPC 아실라제를 제공한다.
일 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 A11α의 아스파라긴(N)으로 치환 (A11αN);
(ii-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 G24α의 아스파르트산(D)으로 치환 (G24αD);
(iii-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 A136β의 트레오닌(T)으로 치환 (A136βT);
(iv-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 I179β의 티로신(Y)으로 치환 (I179βY); 및
(v-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT).
다른 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 앞서 설명한 아미노산 치환에 더하여, 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 예컨대, 5개)의 치환에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다:
서열번호 4의 베타-서브유닛의,
(vi) 45번째 아미노산 잔기인 이소류신(I45ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vi-1) I45ßV;
(vii) 58번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F58ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vii-1) F58ßV;
(viii) 153번째 아미노산 잔기인 티로신(Y153ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (viii-1) Y153ßT;
(ix) 177번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F177ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ix-1) F177ßL; 및
(x) 382번째 아미노산 잔기인 발린(V382ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (x-1) V382ßL.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 핵산 서열 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염의 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염의 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 이용한, 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염의 생산 방법을 제공한다. 상기 생산 방법은 CPC로부터 직접 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염을 생산하는 1단계 방법일 수 있다.
본 출원에서는 세팔로스포린 C(Cephalosporin C, 이하 "CPC")에 대하여 개선된 효소 활성을 가지는 CPC 아실라제 및 이의 용도가 제공된다.
용어의 정의
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자 또는 핵산 분자"와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질 또는 효소"와 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 (필수적으로) 이루어진다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표시된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이를 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 또는 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 (필수적으로) 이루어진다 또는 표시된다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가
(i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하거나, 또는
(ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성(identity)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 목적하는 기능은, CPC 아실라제 효소 기능 (예컨대, CPC의 가수분해 활성 및/또는 CPC로부터 7-ACA 생산능) (아미노산 서열의 경우), 또는 상기와 같은 CPC 아실라제 효소 기능을 가지는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "서열 상동성(sequence identity)"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993) 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990) 등을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
본 명세서에서, "단백질(효소)의 아미노산 서열 내의 특정 위치의 아미노산 잔기"는 상기 아미노산 서열 내의 특정 위치의 아미노산 잔기 또는 상기 단백질과 동일한 효소 활성을 가지는 동종 유래의 이소타입 단백질 및/또는 이종 유래 단백질에서 상기 특정 위치와 대응되는 위치의 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단백질의 아미노산 서열 중, N-말단 1번째 잔기가 메티오닌(M)인 경우, 상기 메티오닌은 자연적 상태에서 포함되어 있는 것이거나 재조합 과정에서 생성된 것일 수 있다. 또한, 단백질의 아미노산 서열 중, N-말단 1번째 잔기가 메티오닌이 아닌 경우, 상기 단백질이 재조합적으로 생산되는 경우, 상기 1번째 잔기의 N말단에 메티오닌이 추가될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "약(about)"은 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하기 위한 표현으로, 뒤에 나오는 수치를 기준으로, ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1, ±0.05, 또는 ±0.01 범위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
변이 CPC 아실라제
본 출원은 개선된 효소 활성을 가지는 변이 CPC 아실라제를 제공한다. 상기 변이 CPC 아실라제는 기존의 Gl-7-ACA 아실라제가 CPC 아실라제 활성을 가지도록 개량한 것일 수 있다.
Gl-7-ACA 아실라제는 통상적인 2단계 효소공법(도 1의 왼쪽 반응식 참조)에 사용되는 Gl-7-ACA 아실라제는 여러 토양 미생물에서 발견되는데, 이들은 아래의 표 1(Gl-7-ACA 아실라제의 분류)과 같이 5개의 그룹으로 분류할 수 있다(Sonawane, Crit. Rev. Biotech. 26: 95-120, 2006):
Figure 112021150271845-pat00001
표 1에서의 분류를 기준으로, 같은 그룹 내에 속할 경우에는 단백질 크기, 아미노산 서열, 기질특이성, 반응성 등의 특성이 매우 유사하지만, 다른 그룹에 속하는 단백질 간에는 매우 상이한 특성을 가진다.
Group III에 속하는 Gl-7-ACA 아실라제들은 반응산물인 7-ACA 및 무기염류에 의해 쉽게 활성이 저해되고, 효소의 반응 안정성이 낮은 단점이 있는데, Group III의 Gl-7-ACA 아실라제를 개량할 경우, 상기 단점을 그대로 갖게 된다. 반면, Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제들은 Group III 효소들의 단점을 가지지 않기 때문에, Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제를 개량하여, 7-ACA 생산을 위한 1단계 효소공법(도 1의 오른쪽 반응식 참조)에 적용 가능한 변이 효소의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
대부분의 Gl-7-ACA 아실라제는 알파-서브유닛, 스페이서 펩티드(Spacer Peptide) 및 베타-서브유닛의 순으로 구성된다. 본 발명에서 사용한 기본 유전자(ga 유전자)는 전사 및 번역과
정을 거치면 약 77 kDa 크기의 불활성 단일사슬로 이루어진 폴리펩티드를 생성한다. 그 후, 스페이서 펩티드가
떨어져 나가면서, 약 18 kDa 크기의 알파-서브유닛(서열번호 3) 및 58kDa 크기의 베타-서브유닛(서열번호 4)로
구성된 이량체 형태를 갖게 된다.
이에, 본 출원의 변이 CPC 아실라제는 Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제를 기반으로 개량된 것일 수 있다. 상기 Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제는 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) 균주, 예컨대, Pseudomonas sp. GK16 균주 유래의 Gl-7-ACA 아실라제일 수 있다.
상기 Pseudomonas sp. GK16 균주 유래의 야생형 Gl-7-ACA 아실라제(서열번호 1)는, 예컨대 서열번호 2의 핵산 분자로부터 암호화 되는 것일 수 있고, N-말단부터 순서대로, 알파-서브유닛 (예컨대, 서열번호 3), 스페이서 펩티드 (예컨대, 서열번호 5), 및 베타-서브유닛 (예컨대, 서열번호 4)를 포함하는 형태의 약 77 kDa 크기의 불활성 단일사슬로 생성된 후, 스페이서 펩티드가 떨어져 나가면서 약 18 kDa 크기의 알파-서브유닛(서열번호 3) 및 58kDa 크기의 베타-서브유닛(서열번호 4)을 포함하는 이량체 형태 것일 수 있다. 이 때, 상기 알파-서브유닛 및/또는 베타-서브유닛에 하나 이상의 점 돌연변이가 도입됨으로써, CPC 아실라제 활성을 가지는 변이체가 제공될 수 있다.
일 예는, 알파-서브유닛 및 베타-서브유닛을 포함하는 CPC 아실라제에 있어서,
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α);
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α);
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β);
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β); 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 아미노산의 원래와 다른 아미노산으로 치환에 의하여 변이된, 변이 CPC 아실라제를 제공한다.
다른 예는, 본 출원의 변이 CPC 아실라제는, 알파-서브유닛 및 베타-서브유닛을 포함하는 CPC 아실라제에 있어서,
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α);
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α);
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β); 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 아미노산의 원래와 다른 아미노산으로 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다.
상기 다른 아미노산은 알라닌(A, Ala), 아스파라진(N, Asn), 트레오닌(T, Thr), 글루탐산(E, Glu), 세린(S, Ser), 발린(V, Val), 이소류신(I, Ile), 류신(L, Leu), 아스파르트산(D, Asp), 시스테인(C, Cys), 글루타민(Q, Gln), 메티오닌(M, Met), 페닐알라닌(F, Phe), 프롤린(P, Pro), 트립토판(W, Trp), 티로신(Y, Tyr), 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His), 라이신(K, Lys), 및 글리신(G, Gly)으로 이루어진 군에서 선택되고, 원래의 아미노산과 다른 아미노산일 수 있다.
일 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 A11α의 아스파라긴(N)으로 치환 (A11αN);
(ii-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 G24α의 아스파르트산(D)으로 치환 (G24αD);
(iii-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 A136β의 트레오닌(T)으로 치환 (A136βT);
(iv-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 I179β의 티로신(Y)으로 치환 (I179βY); 및
(v-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT).
일 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 A11α의 아스파라긴(N)으로 치환 (A11αN);
(ii-1) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 G24α의 아스파르트산(D)으로 치환 (G24αD);
(iii-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 A136β의 트레오닌(T)으로 치환 (A136βT); 및
(iv-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 I179β의 티로신(Y)으로 치환 (I179βY).
다른 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는,
앞서 설명한 아미노산 치환 (i) 내지 (iv) (예컨대, 아미노산 치환 (i-1), (ii-1), (iii-1), 및 (iv-1))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 또는 4개)의 치환에 더하여,
다음의 치환에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다:
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환;
예컨대, (v-1) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT).
다른 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 앞서 설명한 아미노산 치환 (i) 내지 (v) (예컨대, 아미노산 치환 (i-1), (ii-1), (iii-1), (iv-1), 및 (v-1))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 치환에 더하여, 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 예컨대, 5개)의 치환에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다:
서열번호 4의 베타-서브유닛의,
(vi) 45번째 아미노산 잔기인 이소류신(I45ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vi-1) I45ßV;
(vii) 58번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F58ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vii-1) F58ßV;
(viii) 153번째 아미노산 잔기인 티로신(Y153ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (viii-1) Y153ßT;
(ix) 177번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F177ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ix-1) F177ßL; 및
(x) 382번째 아미노산 잔기인 발린(V382ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (x-1) V382ßL.
아미노산 치환 (vi) 내지 (x) (예컨대, 아미노산 치환 (vi-1), (vii-1), (viii-1), (ix-1), 및 (x-1))에 의하여 변이된 변이 CPC 아실라제도 CPC 아실라제 활성을 가지지만, 앞서 설명한 아미노산 치환 (i) 내지 (v) (예컨대, 아미노산 치환 (i-1), (ii-1), (iii-1), (iv-1), 및 (v-1))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)에 의한 변이에 의하여 추가로 변이된 경우에, 보다 개선된 CPC 아실라제 활성 및/또는 열 안정성을 가진다.
제1 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN.
제2 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD.
제3 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT.
제4 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제5 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제6 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN; 및
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD.
제7 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN; 및
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT.
제8 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제9 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제10 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT.
제11 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제12 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제13 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제14 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제15 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제16 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT.
제17 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제18 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제19 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제20 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제21 다른 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제22 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제23 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제24 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제25 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY.
제26 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제27 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제28 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제29 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
제30 구체예에서, 상기 변이 CPC 아실라제는, 다음의 치환에 의하여 변이된 것일 수 있다:
(i) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (i-1) A11αN;
(ii) 서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ii-1) G24αD;
(iii) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iii-1) A136βT;
(iv) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (iv-1) I179βY; 및
(v) 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (v-1) H453βT.
다른 예에서, 상기 제1 구체예 내지 제28 구체예의 변이 CPC 아실라제는 각각 다음 중 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개, 예컨대, 5개)의 치환에 의하여 추가로 변이된 것일 수 있다:
서열번호 4의 베타-서브유닛의,
(vi) 45번째 아미노산 잔기인 이소류신(I45ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vi-1) I45ßV;
(vii) 58번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F58ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (vii-1) F58ßV;
(viii) 153번째 아미노산 잔기인 티로신(Y153ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (viii-1) Y153ßT;
(ix) 177번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F177ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (ix-1) F177ßL; 및
(x) 382번째 아미노산 잔기인 발린(V382ß)의 다른 아미노산으로 치환, 예컨대, (x-1) V382ßL.
본 출원에서 제공되는 변이 CPC 아실라제는, 앞서 설명한 아미노산 치환 (i) 내지 (v) (예컨대, 아미노산 치환 (i-1), (ii-1), (iii-1), (iv-1), 및 (v-1))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)에 의하여 변이되지 않은 CPC 아실라제와 비교하여, CPC에 대한 효소 활성 (아실라제 활성), 열 안정성, 또는 이들 모두가 개선된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 출원에서 제공되는 변이 CPC 아실라제는,
아미노산 치환 (vi) 내지 (x) (예컨대, 아미노산 치환 (vi-1), (vii-1), (viii-1), (ix-1), 및 (x-1))에 의하여 변이된(아미노산 치환 (i) 내지 (v) (예컨대, 아미노산 치환 (i-1), (ii-1), (iii-1), (iv-1), 및 (v-1))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하지 않음), 변이 CPC 아실라제와 비교하여,
CPC에 대한 효소 활성이 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 4.5배 이상, 약 5배 이상, 약 5.5배 이상, 약 6배 이상, 약 6.5배 이상, 약 7배 이상, 약 7.5배 이상, 약 8배 이상, 약 8.5배 이상, 약 9배 이상, 약 9.5배 이상, 약 10배 이상, 약 10.5배 이상, 약 11배 이상, 약 11.5배 이상, 약 12배 이상, 약 12.5배 이상, 약 13배 이상, 약 13.5배 이상, 약 14배 이상, 약 14.5배 이상, 또는 약 15배 이상 (상한값은 특별한 한정이 없으며, 예컨대, 약 100배, 약 90배, 약 80배, 약 70배, 약 60배, 약 50배, 약 40배, 약 30배, 또는 약 25배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)이거나, 및/또는
열 안정성이 1.05배 이상, 약 1.08배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.8배 이상, 약 2배 이상 또는 약 2.3배 이상 (상한값은 특별한 한정이 없으며, 예컨대, 약 10배, 약 9배, 약 8배, 약 7배, 약 6배, 약 5배, 약 4배, 약 3.5배, 또는 약 3배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님)일 수 있다.
이 때, 상기 CPC에 대한 효소 활성은 CPC에 대한 아실라제 활성을 의미하는 것일 수 있고, 예컨대, 효소의 활성을 나타내는 1단위(Unit)는 분당 CPC로부터 1umole의 7-ACA를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의될 수 있다. 예컨대, 상기 CPC에 대한 아실라제 활성은 효소를 세포 분해용액(1.25mg/mL 라이소자임(lysozyme), 1.25 mM EDTA, 0.375%(w/v) Triton X-100)과 함께 25℃에서 2시간 동안 방치 및 10℃에서 1시간 동안 방치 후 10℃에서 16~18시간 동안 CPC 기질과 반응시의 CPC로부터 7-ACA 생산능을 의미할 수 있고, 상기 열 안정성은, 고온(약 40℃ 이상, 예컨대, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 또는 약 60℃)에서의 CPC로부터 7-ACA 생산능, 예컨대, 효소를 세포 분해용액(1.25mg/mL 라이소자임(lysozyme), 1.25 mM EDTA, 0.375%(w/v) Triton X-100)과 함께 25℃에서 2시간 동안 방치 및 55℃에서 1시간 30분 동안 방치 후 10℃에서 16~18시간 동안 CPC 기질과 반응시의 CPC로부터 7-ACA 생산능을 의미할 수 있다 (실시예 4, 표 3 참조).
일 예에서, 본 출원에서 제공되는 변이 CPC 아실라제는 비자연적으로 발생(non-naturally occurring)하는 것일 수 있으며, 예컨대, 재조합적 방법 또는 화학적 합성에 의하여 생산되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
핵산 분자, 재조합 발현 벡터, 재조합 세포
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 변이 CPC 아실라제 전장 서열을 암호화하는 것이거나, 상기 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자 및 베타-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자의 조합일 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 적절한 숙주세포에서 상기 핵산 분자를 단백질로 발현킬 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 상기 변이 CPC 아실라제의 전장 서열을 암호화 하는 핵산 분자(예컨대, 알파-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자 및 베타-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 내에 포함)를 포함하거나, 상기 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 제1 재조합 벡터 및 베타-서브유닛을 암호화하는 핵산 분자를 암호화하는 제2 재조합 벡터의 조합일 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 적절한 숙주세포에 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 벡터가 도입된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 재조합 세포는 상기 핵산 분자가 대장균, 예컨대, Escherichia coli MC1061 균주에 도입된 Escherichia coli MC1061-pBC-TEP11 균주 (기탁번호: KCTC 14821BP)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여, 상기의 변이 CPC 아실라제를 제조할 수 있다.
일 예에서, 상기 변이 CPC 아실라제의 전장 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여 상기 변이 CPC 아실라제를 제조할 수 있다. 다른 예에서 상기 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포와 상기 변이 CPC 아실라제의 베타-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 각각 적당한 배지와 조건에서 배양하여 각각의 변이 CPC 아실라제 서브유닛 단백질을 제조한 후, 시험관 내에서 (in vitro) 두 서브유닛 단백질을 혼합하여 상기 변이 CPC 아실라제를 제조할 수 있다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 목적산물 제조를 위해서 그대로 사용하거나 또는 정제하여 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 CPC 아실라제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 수행될 수 있다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose binding domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 CPC 아실라제를 정제하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 유리 상태가 아닌 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조가 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈(agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메타크릴레이트(polymethacylate), 유퍼짓 C(Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카(silica), 벤토나이트(bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로인캡슐레이션(microencapsulation) 등에 의해 변이 CPC 아실라제를 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 CPC 아실라제를 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 변이 CPC 아실라제를 따로 정제할 필요가 없이 변이 CPC 아실라제를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 CPC 아실라제의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 변이 CPC 아실라제를 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
상기 핵산 분자 또는 벡터의 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 표적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산 분자가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산 분자는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되거나 및/또는 염색체 외에 위치할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 핵산 분자는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 핵산 분자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 그 자체의 형태로 숙주세포의 유전체에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(외래 단백질)을 암호화하는 핵산 분자의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 핵산 분자가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 핵산 분자를 숙주 세포에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 세포에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법, 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication) 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 도입 (삽입)은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system 또는 CRISPR system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP)), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 숙주 세포의 유전체와 무관하게 발현되거나, 숙주 세포의 유전체 내에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBC계(예, pBC-KS(+)), pBR계(예, pBR322, pBR325), pUC계(예, pUC118 및 pUC119), pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pET계(예, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(예, pUB110, pTP5), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(예, pUB110, pTP5), 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스 유래 플라스미드, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 유래 플라스미드 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주세포는 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia 속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물 및 효모 등의 진핵세포 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것일수 있으며, 예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속 미생물 (예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum), Escherichia 속 미생물 (예컨대, Escherichia coli 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 핵산 분자의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 핵산 분자의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합 또는 CRISPR 시스템에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid)의 생산
본 출원의 다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 서열 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염의 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 7-ACA 또는 이의 염의 생산에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 이용한, 7-ACA 또는 이의 염의 생산 방법을 제공한다.
다른 예는 앞서 설명한 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 핵산 분자 및/또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 상기 재조합 세포의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 다음의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염과 접촉하는 단계를 포함하는, 다음의 화학식 2의 화합물 또는 이의 염의 생산 방법을 제공한다:
<화학식 1>
Figure 112021150271845-pat00002
<화학식 2>
Figure 112021150271845-pat00003
(상기 화학식 1 및 2에서, R은 아세톡시(-OCOCH3), 하이드록시(-OH), 또는 수소(-H)임.)
상기 염은 약학적으로 허용 가능한 모든 형태의 염일 수 있으며, 예컨대, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 CPC 기질 화합물이고, 화학식 2의 화합물은 7-ACA 화합물일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 화학식 2의 화합물 또는 이의 염의 생산 방법, 예컨대, 7-ACA 화합물 또는 이의 염의 생산 방법은 CPC로부터 직접 7-ACA 또는 이의 염을 생산하는 1단계 방법일 수 있다.
예컨대, 상기 방법은 CPC에 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase)를 처리하는 단계를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 D-아미노산 산화효소 처리에 의한 효소반응에 의하여 CPC가 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid, 이하 "Gl-7-ACA")으로 전환되는 과정에서 발생한 과산화수소가 기질(CPC), 반응생성물(Gl-7-ACA) 및 D-아미노산 산화효소를 공격하여 생산 효율을 저하시키는 문제가 있다. 반면, 본 출원에서 제공되는 방법은 CPC에 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase)를 처리하는 단계를 포함하지 않고, CPC로부터 직접 7-ACA 또는 이의 염을 생산함으로써, 이러한 문제를 해결할 수 있다.
상기 재조합 세포는 변이 CPC 아실라제 생산 균주이다.
상기 변이 CPC 아실라제 생산 균주의 배양물 (예, 액상, 반고상, 또는 고상 배양물, 농축물 또는 건조물 형태의 배양물 등) 또는 변이 CPC 아실라제 함유 조성물의 형태로, 또는 분리된 효소를 유리 상태 또는 고정화시킨 상태로 상기 화학식 1의 화합물과 접촉하여 상기 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있다. 상기 변이 CPC 아실라제와 상기 화학식 1의 화합물과의 접촉은 물 또는 수용액 (예, 완충용액) 상에서 수행될 수 있다. 이 때, 화학식 1의 화합물 농도는 1~500 mM 범위, 상기 변이 CPC 아실라제의 첨가량은 0.1~100 U/mL 범위서, 반응혼합액의 pH는 pH 7~10 범위, 반응시간은 0.1~24시간 범위, 반응온도는 4~40℃ 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 효소반응을 통해서 생성된 화학식 2의 화합물은 통상의 방법에 의해 반응액으로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다.
또한, 생체 내 (in vivo)에서 상기 변이 CPC 아실라제와 상기 화학식 1의 접촉을 통해 상기 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물의 생합성 능력을 가지고 있는 대장균, 아크레모니움 크리소제놈 같은 균주에 상기 변이 CPC 아실라제 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유도체가 삽입된 재조합 발현벡터를 도입하고, 상기 형질전환체를 적당한 배지와 조건에서 배양하면, 상기 형질전환체 내에서 생합성된 화학식 1의 화합물과 상기 변이 CPC 아실라제의 자연스러운 접촉을 통하여 화학식 2의 화합물이 제조될 수 있다.
세파계 항생제 원료물질인 7-ACA를 생산하기 위한 변이효소가 제공된다. 보다 상세하게는 돌연변이를 통해 세팔로스포린 C에 대한 효소 활성 및/또는 온도 안정성이 증가한 변이 세팔로스포린 C 아실라제 및 이를 이용한 7-ACA 제조방법을 제공함으로써, 기존의 변이 CPC 아실라제 (PM2) 보다 CPC 기질에 대한 효소 활성이 약 5배 이상, 예를 들어, 약 5배 내지 약 21배 증대시키고, 온도 안정성을 약 2.5배 증대시킬 수 있다. 또한, 본 출원의 기술은 1단계 공정으로 효과적으로 CPC에서 직접적으로 7-ACA를 제조할 수 있다는 이점을 가진다.
도 1은 CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 1단계 효소공정법과 2단계 효소공정법을 모식적으로 보여준다.
도 2는 일 실시예에 따른 변이 CPC 아실라제의 제조과정을 도식화한 것이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: CPC 아실라제 돌연변이체의 제조 및 활성 측정
1-1. pBC-PM2 플라스미드의 제조
CPC 아실라제 활성이 증가된 변이 CPC 아실라제 개발을 위하여, 슈도모나스 속 GK16 계열 균주(Matsuda et. al., J. Bacteriol. 163: 1222-1228, 1985) 유래의 글루타릴 아미다제(Glutaryl amidase, GA)의 변이체(서열번호 6; N-말단부터 순서대로, 상기 GK16 균주 글루타릴 아미다제(GA)의 야생형 알파-서브유닛(서열번호 3), 스페이서 (서열번호 5), 및 베타-서브유닛(서열번호 4)의 5중 돌연변이체(I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL; 서열번호 8)가 펩티드 결합으로 연결된 단일사슬 폴리펩티드; 이하‘PM2 변이체’)를 코딩하는 유전자(이하 ‘pm 유전자’; 서열번호 7)를 기본 유전자로 사용하였다 (대한민국 특허공개 제10-2014-0094150호 참조; 이 문헌의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함됨).
상기 pm 유전자는, 전구체(precursor) 형태로서 서열번호 3의 야생형 알파-서브유닛과 변이형 서열번호 8의 베타-서브유닛이 서열번호 5의 스페이서를 통하여 펩티드 결합으로 연결된 단일사슬 폴리펩티드(서열번호 6)로서 발현되며, 그 후 세포 내에서 자기 촉매적 프로세싱(autocatalytic processing)을 통해 상기 알파 서브유닛과 베타 서브유닛으로 구성된 성숙형(mature)의 활성 이량체 형태를 갖게 된다. 서열번호 7의 pm 유전자를 pBC-KS(+) 벡터(Stratagene사, 미국)의 XbaI과 NotI 제한효소 인식부위에 삽입하여 상기 PM2 변이체를 발현하기 위한 pBC-PM2 플라스미드를 제작하였다. 구체적인 제조방법은 다음과 같다.
상기 pm 유전자 DNA 산물(약 2.1 kb 크기)을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후, 정제 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit; QIAGEN사, 독일)로 정제하여, 삽입 DNA를 준비하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터(Stratagene사, 미국) DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기 준비된 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 12~16시간 동안 접합(ligation) 시킨 후, 접합액을 이용하여 전기천공법(electrophoration)으로 E. coli MC1061 균주에 형질전환시켰다. 상기 균주를 20μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치 배양하여 형질전환체들을 선별하였다. 선별된 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 확인하고, 서열번호 7의 염기서열을 갖는 pm 유전자를 포함하는 pBC-PM2 플라스미드를 최종 수득하였다. 상기 pBC-PM2 플라스미드는 베타-서브유닛의 5중 변이체(I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL)를 포함하는 PM2 변이체 단백질을 발현한다.
1-2. 효소액 제조
상기 실시예 1-1에서 수득된 pBC-PM2 플라스미드 함유 재조합 대장균 형질전환체에 의한 CPC(Cephalosporin C) 아실라제의 생산성을 측정하기 위해서, CPC 아실라제 조효소액을 다음과 같이 제조하였다: 상기 대장균 형질전환체를 각각 20μg/mL 클로람페니콜이 함유된 3mL의 LB배지 (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후, 30℃ 및 200rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 배양액 350μL를 20μg/mL 클로람페니콜이 함유된 35mL의 새로운 LB 배지에 접종한 후, 25℃ 및 200rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리(4℃, 8000rpm, 10분)하여 균체를 회수한 후, 0.1M potassium phosphate(pH 8.0) 완충용액으로 1회 세척하였다. 이 균체를 35mL의 동일 완충용액에 현탁한 후, 4℃에서 초음파 파쇄기(Vibra Cell VC750, Sonics & Materials Inc, 미국)로 10분 동안 파쇄하고, 4℃ 및 13,500rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 변이 CPC 아실라제 조효소액을 준비하였다. 이하, 실시예에서, CPC 아실라제 활성 및 온도 안정성은 각 균주로부터 상기 방법을 참조하여 얻어진 효소액을 사용하여 측정하였다.
1.3. CPC 아실라제의 활성 측정
상기 실시예 1.2에서 준비한 CPC 아실라제의 활성 정도를 측정하기 위하여, Park 등의 방법 (Park 등, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 559-564, 1995)을 변형하여 다음과 같이 실시하였다.
CPC 기질 (순도 90%; Hayao사, 중국)을 0.1M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 40 mM 농도로 녹여 기질용액을 제조하였다. 이 CPC 기질용액 20 uL에 상기 실시예 1.2에서 준비한 효소액 20uL(microliter)를 첨가하여 37℃에서 효소반응을 5분간 반응시킨 후, 50mM NaOH-20%(w/v) 빙아세트산 (glacial acetic acid) (1:2, NaOH : 빙초산, 부피기준) 용액 200uL을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 13000rpm에서 5분간 원심분리를 수행하여 회수한 상등액 200uL에 메탄올에 용해시킨 0.5%(w/v) PDAB(p-dimethylaminobenzaldehyde; Sigma, 미국) 40uL를 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 415nm 파장에서 흡광도를 측정하고 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 1 단위(unit)는 CPC 기질로부터 분당 1umole(micromole)의 7-ACA(7-aminocephalosporanic acid)를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 한편, CPC 기질에 대한 비활성은 효소액 중의 단백질 양을 브래드포드의 방법 (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976)에 따라 측정한 후에 1mg 단백질에 해당하는 활성 단위로 표시하였다.
상기의 방법으로 CPC 아실라제 활성을 측정한 결과, 실시예 1.1에서 준비된 재조합 E. coli MC1061(pBC-PM2) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 1300 단위/L이었다.
실시예 2: CPC 아실라제 활성이 높은 변이체의 제조 및 선별
2.1. 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 1차 변이체 라이브러리의 제조
CPC 아실라제 활성이 보다 증가된 변이 CPC 아실라제를 제조하기 위하여, 상기 실시예 1.1에 기재된 pm 유전자의 염기서열에 인위적으로 무작위 돌연변이를 유발하였다. 이를 위해, 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)을 수행하여 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 다음에 설명한 바와 같다.
구체적으로, 에러 유발성 중합효소 연쇄반응은 Diversity PCR Random Mutagenesis kit (Clontech사, 미국)를 사용하여 1,000bp당 1-2개의 돌연변이가 일어나도록 하였다. PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 1 ng/μL의 pBC-PM2 플라스미드(실시예 1.1)를 사용하고, T3 프라이머(서열번호 15) 10pmol, T7 프라이머(서열번호 16) 10pmol, dGTP 2mM, 50X Diversity dNTP mix, 10X TITANIUM Taq buffer, 및 TITANIUM Taq polymerase로 최종 부피 50 μL가 되도독 하여 수행하였다. PCR 반응조건은 다음과 같다: 상기 반응액을 95℃에서 2분 동안 전-변성 시키고, 95℃에서 30초 변성, 52℃에서 30초 어닐링 및 68℃에서 3분 동안 중합을 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 5분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 수행하여 약 2.1 kb 크기의 변이체 DNA 단편을 증폭하였다.
상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반을 통해 얻은 변이 유전자 즉, 2.1kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 정제 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit; QIAGEN사, 독일)를 사용하여 정제한 후, 삽입 DNA로 사용하였고, pBC-KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, 스웨덴)를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후, 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20μg/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치 배양함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.
상기 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 하기와 같은 방법으로 스크리닝하였다.
상기와 같이 추가 돌연변이가 유발된 변이 CPC 아실라제 유전자를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 160μL씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 30℃ 및 165rpm 조건으로 60~70시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후, 상기 96-웰 플레이트에서 20μL씩의 배양액을 취하여 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 105μL의 세포 분해용액(1.25mg/mL 라이소자임(lysozyme), 1.25 mM EDTA, 0.375%(w/v) Triton X-100)을 넣은 후 25℃에서 2시간 동안 방치하고, 10℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후에, 25 mM potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 50mM CPC를 녹여 제조한 기질용액 125μL를 첨가한 후 10℃에서 16~18시간 동안 CPC 기질의 가수분해 반응을 수행하였다. 가수분해 반응을 수행한 후 반응액 중의 상등액 40 μL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 반응 정지액 (acetic acid : 250mM NaOH, 2:1) 100μL를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후, 발색시약 (메탄올에 용해된 0.5%(w/v) PDAB 용액) 30uL를 첨가하고 실온에서 10분간 방치하였다. 그 후에 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 7-ACA의 생성을 확인할 수 있는 파장인 415nm에서의 흡광도를 측정함으로써 CPC 기질에 대한 활성이 증가된 변이체를 스크리닝하였다.
그 결과, 약 30,000종의 변이체 중에서 PM2 (I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 변이 포함) 대비, CPC 아실라제 활성이 증가한 4개 변이체 (EM5, EM9, EM17, EM42)를 선발하였다. 이들 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여, EM5 변이효소는 A11α(알파-서브유닛의 11번째 아미노산인 Ala) 잔기가 아스파라긴으로 치환(A11αN)되어 있었고, EM9 변이효소는 G24α 잔기가 아스파르트산으로 치환(A11αD)되어 있었다. 또한 EM17 변이효소는 A136β(베타-서브유닛의 136번째 아미노산인 Ala) 잔기가 트레오닌으로 치환(A136βT)되어 있었고, EM42 변이효소는 I179β 잔기가 티로신으로 치환(I179βY)되었음을 확인하였다.
2.2. 위치지정 돌연변이(DNA shuffling)에 의한 2차 변이체 라이브러리의 제조 - 개량 균주(CSH17) 선발
CPC 아실라제 활성을 더욱 증대시키기 위하여, 상기 실시예 2.1에서 에러 유발성 중합효소연쇄반응에서 얻은 개량균주의 활성을 바탕으로 4개의 아미노산 잔기(A11αN, G24αD, A136βT, I179βY)에 대한 위치지정 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.
구체적으로는, A11α, G24α 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위하여, PM2, EM5를 주형으로 하고 M13-R 프라이머(서열번호 17)와 SH24α-R 프라이머(서열번호 18)를 사용하여 PCR을 수행하여 약 240bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, G24α, A136β, I179β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 PM2, EM17를 주형으로 하고 SH24α-F 프라이머(서열번호 19)와 SH179β-R 프라이머(서열번호 20)를 사용하여 PCR을 수행하여 약 975bp 크기의 PCR 산물을 회수하였고, I179β 아미노산이 변이된 라이브러리를 제조하기 위해서 PM2를 주형으로 하고 SH179β-F 프라이머(서열번호 21)와 M13-F 프라이머(서열번호 22)를 사용하여 PCR을 수행하여 약 1,120bp 크기의 PCR 산물을 회수하였다.
PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머, pfu-x buffer, dNTPs mix, pfu-x polymerase로 최종 부피는 100 μL로 조정하여 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 2분 동안 전-변성시키고 변성을 95℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 5분 동안 후-중합시켰다.
상기 조건에서 얻은 약 240bp의 PCR산물, 약 975bp의 PCR산물, 및 약 1,120bp의 PCR산물을 혼합하고, 여기에 T3 프라이머(서열번호 15)와 T7 프라이머(서열번호 16)를 사용해 PCR을 수행하여, 약 2.1kb 크기의 다중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 약 2.1 kb의 PCR 산물을 실시예 2.1의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 위치지정 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.
상기 위치지정 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 활성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 실시예 2.1의 방법과 동일하게 탐색한 결과, PM2 대비 CPC 아실라제 활성이 증가한 4중 변이체(A11αN/G24αD/A136βT/I179βY)를 선발하여 CSH17으로 명명하였다. 상기 CSH17 변이효소(서열번호 9)는 서열번호 10의 알파 서브유닛과 서열번호 11의 베타 서브유닛을 포함한다.
실시예 3: 효소 안정성 증대를 위해 온도 안정성이 증가된 변이체의 제조 및 선별 - 에러 유발성 중합효소연쇄반응(error prone PCR)에 의한 3차 변이체 라이브러리의 제조-TEP11 개량 균주 선발
상기 실시예 2.2에서 제조된 CSH17 변이효소의 온도 안정성을 보다 증대시키기 위해서, CSH17(서열번호 9) 코딩 DNA를 주형 DNA로 사용하여 실시예 2.1의 방법과 동일하게 에러 유발성 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.
상기 돌연변이 라이브러리로부터 온도 안정성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 탐색하기 위하여, 열처리 조건만 제외하고, 실시예 2.1에 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. 보다 구체적으로, CSH17(서열번호 9) 코딩 DNA를 주형으로 하여 에러 유발성 중합효소 연쇄반응(실시예 2.1 참조)을 수행하여 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하고, 이와 같이 돌연변이가 유발된 변이 CPC 아실라제 유전자를 함유하는 E. coli MC1061 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 160 μL씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 30℃ 및 165rpm 조건에서 60~70시간 동안 진탕 배양하였다. 그 후 상기 96-웰 플레이트에서 20μL씩의 배양액을 취하여 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 105μL의 세포 분해용액(1.25mg/mL 라이소자임(lysozyme), 1.25 mM EDTA, 0.375%(w/v) Triton X-100)을 넣은 후, 25℃에서 2시간 동안 방치하고, 열처리를 위해 55℃에서 1시간 30분 동안 방치하였다. 그 후에 25 mM potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 50mM CPC를 녹여 제조한 기질용액 125μL를 첨가하여 10℃에서 16~18시간 동안 CPC 기질의 가수분해 반응을 수행하였다.
이와 같이 제작된 에러 유발성 돌연변이 라이브러리로부터 온도 안정성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 탐색한 결과, CSH17(A11αN/G24αD/A136βT/I179βY 4중 변이체) 대비 CPC 아실라제 활성이 증대되고, 온도 안정성이 현저히 증가한 변이체로서, CSH17 변이에 더하여, H453β 잔기가 트레오닌으로 변이(H453βT)가 추가된 균주를 선발하여 TEM11로 명명하였다. TEP11(서열전호 12)은 서열번호13의 알파 서브유닛과 서열번호 14의 베타 서브유닛을 포함한다.
이하, 상시 실시예 2 내지 실시예 3에 기재된 대표적인 각 변이체들의 CPC 아실라제 활성 및 온도 안정성을 평가하였다.
실시예 4: CPC 아실라제 변이체의 활성 및 온도 안정성 측정
상기 실시예 2 내지 실시예 3의 CPC 아실라제 변이체들의 효소 활성 및 온도 안정성을 각각 실시예 1.3 및 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다 (PM2 효소 활성 또는 온도 안정성을 1로 하고, 다른 변이 효소의 활성 또는 온도 안정성은 PM2 효소 활성에 대한 배수로 표현함):
변이 CPC 아실라제의 변이 잔기 및 CPC 아실라제 효소 활성 비교
변이효소 변이 잔기 CPC 기질에 대한 상대 활성 (배)
PM2 I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 1.0
EM5 A11αN/I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 6.3
EM9 G24αD/I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 4.5
EM17 I45ßV/F58ßV/A136ßT/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 5.2
EM42 I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/I179ßY/V382ßL 6.9
CSH17 A11αN/G24αD/I45ßV/F58ßV/A136ßT/Y153ßT/F177ßL/I179ßY/V382ßL 15.7
TEP11 A11αN/G24αD/I45ßV/F58ßV/A136ßT/Y153ßT
/F177ßL/I179ßY/V382ßL/H453ßT 		20.8
변이 CPC 아실라제의 변이 잔기 및 CPC 아실라제 온도 안정성 비교
변이효소 변이 잔기 온도 안정성에 대한 상대 활성 (배)
PM2 I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL 1.0
CSH17 A11αN/G24αD/I45ßV/F58ßV/A136ßT/Y153ßT
/F177ßL/I179ßY/V382ßL		 1.1
TEP11 A11αN/G24αD/I45ßV/F58ßV/A136ßT/Y153ßT
/F177ßL/I179ßY/V382ßL/H453ßT		 2.4
상기 변이 효소 중, 가장 좋은 활성과 온도 안정성을 나타낸 TEP11 변이 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 pBC-TEP11 플라스미드로 형질전환 된 E. coli MC1061 균주를 “Escherichia coli MC1061-pBC-TEP11”라 명명하였고, 2021년 12월 13일자로 대한민국 전라북도 정읍시에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호:KCTC 14821BP).
실시예 5: CPC 아실라제 변이체의 효소활성 및 온도 안정성 비교 (vs. 야생형 CPC 아실라제)
상기 실시예 2 내지 3에서 선발된 5종의 CPC 아실라제 변이 (A11αN, G24αD, A136βT, I179βY, H453βT)가 야생형 CPC 아실라제에 도입된 변이 효소의 효소 활성 및 온도 안정성을 시험하였다.
상기 5종의 CPC 아실라제 변이체(A11αN, G24αD, A136βT, I179βY, H453βT)가 각각 도입된 변이체는 부위지정 돌연변이 유발(Site-directed mutagenesis)을 통해 제작하였다.
보다 구체적으로, 상기 5종의 CPC 아실라제 변이체(A11αN, G24αD, A136βT, I179βY, H453βT)는 야생형 CPC 아실라제(서열번호 1)을 주형으로 하여 PCR을 수행하여 제작하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머를 하기 표 4에 정리하였다:
변이효소 변이 잔기 F 프라이머 R 프라이머
GA 야생형
SM7 I179ßY GTTCCGACCTTTAACTATGTTTATGCTGATCGTG(서열번호 23) CACGATCAGCATAAACATAGTTAAAGGTCGGAAC(서열번호 24)
SM10 G24αD GAAATCCTGTGGGATGACTATGGTGTTCCGCATATC(서열번호 25) GATATGCGGAACACCATAGTCATCCCACAGGATTTC(서열번호 26)
SM25 A136ßT CGTGCTGATGGTACCACCGTTGCTGTTCGTGTTG(서열번호 27) CAACACGAACAGCAACGGTGGTACCATCAGCACG(서열번호 28)
SM43 A11αN CCGCAGGCTCCGATCAATGCTTATAAACCGCGTAGC(서열번호 29) GCTACGCGGTTTATAAGCATTGATCGGAGCCTGCGG(서열번호 30)
SM52 　H453ßT GTGCGTACCCCGGTTACGGGTGAAACCTGGGTTGC(서열번호 31) GCAACCCAGGTTTCACCCGTAACCGGGGTACGCAC(서열번호 32)
PCR 반응액의 조성은 각각의 주형 DNA, 프라이머, pfu-x buffer, dNTPs mix, pfu-x polymerase로 최종 부피는 100 μL로 조정하여 수행하였다. PCR 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 2분 동안 전-변성시키고 변성을 95℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서 30초 및 중합을 68℃에서 3분 동안 수행하는 반응을 18회 반복한 후 68℃에서 5분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건에서 얻은 약 2.1kb의 PCR 산물을 실시예 2.1의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 부위지정 돌연변이(Site-directed mutagenesis) 균주를 제조하였다. 비교를 위하여, 야생형 CPC 아실라제(서열번호 1)가 E. coli MC1061 균주에 도입된 균주를 준비하였다.
상기 준비된 균주들에 대하여, 실시예 2.1 (효소 활성) 및 실시예 3 (온도 안정성; 다만, 40℃에서 30분간 방치한 효소액을 사용하여 측정함)의 방법을 참조하여, 상기 5종의 CPC 아실라제 변이체의 CPC 기질에 대한 효소 활성 및 온도 안정성을 측정하여, 야생형 (서열번호 1)과 비교하였다. 상기 얻어진 결과를 하기의 표 5에 나타내었다:
변이효소 변이 잔기 CPC 기질에 대한 상대 활성(배) 온도 안정성에 대한 상대 활성(배)
GA 야생형 1.00 1.00
SM7 I179ßY 6.20 1.05
SM10 G24αD 3.40 1.01
SM25 A136ßT 2.85 0.98
SM43 A11αN 4.70 1.07
SM52 　H453ßT 5.60 2.40
표 5에 나타난 바와 같이, 상기 5종의 CPC 아실라제 변이(A11αN, G24αD, A136βT, I179βY, H453βT)가 단독으로 도입되는 경우에도, 야생형(서열번호 1) 대비, CPC 기질에 대한 활성이 약 2.9배 내지 약 6.2배 증대되고, 온도 안정성은 동등 이상을 가지면서, 약 2.4배 이상 증대됨을 확인 할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC14821BP 20211213
<110> AMICOGEN, INC. <120> POLYPEPTIDE HAVING CEPHALOSPORIN C ASYLASE ACTIVITY AND USE THEREOF <130> DPP20214102KR <160> 32 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein (692 aa) of wild-type Gl-7-ACA acylase from Pseudomonas sp. GK16, comprising alpha- and beta-subunits and a spacer therebetween <400> 1 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala 35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp 65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg 115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg 130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu 195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro 210 215 220 Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu 275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly 290 295 300 Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala 340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys 355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp 370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro 420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser 435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met 450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser 500 505 510 Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln 515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys 530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn 580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe 595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly 610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu 660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe 675 680 685 Asn Phe Lys Pro 690 <210> 2 <211> 2079 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene (2079 bp) encoding the proten of SEQ ID NO: 1 <400> 2 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr 20 25 30 Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly 35 40 45 Cys Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys 50 55 60 Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly 65 70 75 80 Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala 115 120 125 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 130 135 140 Cys Gly Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala 145 150 155 160 Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala 165 170 175 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr 195 200 205 Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala 210 215 220 Ala Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly 245 250 255 Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala 260 265 270 Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly 275 280 285 Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys 290 295 300 Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys 325 330 335 Ala Ala Cys Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys 340 345 350 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr 355 360 365 Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr 370 375 380 Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala 385 390 395 400 Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr 405 410 415 Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly Thr 420 425 430 Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr 435 440 445 Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly 450 455 460 Thr Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys 485 490 495 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Gly 500 505 510 Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr 515 520 525 Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys Gly 530 535 540 Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr 545 550 555 560 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr 565 570 575 Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala 580 585 590 Cys Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala 595 600 605 Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly 610 615 620 Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly 625 630 635 640 Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Cys 645 650 655 Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly 660 665 670 Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr 675 680 685 Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly 690 695 700 Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr 705 710 715 720 Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly 725 730 735 Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Thr 740 745 750 Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr 755 760 765 Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly 770 775 780 Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Thr 785 790 795 800 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 805 810 815 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys 820 825 830 Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys 835 840 845 Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly 850 855 860 Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly 865 870 875 880 Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Thr 885 890 895 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr 900 905 910 Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys 915 920 925 Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala 930 935 940 Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly 945 950 955 960 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala 965 970 975 Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala Gly 980 985 990 Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala 995 1000 1005 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Thr Ala 1010 1015 1020 Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr 1025 1030 1035 1040 Thr Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr 1045 1050 1055 Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala 1060 1065 1070 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala 1075 1080 1085 Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Ala 1090 1095 1100 Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala 1105 1110 1115 1120 Thr Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly 1125 1130 1135 Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr 1140 1145 1150 Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr 1155 1160 1165 Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys 1170 1175 1180 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly 1185 1190 1195 1200 Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys 1205 1210 1215 Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala 1220 1225 1230 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly 1235 1240 1245 Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr 1250 1255 1260 Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Cys 1265 1270 1275 1280 Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly 1285 1290 1295 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Cys 1300 1305 1310 Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Gly Cys Cys Thr 1315 1320 1325 Gly Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 1330 1335 1340 Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly 1345 1350 1355 1360 Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys 1365 1370 1375 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly 1380 1385 1390 Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys 1395 1400 1405 Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys 1410 1415 1420 Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly 1425 1430 1435 1440 Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly 1445 1450 1455 Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala 1460 1465 1470 Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 1475 1480 1485 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1490 1495 1500 Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala 1505 1510 1515 1520 Ala Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Ala Gly Cys 1525 1530 1535 Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr 1540 1545 1550 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly 1555 1560 1565 Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly 1570 1575 1580 Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly 1585 1590 1595 1600 Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys 1605 1610 1615 Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala 1620 1625 1630 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr 1635 1640 1645 Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys 1650 1655 1660 Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr 1665 1670 1675 1680 Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala 1685 1690 1695 Thr Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Gly 1700 1705 1710 Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Thr Cys 1715 1720 1725 Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly 1730 1735 1740 Ala Thr Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr 1745 1750 1755 1760 Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys 1765 1770 1775 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly 1780 1785 1790 Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly 1795 1800 1805 Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr 1810 1815 1820 Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly 1825 1830 1835 1840 Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Gly 1845 1850 1855 Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr 1860 1865 1870 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala 1875 1880 1885 Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys 1890 1895 1900 Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr 1905 1910 1915 1920 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly 1925 1930 1935 Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys 1940 1945 1950 Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr 1955 1960 1965 Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Cys 1970 1975 1980 Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala 1985 1990 1995 2000 Thr Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly 2005 2010 2015 Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly 2020 2025 2030 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala 2035 2040 2045 Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Thr Thr 2050 2055 2060 Ala Ala Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala 2065 2070 2075 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-subunit (158 aa) of wild-type Gl-7-ACA acylase protein from Pseudomonas sp. GK16 <400> 3 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly 20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg 35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys 50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln 85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn 100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln 115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu 130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 4 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit (522 aa) of wild-type Gl-7-ACA acylase protein <400> 4 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu 420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val 435 440 445 Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser 450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val 500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro 515 520 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer (11 aa) <400> 5 Glu Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PM2 mutant (692 aa) comprising wild-type alpha-subunit of Gl-7-ACA asylase from GK16, and mutant beta-subunit, and a spacer therebetween <400> 6 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala 35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp 65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg 115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg 130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu 195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro 210 215 220 Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu 275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly 290 295 300 Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Leu Asn Ile Val Tyr Ala 340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys 355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp 370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro 420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser 435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met 450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser 500 505 510 Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln 515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys 530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn 580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe 595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly 610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu 660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe 675 680 685 Asn Phe Lys Pro 690 <210> 7 <211> 2079 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene (2079 bp) encoding PM2 mutant <400> 7 Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr 20 25 30 Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly 35 40 45 Cys Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys 50 55 60 Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly 65 70 75 80 Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala 115 120 125 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 130 135 140 Cys Gly Thr Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala 145 150 155 160 Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala 165 170 175 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr 195 200 205 Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Ala Cys Gly Ala 210 215 220 Ala Cys Ala Gly Ala Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly 245 250 255 Thr Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala 260 265 270 Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly 275 280 285 Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys 290 295 300 Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys 325 330 335 Ala Ala Cys Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys 340 345 350 Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr 355 360 365 Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Gly Thr 370 375 380 Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala 385 390 395 400 Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr 405 410 415 Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Gly Thr 420 425 430 Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr 435 440 445 Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly 450 455 460 Thr Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys 485 490 495 Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Ala Gly 500 505 510 Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Thr Thr 515 520 525 Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys Gly 530 535 540 Cys Thr Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr 545 550 555 560 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr 565 570 575 Cys Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Ala 580 585 590 Cys Cys Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala 595 600 605 Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Gly 610 615 620 Gly Thr Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly 625 630 635 640 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Cys 645 650 655 Cys Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly 660 665 670 Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Thr 675 680 685 Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly 690 695 700 Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Thr 705 710 715 720 Ala Ala Cys Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly 725 730 735 Cys Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Thr 740 745 750 Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly Thr 755 760 765 Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly 770 775 780 Gly Thr Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Thr 785 790 795 800 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 805 810 815 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys 820 825 830 Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys 835 840 845 Cys Gly Thr Thr Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly 850 855 860 Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly 865 870 875 880 Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Thr Thr 885 890 895 Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr 900 905 910 Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys 915 920 925 Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala 930 935 940 Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly 945 950 955 960 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala 965 970 975 Thr Gly Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Ala Gly 980 985 990 Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala 995 1000 1005 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Thr Ala 1010 1015 1020 Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr Thr 1025 1030 1035 1040 Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Thr 1045 1050 1055 Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala 1060 1065 1070 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala 1075 1080 1085 Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Ala Ala 1090 1095 1100 Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala 1105 1110 1115 1120 Thr Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Gly 1125 1130 1135 Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Ala Thr 1140 1145 1150 Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Thr 1155 1160 1165 Gly Gly Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys 1170 1175 1180 Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly 1185 1190 1195 1200 Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Cys 1205 1210 1215 Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Ala 1220 1225 1230 Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly 1235 1240 1245 Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Thr 1250 1255 1260 Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala Thr Ala Cys 1265 1270 1275 1280 Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Gly 1285 1290 1295 Ala Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Cys 1300 1305 1310 Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Thr Ala Gly Cys Cys Thr 1315 1320 1325 Gly Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys 1330 1335 1340 Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly 1345 1350 1355 1360 Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys 1365 1370 1375 Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly 1380 1385 1390 Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys 1395 1400 1405 Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys 1410 1415 1420 Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Gly 1425 1430 1435 1440 Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly 1445 1450 1455 Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala 1460 1465 1470 Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr 1475 1480 1485 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly 1490 1495 1500 Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala 1505 1510 1515 1520 Ala Thr Thr Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Ala Gly Cys 1525 1530 1535 Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr 1540 1545 1550 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly 1555 1560 1565 Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly 1570 1575 1580 Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly 1585 1590 1595 1600 Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys 1605 1610 1615 Gly Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala 1620 1625 1630 Cys Cys Gly Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr 1635 1640 1645 Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys 1650 1655 1660 Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Thr 1665 1670 1675 1680 Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala 1685 1690 1695 Thr Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Gly 1700 1705 1710 Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Thr Cys 1715 1720 1725 Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Gly Thr Gly 1730 1735 1740 Ala Thr Gly Cys Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr 1745 1750 1755 1760 Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Ala Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys 1765 1770 1775 Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly 1780 1785 1790 Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly 1795 1800 1805 Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr 1810 1815 1820 Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly 1825 1830 1835 1840 Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Cys Gly 1845 1850 1855 Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr 1860 1865 1870 Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Cys Thr Ala 1875 1880 1885 Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Cys 1890 1895 1900 Cys Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr 1905 1910 1915 1920 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly 1925 1930 1935 Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys 1940 1945 1950 Gly Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr 1955 1960 1965 Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Ala Cys 1970 1975 1980 Gly Thr Gly Thr Thr Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala 1985 1990 1995 2000 Thr Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly 2005 2010 2015 Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly 2020 2025 2030 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala 2035 2040 2045 Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Thr Thr 2050 2055 2060 Ala Ala Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala 2065 2070 2075 <210> 8 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of mutant PM2 protein <400> 8 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Leu Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu 420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val 435 440 445 Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser 450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val 500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro 515 520 <210> 9 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant CSH17 protein <400> 9 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Asn Ala Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Asp Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala 35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp 65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg 115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg 130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu 195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro 210 215 220 Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu 275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly 290 295 300 Thr Thr Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Leu Asn Tyr Val Tyr Ala 340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys 355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp 370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro 420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser 435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met 450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser 500 505 510 Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln 515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys 530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn 580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe 595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly 610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu 660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe 675 680 685 Asn Phe Lys Pro 690 <210> 10 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-subunit of mutant CSH17 protein <400> 10 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Asn Ala Tyr Lys Pro Arg 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Asp Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly 20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg 35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys 50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln 85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn 100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln 115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu 130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 11 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of mutant CSH17 protein <400> 11 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Thr Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Leu Asn Tyr Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu 420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val 435 440 445 Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser 450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val 500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro 515 520 <210> 12 <211> 692 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant TEP11 protein <400> 12 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Asn Ala Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Asp Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala 35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp 65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg 115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg 130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu 195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro 210 215 220 Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu 275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly 290 295 300 Thr Thr Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Leu Asn Tyr Val Tyr Ala 340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys 355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp 370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro 420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser 435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met 450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser 500 505 510 Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln 515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys 530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn 580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe 595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val Thr Gly 610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu 660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe 675 680 685 Asn Phe Lys Pro 690 <210> 13 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha-subunit of mutant TEP11 protein <400> 13 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Asn Ala Tyr Lys Pro Arg 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Asp Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly 20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg 35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys 50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln 85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn 100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln 115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu 130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 14 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of mutant TEP11 <400> 14 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Thr Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Leu Asn Tyr Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu 420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val 435 440 445 Arg Thr Pro Val Thr Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser 450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val 500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro 515 520 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 15 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 16 taatacgact cactataggg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-F primer <400> 17 ttgtaaaacg acggccagtg 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-R primer <400> 18 ggaaacagct atgaccatg 19 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH24a-F primer (non-opti) <400> 19 gaaatcctgt gggatgryta tggtgttccg 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH24a-R primer <400> 20 cggaacacca tarycatccc acaggatttc 30 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH179b-F primer <400> 21 gttccgaccc ttaacwwygt ttatgctgat cgt 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH179b-R primer <400> 22 acgatcagca taaacrwwgt taagggtcgg aac 33 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM7_F priemr <400> 23 gttccgacct ttaactatgt ttatgctgat cgtg 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM7_R priemr <400> 24 cacgatcagc ataaacatag ttaaaggtcg gaac 34 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM10_F priemr <400> 25 gaaatcctgt gggatgacta tggtgttccg catatc 36 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM10_R priemr <400> 26 gatatgcgga acaccatagt catcccacag gatttc 36 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM25_F priemr <400> 27 cgtgctgatg gtaccaccgt tgctgttcgt gttg 34 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM25_R priemr <400> 28 caacacgaac agcaacggtg gtaccatcag cacg 34 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM43_F priemr <400> 29 ccgcaggctc cgatcaatgc ttataaaccg cgtagc 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM43_R priemr <400> 30 gctacgcggt ttataagcat tgatcggagc ctgcgg 36 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM52_F priemr <400> 31 gtgcgtaccc cggttacggg tgaaacctgg gttgc 35 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SM52_R priemr <400> 32 gcaacccagg tttcacccgt aaccggggta cgcac 35

Claims (17)

  1. 알파-서브유닛 및 베타-서브유닛을 포함하는 세팔로스포린 C(cephalosporin C; CPC) 아실라제에 있어서,
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌(A11α)의 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 이소류신(I), 발린(V), 또는 류신(L)으로의 치환;
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로의 치환;
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로의 치환;
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로의 치환; 및
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로의 치환
    으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환에 의하여 변이된, 변이 CPC 아실라제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치환은 다음 중 선택된 하나 이상인, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 A11α의 아스파라긴(N)), 프롤린(P), 글루타민(Q), 이소류신(I), 발린(V), 또는 류신(L)으로 치환;
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 G24α의 아스파르트산(D)으로 치환 (G24αD);
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 A136β의 트레오닌(T)으로 치환 (A136βT);
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 I179β의 티로신(Y)으로 치환 (I179βY); 및
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT).
  3. 제1항에 있어서, 다음의 아미노산 치환에 의하여 변이된, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 11번째 아미노산 잔기인 알라닌 (A11α)의 아스파라긴(N)으로의 치환;
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 24번째 아미노산 잔기인 글리신(G24α)의 다른 아미노산으로의 치환;
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 136번째 아미노산 잔기인 알라닌(A136β)의 다른 아미노산으로의 치환; 및
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 179번째 아미노산 잔기인 이소류신(I179β)의 다른 아미노산으로의 치환.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환에 의하여 추가로 변이된, 변이 CPC 아실라제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 치환은 서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT)인, 변이 CPC 아실라제.
  6. 제2항에 있어서, 상기 치환은 다음을 모두 포함하는 것인, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 A11α의 아스파라긴(N)으로 치환 (A11αN);
    서열번호 3의 알파-서브유닛의 G24α의 아스파르트산(D)으로 치환 (G24αD);
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 A136β의 트레오닌(T)으로 치환 (A136βT); 및
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 I179β의 티로신(Y)으로 치환 (I179βY).
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 4의 베타-서브유닛의 453번째 아미노산 잔기인 히스티딘(H453β)의 다른 아미노산으로 치환에 의하여 추가로 변이된, 변이 CPC 아실라제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 치환은 서열번호 4의 베타-서브유닛의 H453β의 트레오닌(T)으로 치환(H453βT)인, 변이 CPC 아실라제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로 치환에 의하여 추가로 변이된, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 4의 베타-서브유닛의 45번째 아미노산 잔기인 이소류신(I45ß), 58번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F58ß), 153번째 아미노산 잔기인 티로신(Y153ß), 177번째 아미노산 잔기인 페닐알라닌(F177ß), 및 382번째 아미노산 잔기인 발린(V382ß)
  10. 제9항에 있어서, 상기 치환은 다음 중 선택된 하나 이상인, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 4의 베타-서브유닛에서,
    I45ß의 발린(V)으로 치환(I45ßV);
    F58ß의 발린(V)으로 치환(F58ßV);
    Y153ß의 트레오닌(T)으로 치환(Y153ßT);
    F177ß의 류신(L)으로 치환(F177ßL); 및
    V382ß의 류신(L)으로 치환(V382ßL).
  11. 제10항에 있어서, 상기 치환은 다음을 모두 포함하는 것인, 변이 CPC 아실라제:
    서열번호 4의 베타-서브유닛에서,
    I45ß의 발린(V)으로 치환(I45ßV);
    F58ß의 발린(V)으로 치환(F58ßV);
    Y153ß의 트레오닌(T)으로 치환(Y153ßT);
    F177ß의 류신(L)으로 치환(F177ßL); 및
    V382ß의 류신(L)으로 치환(V382ßL).
  12. 제10항에 있어서, 서열번호 9 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는, 변이 CPC 아실라제.
  13. (1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이 CPC 아실라제, 또는
    (2) 상기 (1)의 변이 CPC 아실라제에서, I45ßV, F58ßV, Y153ßT, F177ßL, 및 V382ßL로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환에 의하여 추가로 변이된 변이 CPC 아실라제
    를 암호화하는 핵산 분자.
  14. 제13항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제13항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포.
  16. (1) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이 CPC 아실라제;
    (2) 상기 (1)의 변이 CPC 아실라제에서, I45ßV, F58ßV, Y153ßT, F177ßL, 및 V382ßL로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환에 의하여 추가로 변이된 변이 CPC 아실라제;
    (3) 상기 (1)의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 재조합 세포;
    (4) 상기 (2)의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터; 및
    (5) 상기 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포 또는 이의 배양물
    로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 또는 이의 염의 생산용 조성물.
  17. 제16항의 조성물을 다음의 화학식 1의 화합물 또는 이의 염과 접촉하는 단계를 포함하는, 다음의 화학식 2의 화합물 또는 이의 염의 생산 방법:
    <화학식 1>
    Figure 112021150271845-pat00004

    <화학식 2>
    Figure 112021150271845-pat00005

    상기 화학식 1 및 2에서, R은 아세톡시(-OCOCH3), 하이드록시(-OH), 또는 수소(-H)임.
KR1020210187761A 2021-12-24 2021-12-24 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도 KR102405289B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210187761A KR102405289B1 (ko) 2021-12-24 2021-12-24 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도
US18/056,385 US20230265409A1 (en) 2021-12-24 2022-11-17 Polypeptide having cephalosporin c acylase activity and use thereof
EP22211393.8A EP4202044A3 (en) 2021-12-24 2022-12-05 Polypeptide having cephalosporin c acylase activity and use thereof
CN202211567142.7A CN115851687A (zh) 2021-12-24 2022-12-07 具有头孢菌素c酰基转移酶活性的多肽及其用途
JP2022196731A JP2023095798A (ja) 2021-12-24 2022-12-09 セファロスポリンｃアシラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210187761A KR102405289B1 (ko) 2021-12-24 2021-12-24 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102405289B1 true KR102405289B1 (ko) 2022-06-07

Family

ID=81987195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210187761A KR102405289B1 (ko) 2021-12-24 2021-12-24 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230265409A1 (ko)
EP (1) EP4202044A3 (ko)
JP (1) JP2023095798A (ko)
KR (1) KR102405289B1 (ko)
CN (1) CN115851687A (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050017832A (ko) * 2003-08-11 2005-02-23 아미코젠주식회사 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ제조방법
KR20050074313A (ko) * 2004-01-12 2005-07-18 안티비오티코스 에스.피.에이. 세팔로스포린 ｃ 아실라제
KR20100056123A (ko) * 2008-11-19 2010-05-27 (주)누리바이오텍 돌연변이 세팔로스포린 c 아실라아제
KR20140094150A (ko) * 2013-01-21 2014-07-30 아미코젠주식회사 세파계 항생제 원료물질(7-aca)을 생산하기 위한 변이효소

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07222587A (ja) * 1994-02-09 1995-08-22 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法
CN102925423B (zh) * 2012-11-16 2014-08-06 清华大学 一种突变头孢菌素c酰化酶
CN105543201B (zh) * 2016-02-23 2018-11-20 山西新宝源制药有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体
WO2018165881A1 (zh) * 2017-03-15 2018-09-20 上海星维生物技术有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
CN109913436B (zh) * 2017-12-12 2023-05-23 石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司 含有一个或几个点突变的头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法
CN111172142B (zh) * 2020-02-14 2021-09-28 上海陶宇晟生物技术有限责任公司 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050017832A (ko) * 2003-08-11 2005-02-23 아미코젠주식회사 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ제조방법
KR20050074313A (ko) * 2004-01-12 2005-07-18 안티비오티코스 에스.피.에이. 세팔로스포린 ｃ 아실라제
KR20100056123A (ko) * 2008-11-19 2010-05-27 (주)누리바이오텍 돌연변이 세팔로스포린 c 아실라아제
KR20140094150A (ko) * 2013-01-21 2014-07-30 아미코젠주식회사 세파계 항생제 원료물질(7-aca)을 생산하기 위한 변이효소
KR101728906B1 (ko) 2013-01-21 2017-04-20 아미코젠주식회사 세파계 항생제 원료물질(7-aca)을 생산하기 위한 변이효소

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl Environ Microbiol.,74(11):3400-3409(2008.4.) *
Appl Microbiol Biotechnol.,101(2):621-632(2017.1.) *
GenBank: RIJ68106.1(2018.9.19.)* *

Also Published As

Publication number Publication date
US20230265409A1 (en) 2023-08-24
CN115851687A (zh) 2023-03-28
EP4202044A2 (en) 2023-06-28
JP2023095798A (ja) 2023-07-06
EP4202044A3 (en) 2023-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101728906B1 (ko) 세파계 항생제 원료물질(7-aca)을 생산하기 위한 변이효소
AU718648B2 (en) Mutant penicillin G acylases
WO2017143945A1 (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体
WO2012169203A1 (ja) 改良型ニトリルヒドラターゼ
KR100530299B1 (ko) 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법
JP6690747B2 (ja) 改良型ニトリルヒドラターゼ
KR101985911B1 (ko) Achromobacter sp. CCM 4824 유래 페니실린 G 아실라제 변이체 및 이의 이용
CN1062903C (zh) 一种新的头孢菌素c酰基转移酶
WO2018165881A1 (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
CN110129305B (zh) 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体
KR102405289B1 (ko) 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도
RU2388826C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК G17ACA-АЦИЛАЗЫ С ХИТИН-СВЯЗЫВАЮЩИМ ДОМЕНОМ (BrdG17ACA-cbd), РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pSVH0108, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЕГО СИНТЕЗ В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-ПРОДУЦЕНТ BrdG17ACA-cbd
JP5283154B2 (ja) トリプシン様酵素
Chen et al. Cloning, expression and characterization of l-aspartate β-decarboxylase gene from Alcaligenes faecalis CCRC 11585
JPH09505732A (ja) 新規セファロスポリンｃアシラーゼ
KR101677755B1 (ko) 아목시실린 생산성이 증가된 변이 알파-아미노산 에스터 가수분해효소
KR102363768B1 (ko) 세파졸린 생산성이 증가된 페니실린 g 아실라제 변이체 및 이의 이용
CN111051506A (zh) 青霉素g酰化酶
KR100270508B1 (ko) 신규세파로스포린디아세틸라아제유전자및이를이용한단백질제조방법
JP2004524006A (ja) シュードモナス・ディミヌタｂｓ−２０３からのグルタリルセファロスポリンアミダーゼ
JPH08205864A (ja) 新規セファロスポリンｃアシラーゼおよびその製造方法
RU2310687C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pETTvDAO2, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ (DAO) ДРОЖЖЕЙ Trigonopsis variabilis В КЛЕТКАХ Escherichia coli И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli C41(DE3)/pETTvDAO2 - ПРОДУЦЕНТ DAO
JP2010207168A (ja) アスパラギナーゼ
KR20100056123A (ko) 돌연변이 세팔로스포린 c 아실라아제
JP2003230392A (ja) 耐熱性ラッカーゼ、その遺伝子およびその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant